兩種給藥途徑土霉素殘留在鯽魚體內(nèi)的消除規(guī)律

兩種給藥途徑土霉素殘留在鯽魚體內(nèi)的消除規(guī)律

郭海燕1,2，張其中2,3，李雪梅2

（1.重慶市水產(chǎn)科學(xué)研究所；2.西南大學(xué)生命科學(xué)院；3.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

摘要 本文探討了在肌肉注射和口灌給藥方式下土霉素殘留在鯽魚組織內(nèi)的消除情況。結(jié)果表明：鯽魚肌肉注射和口灌給藥后土霉素在體內(nèi)的最大濃度依次是：肌肉4.636mg/kg和2.869mg/kg，血液5.467mg/kg和3.112mg/kg，肝臟7.165mg/kg和5.086mg/kg，腎臟8.308mg/kg和5.017mg/kg；肌肉注射第288h時(shí)除腎臟中的土霉素濃度仍然高達(dá)0.375mg/kg，其他組織中已經(jīng)檢測(cè)不到土霉素的存在，而口灌給藥第288h時(shí)肌肉、血液、肝臟、腎臟中土霉素的濃度依次為：0.133 mg/kg，0.237mg/kg，0.272mg/kg，0.272mg/kg。因此，在（10±1）℃水溫條件下，以劑量50mg/kg魚體重單次給藥，肌肉注射各組織內(nèi)的藥物濃度比口灌給藥高，口灌給藥消除速度比肌肉注射慢。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果建議在（10±1）℃以上水溫條件下，無(wú)論肌肉注射還是口灌給藥，建議第12天以后捕魚食用是安全的。

關(guān)鍵詞 土霉素；殘留；消除；鯽魚

在魚類防病治病中，土霉素（Oxytetracycline, OTC）因價(jià)格低廉、抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)應(yīng)用尤為廣泛。隨著此類藥物的廣泛應(yīng)用，其殘留對(duì)環(huán)境衛(wèi)生和公眾健康的潛在危害已成為嚴(yán)重問題。最常見的四環(huán)素類不良作用有皮膚損傷和光敏性皮炎，免疫抑制影響，能導(dǎo)致肝損害，長(zhǎng)期使用會(huì)使細(xì)菌的抵抗力增強(qiáng)等等。所以，魚產(chǎn)品中的藥物殘留已成社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。當(dāng)前對(duì)土霉素含量的檢測(cè)方法多采用高效液相色譜法，但由于儀器昂貴，難以在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣，本研究建立了用紫外分光光度法檢測(cè)鯽魚體內(nèi)土霉素殘留的快速檢測(cè)方法，該法操作簡(jiǎn)便、快速、回收率高、重現(xiàn)性好。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)用魚

健康鯽魚(Carassius auratus)，由重慶北碚漁民提供，體重（70±6）g。實(shí)驗(yàn)前馴化兩周，每日換水，投喂餌料、浮萍，水溫為（10±1）℃。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

土霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.5%，中國(guó)獸藥監(jiān)察所生產(chǎn)；土霉素片，西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)（2003）030406；磷酸氫二鈉（A.R）、三氯乙酸（A.R）、三氯甲烷（A.R）、正已烷（A.R）；紫外分光光度計(jì)UV－240、勻漿機(jī)、離心機(jī)、電子天平、冰箱。

1.2提取液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

提取液的配制：稱取磷酸氫二鈉3.58g溶于500ml水中配成0.02mol/L的溶液，再將4.0g三氯乙酸溶于100ml0.02mol/L的磷酸氫二鈉溶液即為4%的提取液（臨用前配制）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將25.0mg的OTC標(biāo)準(zhǔn)品，溶于250ml提取液中，配成100μg/ml的母液。

1.3方法

1.3.1給藥方法及采樣

將實(shí)驗(yàn)用魚分為兩組，分別以土霉素肌肉注射一次和口灌給藥一次，劑量為50mg/kg。在給藥后第0h，0.5h，1h，2h，4h，8h，16h，32h，48h，72h，144h，288h，各取樣一次，在每一時(shí)間點(diǎn)取血液、肌肉、肝臟、腎臟，每次3－4條魚。

將鯽魚側(cè)臥固定，破壞腦脊髓，尾靜脈取血，收集血樣。待血液凝固后，分離出血清，吸取1ml，-20℃保存。取血后，快速取肝臟、腎臟、軀體兩側(cè)背鰭附近的肌肉各1g，充分剪碎，-20℃保存。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用4%的提取液稀釋土霉素標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別制成0μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用分光光度計(jì)測(cè)定OD值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.3樣品處理

樣品解凍后，依次加入1ml的三氯甲烷和2ml4%三氯乙酸的磷酸氫二鈉提取液，10000r/min勻漿2min，用2ml提取液清洗刀頭，合并提取液，振蕩1min，5000r/min（肝臟樣品為8000r/min）離心10min。取全部上清液，用正已烷去脂肪后同樣條件下離心，取上清液，再次去脂肪，充分混合后靜置，取其下層澄清液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定360nm處的OD值。

1.4方法的可靠性評(píng)價(jià)

1.4.1樣品中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)OD值影響的測(cè)試

實(shí)驗(yàn)分兩組，一組在4ml提取液中加入OTC標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，另一組把相同的標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml分別加到含有4ml提取液的血液、肝臟、腎臟、肌肉組織中，每種組織測(cè)定10個(gè)樣品，兩組都按1.3.3樣品處理方法處理，用沒加土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取液作為對(duì)照，測(cè)定OD值。

1.4.2 回收率的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分兩組，一組將空白組織（血液、肝臟、腎臟、肌肉）0.5ml或g依次加入1ml濃度為5μg/ml、10μg/ml、15μg/mlOTC標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品處理方法處理；另外一組將同樣量的空白組織先按樣品處理方法處理，再加入1ml濃度為5μg/ml、10μg/ml、15μg/mlOTC標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定OD值。同樣的步驟重復(fù)三次。按回收率計(jì)算公式計(jì)算：

回收率（%）＝（處理前加入標(biāo)液樣品的測(cè)定值/處理后加入標(biāo)液樣品的測(cè)定值）*100%

2 結(jié)果

2.1 土霉素標(biāo)準(zhǔn)濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，在0～25μg/ml范圍內(nèi)，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：Y=0.00116+0.02887X， R=0.99981。

2.2 肌肉注射和口灌給藥組織中OTC濃度分析

鯽魚肌肉注射第0h時(shí)各組織中檢測(cè)不到藥物，第0.5h可以檢測(cè)到，肌肉、血液、肝臟、腎臟中土霉素的濃度依次是：0.029mg/kg，0.687 mg/kg，0.341mg/kg，0.202mg/kg；血液、肝臟、腎臟第8h時(shí)、肌肉第16hOTC濃度達(dá)到最大值，依次是：5.467 mg/kg，7.165mg/kg，8.308mg/kg，4.636 mg/kg；隨后各組織中OTC的濃度逐漸下降，而肝臟中的OTC濃度在32h~72h之間時(shí)有一個(gè)回升；第288h時(shí)腎臟中的OTC濃度為0.375 mg/kg，其它組織中已檢測(cè)不到OTC的存在（如圖1）。

鯽魚口灌給藥第0h時(shí)各組織中檢測(cè)不到藥物，第0.5h的肌肉中仍然檢測(cè)不到OTC的存在，血液、肝臟、腎臟中OTC濃度依次為：0.029 mg/kg，0.098mg/kg，0.168mg/kg；肌肉、血液、肝臟第16h、腎臟第32hOTC濃度達(dá)到最大值，依次為：2.869mg/kg，3.112mg/kg，5.086mg/kg，5.398mg/kg；隨后肌肉、血液、腎臟中OTC的濃度逐漸下降，而肝臟中的OTC濃度在32-48h之間有一個(gè)回升；第288h時(shí)肌肉、血液、肝臟、腎臟中OTC的濃度依次為：0.133mg/kg，0.237mg/kg，0.272mg/kg，0.272mg/kg（如圖2）。

3.討論

3.1檢測(cè)方法可靠性分析

3.1.1土霉素分子結(jié)構(gòu)分析

土霉素分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)共軛雙鍵系統(tǒng)，具有吸收紫外光的特點(diǎn)。這是能用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

3.1.2樣品中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)OD值影響的測(cè)試

記錄測(cè)定的空白提取液（未加血液或任何其它組織在內(nèi)）、肌肉加提取液、血液加提取液、肝臟加提取液、腎臟加提取液之間的OD值，用T檢驗(yàn)法分別對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，得到的結(jié)果分別為：P1=0.288、P2=0.219、P3=0.091、P4=0.090， P1、P2、 P3 、P4 值均大于0.05，表明不加任何組織的提取液的OD值和加入了組織的提取液的OD值間差異不顯著。

3.1.3回收率的測(cè)定

用5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml的OTC標(biāo)準(zhǔn)溶液分別測(cè)定在血液、肌肉、肝臟、腎臟中的平均回收率，分別為：81.43%，81.90%，79.29%，81.60%，都接近80%，表明平均回收率高且穩(wěn)定。

3.2鯽魚對(duì)土霉素的分布和吸收

土霉素在鯽魚體內(nèi)分布較廣，能迅速地分布到各組織中。肌肉中最遲檢測(cè)到OTC的存在，并且肌肉中的OTC濃度明顯低于肝臟、腎臟中的OTC濃度，這與以前的研究結(jié)果是一致的。這種現(xiàn)象是由不同組織中血液循環(huán)速度不同引起的，血液在肝臟、腎臟等組織中的循環(huán)速度較快，在肌肉等組織中循環(huán)速度較慢，因此藥物分布至肌肉的速度也較慢。

鯽魚肌肉注射后第0.5h時(shí)肌肉中可以檢測(cè)到OTC，口灌給藥后第0.5h時(shí)肌肉中未檢測(cè)到OTC的存在，肌肉注射后相應(yīng)的血液、肝臟、腎臟中OTC濃度比口灌給藥后要高；肌肉注射后血液、肝臟、腎臟中第8h、肌肉中第16h時(shí)OTC濃度達(dá)到最大值，口灌給藥后肌肉、血液、肝臟第16h 時(shí)、腎臟第32h 時(shí)OTC濃度達(dá)到最大值?？梢?，肌肉注射鯽魚對(duì)土霉素的吸收比口灌方式快。

本實(shí)驗(yàn)是對(duì)兩種不同給藥方式下土霉素在鯽魚血液和各組織中濃度的檢測(cè)，所得的具體數(shù)據(jù)雖有所不同，但土霉素在肝臟中OTC的吸收都存在著重吸收現(xiàn)象，這與李美同和田中二良等的研究結(jié)果相似。

3.3土霉素在鯽魚體內(nèi)的消除和殘留

鯽魚肌肉注射各組織內(nèi)的OTC濃度比口灌給藥高。肌肉注射和口灌給藥后土霉素在體內(nèi)的最大濃度依次是：肌肉4.636mg/kg和2.869mg/kg，血液5.467mg/kg和3.112mg/kg，肝臟7.165mg/kg和5.086mg/kg，腎臟8.308mg/kg和5.017mg/kg；口灌給藥土霉素消除速度比肌肉注射要慢，肌肉注射第288h時(shí)除腎臟中的OTC濃度仍然高達(dá)0.375mg/kg，其它組織中已經(jīng)檢測(cè)不到OTC的存在，口灌給藥第288h時(shí)肌肉、血液、肝臟、腎臟中的濃度依次為：0.133mg/kg，0.237mg/kg，0.272mg/kg，0.272mg/kg。

藥物往往因?yàn)樵谘褐械难h(huán)途徑不同，影響到以后的分布和消除，這方面主要取決于是否通過肝臟。口灌藥物時(shí)因吸收的藥物全從腸壁進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，故首次循環(huán)要經(jīng)過肝臟；肌肉注射時(shí)首次循環(huán)不經(jīng)肝臟而直接進(jìn)入體循環(huán)[13]。藥物受肝臟首過作用后，進(jìn)入體循環(huán)的有效藥物量相對(duì)肌肉注射較少；此外，可能口灌給藥的藥物吸收也不完全。因此，肌肉注射各組織內(nèi)的藥物濃度比口灌給藥途徑的高。

水溫是影響藥物代謝的重要因素。本實(shí)驗(yàn)在（10±1）℃水溫條件下完成，溫度較低，實(shí)驗(yàn)魚新陳代謝較高溫下慢，藥物代謝速度也慢，所得殘留消除時(shí)間應(yīng)比高于這一溫度的時(shí)間長(zhǎng)。所以，以這一時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)制定起捕前的休藥期是安全的。

我國(guó)農(nóng)業(yè)部[1994]和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織[FAO1991]規(guī)定OTC的最高殘留限量（Maximum residue limit, MRL）在魚肉中為0.1mg/kg，魚肝為0.3mg/kg。本次研究結(jié)果表明在（10±1）℃水溫條件下，以劑量50mg/kg魚體重單次給藥，肌肉注射第144h（6天）時(shí)，除肝臟中的含量仍然偏高外，其它組織中OTC的含量已經(jīng)較低；口灌給藥第288h（12天）時(shí)肌肉中仍然有少量殘留。因此，在（10±1）℃以上水溫條件下，無(wú)論注射還是口灌給藥，建議第12天以后捕魚食用是安全的。