細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗

通過病樣采集、細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗，科學(xué)指導(dǎo)了養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中的細(xì)菌病防治。

1.主要癥狀 鰓部充血、鰭條出血、皮膚潰瘍、鱗片脫落、黏液增多，解剖可見腹水、內(nèi)臟出血、水腫等癥狀，初步診斷為細(xì)菌性感染。

2.樣品處理 將病魚在無菌環(huán)境下剖解，取內(nèi)臟置于無菌平皿中，用滅菌剪刀剪取其橫斷面，制備菌液。

3.藥敏試驗 將菌液取100微升涂板，貼藥敏紙片，18℃下培養(yǎng)20 小時，測定抑菌圈直徑，參照NCCLS 的判斷標(biāo)準(zhǔn)進行結(jié)果判定，顯示頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、阿米卡星和左氟沙星抑菌效果最佳。

4.細(xì)菌分離純化 在普通營養(yǎng)瓊脂平板劃線接種，18℃培養(yǎng)24 小時，觀察平板細(xì)菌生長情況，根據(jù)菌落的形態(tài)特點，挑取多個典型單菌落，涂片，鏡檢。如此反復(fù)，直到純化為單一菌落。

5.16S rRNA 序列分析 根據(jù)TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒說明書提取分離菌株的基因組DNA。

根據(jù)平板上菌落的顏色、形態(tài)、大小等特征挑取不同菌落于含LB 液體培養(yǎng)基的試管中(共12 管)，18℃過夜培養(yǎng)，第2 天依據(jù)細(xì)菌DNA 提取試劑盒的操作流程分別提取12株細(xì)菌的DNA，并進行PCR 擴增。反應(yīng)體系：Premix Taq?(Ex Taq?Version 2.0 plus dye)12.5 微升，DNA 模板1 微升，上、下游引物各1 微升，dd 水補足至25 微升。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 分鐘，95℃變性30 秒，退火55～65℃，延伸90 秒，Cycle 39×，再延伸5 分鐘，4℃下保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳并查看結(jié)果。

將PCR 產(chǎn)物條帶切割，放入1.5 毫升離心管中，根據(jù)膠回收試劑盒的操作流程分別對12 株菌落進行膠回收。最終將PCR膠回收產(chǎn)物再次用瓊脂糖凝膠驗證后送金唯智公司進行16S rRNA測序。

圖1 純化后的PCR擴增產(chǎn)物

金唯智公司測序返回的12 株細(xì)菌序列分別進行拼接并在NCBI中比對，結(jié)果見表1。

表1 菌株16S rRNA 序列分析

通過對病魚主要組織和內(nèi)臟器官進行初步診斷及病原菌分離、16S rRNA 擴增和測序，檢測到假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、溫和氣單胞菌、紫色桿菌等多種病原菌，并通過藥敏試驗，篩選出氯霉素、復(fù)方新諾明等敏感藥物，為科學(xué)指導(dǎo)養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中的細(xì)菌病防治提供了一定依據(jù)。