固氮藍(lán)藻與螺旋藻的培養(yǎng)

固氮藍(lán)藻的培養(yǎng)

固氮藍(lán)藻指具有明顯固氮能力的藍(lán)藻。它通過固氮酶的作用將大氣中游離的分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為可供植物吸收和利用的化合態(tài)氮。用作水稻等農(nóng)作物的氮肥源，能增加土壤肥力，達(dá)到增產(chǎn)效果。現(xiàn)在已知能夠固氮的藍(lán)藻達(dá)20多屬，150余種，中國已報(bào)道的固氮藍(lán)藻有70余種。在科研、生產(chǎn)上應(yīng)用的藻種主要是魚腥藻（Anabaena）、念珠藻（Nostoc）、單歧藻（Tolypothrix）。

據(jù)記載，早在1889年，德國弗蘭克（B.Frank）就發(fā)現(xiàn)在光照條件下生長藍(lán)藻的土壤含氮化合物較高。直到1928年德國德魯斯（K.Drewes）通過純培養(yǎng)才正式確認(rèn)點(diǎn)形念珠藻〔Nostoc punctiforme（Kütz.）Hariot〕具有固氮能力。1973年英國斯特沃特（W.D.P.Stewart）在《藍(lán)綠藻的生物學(xué)》一書中記載了120余種。中國藻類學(xué)家李良慶在20世紀(jì)30年代報(bào)道過若干省的固氮藍(lán)藻。從50年代后期起，黎尚豪發(fā)表了一系列有關(guān)固氮藍(lán)藻的文章，70年代后期進(jìn)行了固氮藍(lán)藻的應(yīng)用研究，在稻田大面積放養(yǎng)固氮藍(lán)藻，獲得增產(chǎn)效果。

形態(tài)特征 

主要種類的形態(tài)特征為：

魚腥藻屬（Anabaena Bory）屬藻殖段綱（Hormo-gonophyceae）、念珠藻目（Nostocales）、念珠藻科（Nos-tocaceae）。藻體為單一絲體，或?yàn)椴欢ㄐ文z質(zhì)塊或平展成膜狀體。藻絲寬度一致或末端略細(xì)，直或略彎曲。體外具一層透明而水化的膠質(zhì)鞘。細(xì)胞常為球形或桶形。

念珠藻屬（Nostoc Vauch.）屬藻殖段綱、念珠藻目、念珠藻科。藻體為有一定形狀的膠狀群體。絲體螺旋形彎曲或纏繞，膠鞘明顯或相互融合。藻絲呈念珠狀，由相同形狀細(xì)胞組成。細(xì)胞扁球形、球形、桶形、腰鼓形或圓柱形。

單歧藻屬（Tolypothrix Kütz.）屬藻殖段綱、念珠藻目、偽枝藻科（Scytonemataceae）。藻體為具偽枝的絲狀體。膠鞘堅(jiān)固，薄或厚，均勻或具層理，每條鞘內(nèi)具1條藻絲。枝多為單出，偶有雙出。

生態(tài)條件 

固氮藍(lán)藻為喜溫性植物，適宜溫度為25～35℃。在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，光照強(qiáng)度與藻體生長成正比；水溫32℃時(shí)光飽和值30000勒。相對濕度以70%～90%，pH值7～8為宜。培養(yǎng)液中需添加磷、鉀、鈣、鎂、鐵、鉬等元素。多數(shù)固氮藍(lán)洋中種類較少。束毛藻屬（Tridesmium Ehr.）、聚球藻屬（Synechococcus N?g.）等是分布在海洋的種類，還有土壤藍(lán)藻和胞內(nèi)共生藍(lán)藻（entocyanoses），如念珠藻屬。

培養(yǎng)方法 

主要有以下幾個(gè)步驟。

玻瓶藻種培養(yǎng) 

培養(yǎng)容器用500～1000毫升的三角燒瓶或廣口罐頭瓶等，內(nèi)盛1/4～1/3的水生111號或105號無氮培養(yǎng)液，瓶口包扎4層紗布或2層粗濾紙，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，用無菌操作將瓊膠斜面藻種（處于指數(shù)生長后期）接入瓶內(nèi)，接種時(shí)將藻塊盡量打碎離散。接種后可先暴露在陽光處照射，促使藻體迅速上浮水面，然后將培養(yǎng)瓶移至適宜的環(huán)境條件下培養(yǎng)，使藍(lán)藻盡快進(jìn)入正常生長。

淺盤培養(yǎng) 

用白色搪瓷盤、塑料盒或瓦盆，內(nèi)盛3～6厘米深無氮培養(yǎng)液；配制培養(yǎng)液的用水，為經(jīng)棉花柱過濾后的自來水或清潔的河水，也可將水煮沸冷卻后使用。培養(yǎng)液配方：取土壤浸出液（土壤500克，加水1升，充分?jǐn)嚢瑁缓箪o置1～2日，取上層清液），加水4倍稀釋，加入1%～2%的草木灰浸出液（500克草木灰，加水1升）及1%～2%的過磷酸鈣飽和液。所用藻種先集中在一個(gè)潔凈的容器內(nèi)，攪拌粉碎后均勻接種于盤內(nèi)，接種量以藻體浮起后能占水面約1/4為宜。盤上罩塑料薄膜，以保證盤內(nèi)濕度并避免外界污染。氣溫低的季節(jié)可在覆蓋的塑料薄膜上方用日光燈加溫；夏季陽光過于強(qiáng)烈，可選用淺藍(lán)色薄膜覆蓋，以利藍(lán)藻生長。將適量CO2（或?qū)O2與空氣混合）通入培養(yǎng)液內(nèi)，可加速藍(lán)藻繁殖。

土池培養(yǎng) 

包括：

①建池。建池的選點(diǎn)原則是水源潔凈（不含有大量雜藻、原生動物、昆蟲和油污等化學(xué)毒物）、排灌方便、光照充足、便于管理、土壤通透性和保水性較好的地塊。容積以長5～7米、寬1米、深15～20厘米為宜。池底要盡量平整，土池上方需搭拱棚，覆蓋塑料薄膜；拱棚頂高離水面40～50厘米，用以增溫、增濕、防風(fēng)避雨。土池四周需設(shè)排灌溝。任選泥土或塑料薄膜墊覆池底。養(yǎng)藻的水層一般為10厘米，可調(diào)節(jié)水深，原則上是淺水放藻，深水采收；氣溫高時(shí)用深水，氣溫低時(shí)用淺水。

②施肥與接種。培養(yǎng)藍(lán)藻的土池如選在農(nóng)田，因耕作土壤本身富有較全面的營養(yǎng)元素，只需施入少量磷鉀肥。中性偏酸的土壤宜施鈣鎂磷肥，約150千克/公頃，氯化鉀22.5～37.5千克/公頃或草木灰150千克/公頃，也可將過磷酸鈣與草木灰配合施用，用量各為150千克/公頃。采用塑料薄膜墊底的池子，池內(nèi)除施用過磷酸鈣外，尚需增施一些鐵、鉬等微量元素。藻種應(yīng)是純而健壯的鮮藻或干藻粉。在晴天的上午接種。接種量一般為100～150克/米2，若氣候條件適宜，可適當(dāng)加大接種量，多放藻種，勤分養(yǎng)，以加速繁殖。采用鮮藻接種時(shí)，應(yīng)將藻體攪拌，均勻潑灑水面；采用干粉藻種，以5～10克/米2為度，將其輕撒水面，接種后蓋好薄膜，高溫高濕環(huán)境利于藻粉復(fù)蘇生長。

③培養(yǎng)管理。盛夏烈日，溫度過高，中午前后應(yīng)在拱棚上鋪蓋葦簾，或在拱棚塑料薄膜上潑灑稀泥漿水，還可揭開塑料棚的一端或兩端通風(fēng)，也可以向池內(nèi)添加適量冷水，促使降溫（40℃以下）。當(dāng)藻體長滿水面（藻的指數(shù)生長后期，生活力旺盛時(shí)）或雖未長滿水面，但藻體因其他原因而老化、未見新藻絲鋪展時(shí)，則應(yīng)及時(shí)分養(yǎng)或采收。培養(yǎng)中應(yīng)防治病、蟲和防止雜藻的發(fā)生。搖蚊幼蟲、原生動物、輪蟲、蝌蚪、椎實(shí)螺以及各種雜藻等對藻體繁殖有嚴(yán)重危害。防治方法是首先應(yīng)在水源、土壤和藻種等三方面嚴(yán)格把關(guān)，防止將蟲卵、雜藻等帶入土池。在放藻前3～5天按每公頃22.5千克施入“1605”混合粉，進(jìn)行田面處理，可以減少蟲的危害。為避免污水流入池內(nèi)，平時(shí)尤其是夜晚要蓋嚴(yán)塑料薄膜。青蛙卵塊要隨時(shí)撈出；蝌蚪和搖蚊幼蟲，則需在晴天的中午，撈出藍(lán)藻，排干池水，蓋嚴(yán)薄膜，使在烈日曝曬下致死，或用敵百蟲、五氯酚鈉等化學(xué)農(nóng)藥殺死。雜藻污染嚴(yán)重時(shí)，只有徹底清池，鏟去池底表土或洗刷干凈墊底的塑料薄膜，然后重新加水放養(yǎng)。

螺旋藻的培養(yǎng)

螺旋藻屬藍(lán)藻門（Cyanophyta）、藍(lán)藻綱（Cyanophyceae）、顫藻目（Oscillatoriales）〔又稱段殖體藻目（Hormogonales）、顫藻科（Oscillatoriaceae）、螺旋藻屬（Spirulina）。本屬約有30多種，常用種類為鈍頂螺旋藻〔Spirulina platensis（Nordst.）Geitler〕和極大螺旋藻（Spirulina maxima Setch.et Gardn.）。

螺旋藻的蛋白質(zhì)含量很高（58.5%～71%），且具有合理的氨基酸組成，細(xì)胞壁非纖維素質(zhì)，易被人類和動物消化吸收。據(jù)報(bào)道，其蛋白質(zhì)真消化率高達(dá)75%；生物學(xué)值達(dá)68%；光能轉(zhuǎn)化率高達(dá)18%；干藻產(chǎn)量可達(dá)25噸/公頃·年，合每公頃年產(chǎn)24975千克（按蛋白質(zhì)含量60%計(jì)，折收蛋白質(zhì)近1000千克）。

非洲乍得湖當(dāng)?shù)鼐用褡怨啪褪秤寐菪濉?0年代引種研究利用以來，引起了國際上生物學(xué)家和生物技術(shù)開發(fā)商的廣泛重視。墨西哥建立了世界上第一個(gè)生產(chǎn)螺旋藻的工廠，年產(chǎn)干粉約450噸，用作飼料和保健食品。至80年代末，已有德國、印度、意大利、美國、法國、日本、以色列和中國等從事螺旋藻的開發(fā)研究和生產(chǎn)，取得了經(jīng)濟(jì)實(shí)效。法國、中國等進(jìn)行了海水培養(yǎng)螺旋藻的試驗(yàn)研究，并將螺旋藻（鮮藻或干品）用作魚、蝦、貝的餌料，效果明顯。

形態(tài)特征 

單細(xì)胞或多細(xì)胞組成絲體，無鞘；圓柱形，呈疏松或緊密的有規(guī)則的螺旋狀彎曲。細(xì)胞或藻絲頂部常不尖細(xì)，橫壁常不明顯，不收縊或收縊，頂細(xì)胞圓形，外壁不增厚。細(xì)胞內(nèi)含物均一或有顆粒，藻體淡藍(lán)綠色。

生態(tài)條件 

螺旋藻在海洋及湖泊均能成活，高鹽高堿水域中生長更為旺盛。適宜溫度為30～35℃。最佳光照度為25000～35000勒，生長繁殖初期要求光照較弱。pH值以8.5～10.5為宜。需要較高的堿性環(huán)境和較高濃度的CO2。

培養(yǎng)方法 

螺旋藻的批量培養(yǎng)方式有兩種：①潔凈制式。利用新鮮、清潔的淡水，添加各種化學(xué)鹽類，進(jìn)行培養(yǎng)或生產(chǎn)。其產(chǎn)品主要用作食品、飼料或醫(yī)藥原料。②廢水制式。以污物或污水作為螺旋藻生長的主要物質(zhì)。收獲的產(chǎn)品一般只作飼料和餌料用。但廢水所含污染物必須在允許的范圍以內(nèi)，以防通過食物鏈轉(zhuǎn)入人體。

藻種的保存和培養(yǎng) 

藻種可用固體或液體CFTRI培養(yǎng)基（印度中央食品工藝研究所配制的一種用于螺旋藻的簡化培養(yǎng)基）保存。接種藻絲后置于通常光照下培養(yǎng)，每隔30～40天作一次繼代培養(yǎng)。當(dāng)藻體生長繁殖到一定密度、水體呈深青色時(shí)，即可稀釋至大玻璃瓶內(nèi)進(jìn)行二級擴(kuò)大培養(yǎng)。國際上對螺旋藻的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，常用扎勞克氏（Zarrouk）培養(yǎng)基。

露天大量培養(yǎng) 

可用塑料薄膜制作的培養(yǎng)槽也可挖土池，池底鋪塑料薄膜；或用磚與水泥襯砌。池深約40～50厘米，培養(yǎng)水深以20～25厘米為宜。CFTRI培養(yǎng)基或簡化CFTRI培養(yǎng)基均可使用，還可使用農(nóng)家肥替代部分化學(xué)制品作營養(yǎng)成分（添加1%人尿或牛尿、牛糞灰與經(jīng)蒸煮過的骨粉，可減少硝酸鹽、磷酸鹽和鈣元素的用量）。收獲藻體后的培養(yǎng)液可供繼續(xù)重復(fù)培養(yǎng)使用，僅需補(bǔ)充被消耗掉的營養(yǎng)物。這種部分添加的辦法可持續(xù)4～5個(gè)培養(yǎng)周期（亦即收獲3～4次）。

碳源供給有以下三種：

①碳酸氫鈉，最低需要量為4.5克/升（標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基內(nèi)為16.8克/升）。

②二氧化碳，通入含1.5%CO2的混合氣體。③利用好氣性微生物的分解作用（即好氣性發(fā)酵），從新鮮牛糞和農(nóng)家堆肥中制取CO2，可使空氣中CO2比率得到提高。最初接種濃度以225～250毫克/升為妥。開始移到室外培養(yǎng)時(shí)，接種藻種的工作宜在夜間進(jìn)行，以免光強(qiáng)突然變化，影響藻類生長繁殖。攪拌可用手工攪動或采用機(jī)械搖動，一般每天攪動2次，每次15分鐘。在培養(yǎng)過程中，因蒸發(fā)作用造成的培養(yǎng)水損失，必須適當(dāng)補(bǔ)充。補(bǔ)液時(shí)間宜在清晨或傍晚，并注意保持培養(yǎng)水的pH值。