論文：雜交鱧(斑鱧♀×烏鱧♂)潰瘍病病原菌的分離、鑒定及其防治中草藥的篩選

雜交鱧(斑鱧♀×烏鱧♂)潰瘍病病原菌的分離、鑒定及其防治中草藥的篩選

金潔南1，宋長(zhǎng)江2，王力1，李建1，黃曉聲2，張學(xué)振1

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070；2.中山市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心站，廣東中山528403)

針對(duì)2014年發(fā)生在廣東省中山市三角鎮(zhèn)的雜交鱧(Channamaculate♀×Channaargus♂)潰瘍病，開(kāi)展了病原的分離鑒定和致病性研究、藥物敏感性試驗(yàn)和中草藥抑菌、殺菌試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)從雜交鱧脾臟中分離到一個(gè)菌株S8，該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，菌體直、兩端鈍圓。對(duì)該菌進(jìn)行生理生化鑒定、16S rRNA和gyrB序列和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，此致病菌株為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)人工感染劑量大于1.0×107CFU/尾時(shí)，能引起雜交鱧100%發(fā)病死亡?？咕幬锩舾行栽囼?yàn)表明，溫和氣單胞菌S8對(duì)阿米卡星、頭孢拉啶等藥物高度敏感，對(duì)頭孢他啶、氨芐西林、復(fù)方新諾明等抗菌藥物不敏感。應(yīng)用二倍稀釋法測(cè)定了18種中草藥對(duì)溫和氣單胞菌S8的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果顯示：石榴皮、五倍子、黃芩對(duì)溫和氣單胞菌S8的抑菌殺菌效果最佳，其次為山茱萸、地榆和蘆薈。

雜交鱧(Channamaculate♀×Channaargus♂)；潰瘍??；溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)；中草藥

雜交鱧由廣東順德地區(qū)率先培育，是以烏鱧(Channaargus)為父本，斑鱧(ChannaMaculata)為母本雜交繁育出的子一代雜交種，具有生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高等雜交優(yōu)勢(shì)[1]，其肌肉蛋白質(zhì)氨基酸水平和物理特性均優(yōu)于烏鱧[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)雜交鱧年產(chǎn)量在10×104t以上，約占鱧科魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖量50%，在廣東地區(qū)生魚(yú)市場(chǎng)的占有率達(dá)90%，逐步取代烏鱧、斑鱧，成為鱧科魚(yú)類(lèi)主要養(yǎng)殖品種[3]。隨著養(yǎng)殖密度的不斷提高，雜交鱧疾病頻繁暴發(fā)。潰瘍病是雜交鱧養(yǎng)殖中常見(jiàn)的疾病，發(fā)病速度快、感染面積大，幸存?zhèn)€體因疤痕、畸形失去商品價(jià)值，給養(yǎng)殖戶造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)關(guān)于潰瘍病的報(bào)道集中在泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、刺參(Stichopusjaponica)、黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)、大口黑鱸(Micropterussalmoides)、黃鱔(Monopterusalbus)等養(yǎng)殖品種[4-8]，但關(guān)于雜交鱧潰瘍病的研究開(kāi)展較少，僅余銀春等[9]和舒新華等[10]從皮膚潰爛的烏鱧中分離得到了一株嗜水氣單胞菌(Aeromonas.hydrophila)，其感染引起烏鱧造血功能障礙，導(dǎo)致患病個(gè)體死亡。本研究對(duì)雜交鱧潰瘍病的病原菌進(jìn)行了分離、鑒定，對(duì)分離菌株的致病性開(kāi)展試驗(yàn)，并比較了18種中草藥對(duì)該病原菌體外抑菌、殺菌實(shí)驗(yàn)，為該病的臨床防治和診斷提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

病魚(yú)為150～250 g，于2014年3月采集自廣東省中山市三角鎮(zhèn)某養(yǎng)殖場(chǎng)。病魚(yú)體表大面積潰爛，裸露肌肉壞死，腹部腫脹。健康雜交鱧購(gòu)自廣東省中山市三角鎮(zhèn)某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重75～100 g，暫養(yǎng)20 d確認(rèn)健康無(wú)病后用于人工感染試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)試劑：腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)(美國(guó)BD公司)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(武漢鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)、細(xì)菌生化反應(yīng)微量鑒定管和藥物敏感試紙片(杭州微生物試劑有限公司)。中草藥石榴皮(Punicagranatum)、五倍子(Gallnut)、黃芩(RadixScutellariae)、山茱萸(Fructuscorni)、地榆Radixsanguisorbae、蘆薈(Aloe)、陳皮(Pericarpiumcitrireticulatae)、連翹(Fructusforsythiae)、蘇木(Lignumsappan)、山楂(Fructuscrataegi)、艾葉(Foliumartemisiaeargyi)、板藍(lán)根(Radixisatidis)、關(guān)黃柏(Cortexphellodendrichinsis)、虎杖(Rhizomapolygonicuspidati,)、苦參(Radixsophoraefiavescentis)、白芍(RadixPaeoniaeAlba)、大黃(Rheumofficinale)、茯苓(Poria)等均購(gòu)自河北省保定市保康大藥房。

1.2病原菌的分離、純化

取患潰瘍病的雜交鱧，用0.65%的無(wú)菌生理鹽水沖洗體表，無(wú)菌操作取肝、脾、腎和體表潰瘍組織，劃線接種于BHI培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)24～36 h，選取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落，劃線純化。獲得純培養(yǎng)后，部分菌株4 ℃保存，用于開(kāi)展實(shí)驗(yàn)；部分菌株，按照1∶1的體積量加入無(wú)菌30%甘油，混合均勻，-80 ℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/span>

1.3人工感染實(shí)驗(yàn)

雜交鱧飼養(yǎng)于半徑0.4 m、高1.2 m魚(yú)缸中，實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣增氧，水溫22～24 ℃，每天換水，不投餌。菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)18 h，平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度，調(diào)整濃度至8.9×106、8.9×107、8.9×108CFU/mL。腹腔注射健康雜交鱧，每尾注射0.5 mL，同一濃度接種8尾，另設(shè)接種同批、同劑量無(wú)菌生理鹽水的健康雜交鱧作為對(duì)照，隔離養(yǎng)殖于試驗(yàn)魚(yú)缸中。連續(xù)觀察15 d，記錄試驗(yàn)魚(yú)的發(fā)病、死亡情況，并對(duì)死亡魚(yú)或?yàn)l死魚(yú)進(jìn)行病原菌再分離，觀察再次分離菌株的形態(tài)和理化性質(zhì)是否和原分離菌株一致，并再次進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。

1.4菌株形態(tài)觀察及生理生化特性的測(cè)定

將純化分離菌接種于BHI培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)特性與菌落形態(tài)，通過(guò)革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)特征。將純培養(yǎng)細(xì)菌接種于微量生化反應(yīng)管，進(jìn)行理化特性檢測(cè)。

1.5分離菌16S rRNA和gyrB基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

取新鮮菌液，離心收集菌體，按照鼎國(guó)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA。16S rRNA基因的通用引物為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′；gyrB基因引物為：F：5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′，R：5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′。16S rRNA基因PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。gyrB基因PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。10 μL的PCR反應(yīng)體系組成均為：3.9 μL無(wú)菌雙蒸水，5 μL 2×PCR Mix，上下游引物各0.3 μL，模板0.5 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物切膠回收后送武漢擎科偉業(yè)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序?；蛐蛄性贕enBank上進(jìn)行Blast比對(duì)，利用MAGA 5.05軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行分析。

1.6藥敏試驗(yàn)

采用常規(guī)瓊脂擴(kuò)散(K-B)法進(jìn)行測(cè)定。制備平板，接種，然后將藥敏紙片貼在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)18～24 h后，測(cè)定抑菌圈直徑，根據(jù)美國(guó)CLSI標(biāo)準(zhǔn)中藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)，判定藥敏結(jié)果。

1.7抑菌中草藥的篩選

18種中草藥各取20 g用300 mL蒸餾水浸泡30 min后煎煮，沸后用文火煎煮30 min，16層紗布過(guò)濾，重復(fù)1次，合并所得藥液，濃縮至20 mL，使其終濃度相當(dāng)于原藥1 g/mL，滅菌，4 ℃保存待用。菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)18 h，調(diào)整濃度至108CFU/mL。采用兩倍稀釋法進(jìn)行最小抑菌濃度測(cè)定，取試管11支，編號(hào)1～11，每管加入1 mL培養(yǎng)基。取編號(hào)1試管，加入藥液1 mL，混勻；從1號(hào)試管取1 mL混合液加入2號(hào)試管，依次進(jìn)行梯度稀釋，直至9號(hào)試管，1～9號(hào)試管藥液濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL。1～10號(hào)試管分別接種100 μL菌液，11號(hào)不加菌液，28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。10號(hào)試管細(xì)菌生長(zhǎng)，11號(hào)管細(xì)菌不生長(zhǎng)，試驗(yàn)方為有效。無(wú)菌生長(zhǎng)試管中的最低藥液濃度即為最低抑菌濃度(MIC)。吸取各種藥物的MIC和高于MIC濃度的各個(gè)梯度的試管中的培養(yǎng)物0.1 mL，涂平板，28 ℃培養(yǎng)2 d后觀察有無(wú)菌落形成，無(wú)菌落形成的相應(yīng)試管中的最低藥物濃度即為該種藥物對(duì)菌株的最小殺菌濃度(MBC)。

2　結(jié)果

2.1病原菌分離純化與形態(tài)學(xué)特征

從患病雜交鱧肝臟、脾臟、潰瘍中分別得到一株優(yōu)勢(shì)菌命名為：L9，S8，M7，腎臟中沒(méi)有分離得到菌株。其在BHI平板上28℃培養(yǎng)24 h，形成灰白色、表面光滑、邊緣整齊、半透明狀微隆的圓形菌落。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在10×100油鏡下均可觀察到革蘭氏陰性短桿菌，菌體直、兩端鈍圓、單個(gè)或者成對(duì)存在(圖1)。

圖1　分離菌株革蘭氏染色Fig.1　Micrograph of the isolated bacterial strain (10×100)

2.2人工感染試驗(yàn)結(jié)果

以分離得到的菌株感染雜交鱧，注射菌株S8的組別出現(xiàn)死亡，而對(duì)照組沒(méi)有死亡(表1)；對(duì)死亡的雜交鱧進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分離檢測(cè)，結(jié)果檢出與S8形態(tài)及理化特征相似的細(xì)菌。取再次分離的菌株進(jìn)行人工感染得到了一致的感染結(jié)果。

表1　分離菌株的人工感染試驗(yàn)Tab.2　Animal challenged with the isolated bacterial strains

2.3病原菌的生理生化特性

根據(jù)分離菌的生理生化特性結(jié)果，按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠，蔡妙英，2001)和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)的標(biāo)準(zhǔn)，鑒定該致病菌為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)(表2)。

表2　分離菌的生理生化特性Tab.2　Biochemical characterization of the isolated bacterial strain

注：表中符號(hào)“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性；“d”種間不同反應(yīng)

2.416S rRNA和gyrB基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

S8菌株16S rRNA基因與gyrB基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)后，得到預(yù)期大小、單一的條帶(圖2)，純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后分別得到1 440 bp和1 048 bp的片段序列，序列提交至NCBI獲得GenBank登錄號(hào)分別為KT 036666、KT 036667。利用MAGA 5.0軟件采用Neighbor-Joining法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。根據(jù)16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株S8與溫和氣單胞菌KF761305.1親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)97%；由gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，菌株S8與溫和氣單胞菌AB473090.1親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)100%；結(jié)合形態(tài)、生理生化特性，分離菌株S8鑒定為A.sobria。

圖2　分離菌株的16S rRNA (A)和gyrB (B)基因的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2　The electrophoresis production of the 16S rRNA gene (A) and gyrB gene (B) PCR amplification of the isolated bacterial strain M:DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR產(chǎn)物

圖3　分離菌株的16S rRNA基因序列(A)和gyrB基因序列(B)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3　Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene (A) and gyrB gene (B) of the isolated bacterial strain

2.5病原菌藥敏性

采用常規(guī)瓊脂擴(kuò)散(K-B)法測(cè)定菌株S8對(duì)16種抗菌類(lèi)藥物的敏感性(表3)。結(jié)果表明：菌株S8對(duì)阿米卡星、頭孢拉啶、左氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素、呋喃妥因均高度敏感，對(duì)卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、頭孢曲松中度敏感，對(duì)頭孢他啶、氨芐西林、復(fù)方新諾明耐藥。

2.6抑菌中草藥篩選結(jié)果

測(cè)定18種中草藥對(duì)菌株S8的最低抑菌濃度和殺菌濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。石榴皮、五倍子、黃芩對(duì)S8抑菌和殺菌效果最佳，MIC和MBC最低，分別為3.91 mg/mL和7.81 mg/mL；其次為山茱萸、地榆和蘆薈，MIC和MBC分別為7.81 mg/mL和15.63 mg/mL；虎杖、白芍等對(duì)S8抑菌效果不佳。

表3　分離菌株的藥敏特性Tab.3　The chemical susceptibility testing result of the isolated bacterial strain

注：表中符號(hào)“S”表示高度敏感；“I”表示中度敏感；“R”表示不敏感。

表4　18種中草藥對(duì)分離菌株的最小抑菌濃度(MIC) 和最小殺菌濃度(MBC)Tab.4　The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) of 18 kinds of Chinese herbal medicine to the isolated bacterial strain　/(mg/mL)

3　討論

魚(yú)類(lèi)潰瘍病是一種全球流行的疾病，1971—1980年，在澳大利亞、亞太地區(qū)和北美地區(qū)等地迅速擴(kuò)散[11-12]，在亞洲的馬來(lái)西亞、泰國(guó)、中國(guó)、印度等多個(gè)國(guó)家廣泛傳播[13]。溫和氣單胞菌廣泛分布在自然界的水、土壤以及人和動(dòng)物的糞便中，是一種人畜共患病原菌[14]，能引起魚(yú)類(lèi)大規(guī)模的死亡。國(guó)內(nèi)學(xué)者已證明溫和氣單胞菌能夠引起黃鱔[8]、黃顙魚(yú)[15]、黃沙鱉(Truogxsinensis)[16]、鱘(Sturgeon)[17]、鯉(Cyprinuscarpio)[18]、似鲇高原鰍(Triplophysasiluroides)[19]、泥鰍[20]、羅非魚(yú)(Oreochromismossambicus)[21]等體表潰瘍，但關(guān)于雜交鱧潰瘍病的病原菌還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從患病雜交鱧體內(nèi)分離到一株致病菌，人工感染發(fā)現(xiàn)高劑量組雜交鱧全部死亡，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rRNA基因、gyrB基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，確認(rèn)該菌株為A.sobria，這是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道從患病雜交鱧中分離得到溫和氣單胞菌。

抗菌類(lèi)藥物在水產(chǎn)動(dòng)物疾病的防治中有著重要的作用，藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A.sobria對(duì)諾氟沙新、依諾沙星、阿米卡星等8種藥物高度敏感，對(duì)鏈霉素等5種藥物中度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明等3種藥物耐藥，與泥鰍[4]、黃顙魚(yú)[6]、黃鱔[8]等患病個(gè)體中分離鑒定的A.sobria在藥敏感性上略有差異，這可能與生產(chǎn)中各養(yǎng)殖場(chǎng)用藥習(xí)慣不同等有關(guān)。抗生素的大量使用容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的形成，在養(yǎng)殖過(guò)程中選擇用藥必須謹(jǐn)慎，必須建立在實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，針對(duì)性用藥，要實(shí)行多種藥物交叉使用，避免產(chǎn)生耐藥性或抗藥性。

天然中草藥具有無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)，近幾年廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)疾病防治[22-25]。本實(shí)驗(yàn)研究18種中草藥對(duì)雜交鱧源溫和氣單胞菌的體外抑菌、殺菌效果，發(fā)現(xiàn)石榴皮、五倍子和黃芩效果最佳，MIC均為3.91 mg/mL，MBC均為7.81 mg/mL，與梁利國(guó)等[26]報(bào)道結(jié)果基本一致。彭金菊等[27]研究了30種中藥的提取液對(duì)溫和氣單胞菌的抑制效果，五倍子水煎煮液抑菌效果最佳，MIC也為6.25 mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所出入，可能與中草藥質(zhì)量及溫和氣單胞菌菌株間差異有關(guān)。五倍子、黃芩和石榴皮對(duì)溫和氣單胞菌具有較好的抑菌、殺菌效果，可能與這三種藥物自身的特性有關(guān)。五倍子主要化學(xué)成分包括鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸、五倍子油等[28]，我國(guó)藥典上收載的五倍子鞣質(zhì)，稱為鞣酸，又叫單寧酸，含量可達(dá)70%以上[29]。黃芩不僅具有清熱解毒，能夠抑制或殺滅細(xì)菌和病毒等致病原，具有較廣的抗菌譜，還具有抗炎、抑制變態(tài)反應(yīng)、降脂利膽保肝、抗氧化、抗腫瘤等多種功效[30]，其化學(xué)成分主要為黃酮類(lèi)化合物[31]，包括黃芩甙、黃芩素等，其中黃芩苷具有多種藥理作用，很大程度上取決了黃芩的功效，是黃芩的主要活性成分。石榴皮是石榴的干燥果皮，含有氨基酸、糖及其苷類(lèi)、酚類(lèi)和鞣質(zhì)、黃酮類(lèi)等化學(xué)成分[32]，鞣質(zhì)和生物堿是其主要的化學(xué)活性成分，研究表明石榴皮水提取物中的蹂質(zhì)是一種具有沉淀蛋白質(zhì)特性的水溶性多元酚類(lèi)化合物，具有抗Ⅱ型單純皰疹病毒的功效[33]。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用上，中藥往往以多種藥物配伍的復(fù)方形式使用，下一步研究將對(duì)復(fù)方中草藥對(duì)雜交鱧源溫和氣單胞菌的抑菌、殺菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。

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