對蝦養(yǎng)殖：淺析肝腸胞蟲及其診斷防控

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肝腸胞蟲

Enterocytozoon hepatopenaei, EHP(肝腸胞蟲)屬于真菌界、微孢子門、腸胞蟲屬，是一種可感染多種真核生物的專性細胞內(nèi)寄生蟲，2009年在泰國生長緩慢的斑節(jié)對蝦中被首次發(fā)現(xiàn)分離而命名，其全名為“腸道上皮細胞微孢子蟲”。

自2013年以來，我國各地養(yǎng)殖的南美白對蝦先后出現(xiàn)EHP的感染，感染率居高不下，造成對蝦生長緩慢，養(yǎng)殖戶經(jīng)濟效益顯著下降，已成為制約南美白對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的最主要病害之一。

2017年，國家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系開展的被動監(jiān)測結(jié)果顯示，EHP已在我國蝦類主要養(yǎng)殖區(qū)廣泛分布，在山東、河北、江蘇、上海、浙江、福建、廣東、海南和新疆均有不同水平的檢出。

除我國外，泰國、印度、文萊、越南、委內(nèi)瑞拉、印度尼西亞和馬來西亞等國均有EHP檢出。在印度東海岸西孟加拉邦的對蝦人工養(yǎng)殖中發(fā)病率高達84.9%。

在泰國，EHP引起的HPM（對蝦肝胰腺微孢子蟲病，hepatopancreatic microsporidiosis, HPM）已經(jīng)成為繼白斑病和急性肝胰腺壞死病后影響泰國對蝦養(yǎng)殖的第三個最棘手的問題。

極管是肝腸胞蟲感染的主要結(jié)構(gòu)，在未感染時，極管在孢子細胞內(nèi)呈螺旋狀纏繞，當孢子進入宿主體內(nèi)感受到環(huán)境變化時，孢子內(nèi)壓力增大導(dǎo)致其極管外翻并彈出，極管彈出的同時將孢子內(nèi)的遺傳物質(zhì)注射入宿主細胞內(nèi)，隨后遺傳物質(zhì)在宿主細胞內(nèi)吸取養(yǎng)分進行復(fù)制、分裂，從而實現(xiàn)孢子的繁殖。由于EHP是在細胞內(nèi)繁殖，傳統(tǒng)殺蟲藥很難對其奏效。

肝腸胞蟲感染細胞的過程

生活史和入侵機制

微孢子蟲生活史大致分為3個部分：

1感染期

環(huán)境中的成熟孢子彈出極管，像“注射器”一樣刺入宿主細胞的細胞質(zhì)。孢原質(zhì)通過彈出的極管管腔釋放，極管先端形成芽體，芽體進入宿主細胞內(nèi)。

2裂殖增殖期

芽體在侵入宿主細胞內(nèi)后的幾小時內(nèi)，保持最初的圓形，大小則逐漸增大，隨后芽體以二分裂或多分裂逐漸增大發(fā)育為裂殖體，然后變異為母孢子，此過程反復(fù)進行，母孢子數(shù)量增加，從而進入孢子增殖期。

3孢子增殖期

母孢子以二分裂方式形成孢子母細胞，并由孢子母細胞發(fā)育為成熟的孢子，標志著一個生活史的完成。

對蝦肝腸胞蟲（EHP）宿主廣泛，目前已知可感染的蝦類宿主有南美白對蝦、斑節(jié)對蝦、日本囊對蝦、羅氏沼蝦、南美藍對蝦；除此之外，在魷魚、沙蠶、商品化冷凍橈足類、商品化鹵蟲卵及鹵蟲幼體、冰凍成體鹵蟲也能檢出。

EHP專性寄生于細胞內(nèi)，在細胞外部無法繁殖，因其基因組已缺失了許多重要的代謝相關(guān)基因，必須要由寄主細胞提供。

EHP主要感染對蝦肝胰腺、腸道、血淋巴、肌肉、鰓。在肝胰腺細胞內(nèi)形成孢原質(zhì)，成熟后經(jīng)消化道排出體外，孢子壁較厚，藥物難進入。

EHP無需中間宿主，可通過如下方式進行感染——

• 產(chǎn)生的子代孢子感染新的細胞，或通過腸道排出感染其它蝦；

• 垂直傳播：種蝦感染仔蝦；

• 水平傳播：攝食攜帶EHP的鮮活餌料、病死蝦或環(huán)境中的孢子體均能感染；

• 昆蟲攝食傳播：如蜻蜓等。

EHP個體微小，感染EHP的對蝦癥狀不明顯，因此很難在現(xiàn)場確診。簡便、快速且靈敏度高的分子生物學(xué)方法已成為實驗室檢測EHP的常規(guī)手段。

由于EHP的宿主廣泛，傳播過程中不需要中間寄主，既可通過水體又可以通過攝食進行傳播，加大了EHP的預(yù)防難度。當EHP受到脅迫時會吐出極絲，空塘?xí)r可采用提高pH值的方式，脅迫其極絲放出，使孢子因找不到宿主寄生而死亡。但對蝦體內(nèi)的肝腸胞蟲不能采用提高pH值的方法來清除，否則會在肝胰腺內(nèi)快速增殖。另外，還可采用消毒劑、改變溫度等方法，抑制EHP孢子的活力，如將溫度提高到75°C，EHP的孢子在1分鐘內(nèi)失活（Munkongwongsiri 等，2021）

EHP孢子純化和出芽

pH值和溫度對肝腸胞蟲孢子噴射率的影響 (引自諾維信Danny)

28°C下EHP的孢子狀態(tài); 75°C下45 秒EHP的孢子狀態(tài); 75°C下60 秒EHP的孢子狀態(tài)

高錳酸鉀、氯制劑和乙醇消毒后對EHP孢子噴射的影響(引自諾維信Danny)

蝦肝腸胞蟲對蝦的影響

對蝦感染EHP的危害嚴重程度取決于其孢子在肝胰臟中的數(shù)目，孢子的數(shù)目越多，對蝦生長的影響越大，具體表現(xiàn)為以下幾點：

⑴蝦肝腸胞蟲寄生于對蝦肝臟及腸道細胞內(nèi)，造成吸收功能下降，營養(yǎng)不良導(dǎo)致對蝦生長緩慢，同一池塘的蝦規(guī)格參差不齊。生長緩慢的蝦因體瘦弱抗病力差，蛻殼期出現(xiàn)零星死亡，如遇異常天氣和水質(zhì)突變等應(yīng)激時可造成大量死亡。

⑵有研究認為感染蝦肝腸胞蟲的對蝦存在肝胰腺壞死的風(fēng)險，EHP是對蝦急性肝胰腺壞死（AHPND/EMS）和敗血性肝胰腺壞死（SHPN）的一個危險因素，EHP感染增強了對蝦AHPND、SHPN感染的敏感性，加重了肝胰腺細胞的壞死和脫落，提高了AHPND和SHPN的死亡率。2019年利洋公司調(diào)查發(fā)病池塘也發(fā)現(xiàn)對蝦肝胰腺壞死與蝦肝腸胞蟲具有密切聯(lián)系?？赡芎虴HP感染導(dǎo)致蝦免疫力降低，機體更容易被細菌、病毒等微生物入侵，引起交叉感染有關(guān)。

⑶2010年越南有學(xué)者認為對蝦白便綜合征是由蝦肝腸胞蟲引起。2016年有報道發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷白便綜合征與沒有白便綜合征的蝦肝胰臟組織及池塘中的EHP呈負相關(guān)關(guān)系，即經(jīng)歷白便綜合征的蝦肝胰臟組織及池塘中的EHP含量高于沒有白便綜合征的蝦或池塘，認為對蝦白便癥與蝦肝腸胞蟲存在關(guān)聯(lián)。

發(fā)病蝦生長緩慢，規(guī)格參差不齊

蝦肝腸胞蟲的流行特點

EHP孢子“耐受性”極強（有專家認為可以耐受長達50年的干燥），沒有明顯的易感水溫或季節(jié)，在苗種培育和成蝦養(yǎng)殖階段均有出現(xiàn)。具有如下傳播和發(fā)病特點：

⑴傳播方式

蝦肝腸胞蟲感染對蝦可水平傳播或垂直傳播，即蝦經(jīng)口攝食寄生蝦肝腸胞蟲的病蝦、餌料（如沙蠶、橈足類、輪蟲、鹵蟲等）或環(huán)境中的孢子體而感染，或通過親蝦傳播給子代。

其在宿主細胞內(nèi)繁殖，通過糞便排出體外，在水環(huán)境中形成孢子體，散在分布于水體或附著于藻類、碎屑、飼料表面及底泥環(huán)境中，孢子可在養(yǎng)殖環(huán)境中累積進行傳播。

⑵影響因素

據(jù)相關(guān)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，感染蝦肝腸胞蟲發(fā)病的對蝦池塘具有如下特點：養(yǎng)殖密度越低，感染EHP的幾率也越低；高鹽度養(yǎng)殖對蝦相對低鹽度感染EHP的幾率增加；池塘有機質(zhì)越多，患病風(fēng)險越高，可能與微孢子蟲的中間寄主生活環(huán)境有關(guān)。其孢子數(shù)目與養(yǎng)殖天數(shù)成正比，養(yǎng)殖天數(shù)越長，孢子數(shù)目越多，特別是在養(yǎng)殖40天左右，會出現(xiàn)一個暴發(fā)的高峰期。

發(fā)病診斷

蝦肝腸胞蟲蟲體較小，采用光學(xué)顯微鏡進行壓片鏡檢蟲體的形態(tài)特征較難確診，通常是采用實驗室普通PCR或套式PCR、實時熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)等方法對其進行定性、定量檢測。另外，固定樣品做組織病理切片，觀察對蝦肝臟有大量蝦肝腸胞蟲，發(fā)病蝦肝胰腺組織嚴重病變，肝胰腺腔體變小或消失，部分肝胰腺上皮細胞出現(xiàn)壞死或脫落，說明對蝦已產(chǎn)生危害。一般認為肝胰腺中EHP在103copies/ng DNA以上可能代表較高的風(fēng)險。

發(fā)病南美白對蝦肝胰腺組織切片可見蝦肝腸胞蟲

蝦肝腸胞蟲的防控

蝦肝腸胞蟲的孢子壁較厚，可達10nm，且成熟的孢子具有一層堅韌的幾丁質(zhì)外殼，一般藥物難進入蟲體，目前針對該病尚未發(fā)現(xiàn)確切有效的治療藥物或措施，只能根據(jù)其流行特點進行防控。

⑴清塘滅孢

有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過砂濾、臭氧消毒、紫外消毒等一系列處理后的養(yǎng)殖用水未檢測到EHP，證實消毒處理可以預(yù)防EHP感染和傳播。所以，對于EHP發(fā)病率高的地區(qū)（如珠三角土塘養(yǎng)殖）、對蝦生長緩慢的養(yǎng)殖池塘需進行徹底全面的清塘消毒。如翻耕塘底（10厘米左右），使用400公斤/畝以上的生石灰徹底清淤，使塘底的pH值達到12，并保持一段時間，之后塘底完全曬干，可有效殺滅微孢子蟲。

⑵水源、工具、餌料消毒

氯制劑、高錳酸鉀等消毒，處理養(yǎng)殖水源中的野蝦野蟹、浮游生物及水體中的孢子蟲。日常養(yǎng)殖生產(chǎn)用具等必須進行嚴格的消毒后再使用。投喂沙蠶、鹵蟲、豐年蟲等活餌時，建議經(jīng)過冷凍、巴氏消毒或者X射線消毒以后再使用，避免攝食攜帶病原的餌料生物。

⑶加強檢疫

EHP可垂直傳播，所以須嚴格對親蝦及苗種進行檢疫，培育無特定病原（SPF）蝦苗，可有效降低對蝦EHP感染率。親蝦培育池要徹底清洗干燥后用氫氧化鈉消毒，所有設(shè)備均要在2.5%的氫氧化鈉溶液中浸泡至少3個小時，充分晾干，使用前再用200ppm、pH值低于4.5的鹽酸噴洗處理。

⑷提高免疫力

內(nèi)服保肝護腸藥物（如益生菌、中草藥、維生素等），提高免疫力，避免病原“趁虛而入”。

⑸控制其它影響因素

如控制養(yǎng)殖密度不宜過高；低鹽度水體進行養(yǎng)殖；勤調(diào)水改底，減少池塘有機質(zhì)等具有一定的防控作用。另外，及時清理發(fā)病蝦和死蝦，不隨意排放發(fā)病池塘養(yǎng)殖尾水，對防止蝦肝腸胞蟲的傳播范圍進一步擴大十分重要。

另外，有研究表明維持水體中的氨氮、亞硝酸鹽在一定濃度范圍內(nèi)（氨氮6-9mg/L、亞硝酸鹽10mg/L），可以有效控制蝦體內(nèi)EHP攜帶量，但并不能殺死EHP，在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中適用性不強。

(來源：禮藍水產(chǎn)，利洋水產(chǎn)；綜合：西南漁業(yè)網(wǎng))

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