水產(chǎn)動物染色體操作育種研究進(jìn)展

水產(chǎn)動物染色體操作育種研究進(jìn)展

陳小慧，王 中，江會杰，韓奮杰，張偉杰

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023)

染色體操作是為了快速獲得經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良，通過人為手段改變有性生殖生物原有的染色體組的技術(shù)，主要包括人工誘導(dǎo)多倍體、雌核發(fā)育和雄核發(fā)育等。染色體操作育種作為細(xì)胞工程和現(xiàn)代遺傳育種的重要組成部分，已成為提高水產(chǎn)動物育種效率的最有發(fā)展前景的生物技術(shù)之一。

近年來，隨著人們對水產(chǎn)動物綜合價(jià)值利用的重視程度的不斷提高以及水產(chǎn)動物相關(guān)加工產(chǎn)品的社會需求量持續(xù)增長，傳統(tǒng)的水產(chǎn)動物養(yǎng)殖品種和養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)不能滿足水產(chǎn)品市場對產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的要求。并且，目前大多水產(chǎn)苗種生產(chǎn)企業(yè)在育苗過程中疏于選擇親本，多代近親繁殖導(dǎo)致的養(yǎng)殖群體種質(zhì)資源退化現(xiàn)象十分嚴(yán)重。種質(zhì)退化使水產(chǎn)動物抗病力下降、成熟個(gè)體小型化、品質(zhì)下降、對環(huán)境的適應(yīng)性和抗逆性降低，如目前養(yǎng)殖大黃魚已經(jīng)普遍出現(xiàn)了生長緩慢，經(jīng)濟(jì)性狀變差，性成熟低齡化，品質(zhì)下降等種質(zhì)退化現(xiàn)象。種質(zhì)退化會導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的降低，制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

為了提高養(yǎng)殖水產(chǎn)動物的生長速度、肉質(zhì)、抗病和抗逆能力，國內(nèi)外研究者致力于利用現(xiàn)代生物技術(shù)培育新品種,在水產(chǎn)動物的染色體研究及染色體操作育種方面取得了較多成效，從染色體水平為水產(chǎn)動物的綜合利用提供了理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。水產(chǎn)動物染色體操作育種的發(fā)展也大力推動了我國水產(chǎn)育種技術(shù)的進(jìn)步。

1 人工誘導(dǎo)多倍體

1.1 人工誘導(dǎo)多倍體的方法

多倍體育種是通過增加染色體組的方法來改造生物的遺傳基礎(chǔ)，從而培育出符合要求的優(yōu)良品種。相對于同種的二倍體，多倍體往往具有個(gè)體大、產(chǎn)量高、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。多倍體誘導(dǎo)及其生產(chǎn)性能研究一直是水產(chǎn)養(yǎng)殖研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[1]。目前，多倍體育種技術(shù)在魚類、貝類、甲殼類等水產(chǎn)動物育種中已取得了一些成就。誘導(dǎo)水產(chǎn)動物多倍體產(chǎn)生的方法主要有物理方法(包括靜水壓誘導(dǎo)[2]、溫度休克誘導(dǎo)法[3])、化學(xué)藥物誘導(dǎo)方法(細(xì)胞松弛素B(CB)[3]、6-二甲基氨基嘌呤(6- DMAP)[4]、咖啡因[5]等誘導(dǎo))和生物方法(遠(yuǎn)緣雜交[6])。

國內(nèi)外已先后報(bào)道過利用溫度休克的方法對黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[7]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[8]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[9]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[10]，以及牙鲆(Paralichthysolivaceus)[11]、真鯛(Pagrosomusmajor)[12]誘導(dǎo)三倍體。Li等[13]、張曉軍[14]和FastandWyban[15]利用溫度休克方法分別誘導(dǎo)中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、斑節(jié)對蝦(PenaeusmonodonFabricius)和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)多倍體。Chourrout[16]采用靜水壓法誘導(dǎo)出了虹鱒的三倍體。桂建芳等[17]誘導(dǎo)出水晶彩鯽三倍體胚胎。除此之外，也有報(bào)道大黃魚(Larimichthyscrocea)[18]、牙鲆[19]、舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[20-21]、庸鰈(Hippoglossushippoglossus)[22]、銀大馬哈魚、黃鱸(Diploprionbifasciatum)利用靜水壓方法誘導(dǎo)出三倍體胚胎[12]。靜水壓法較適用于卵徑較大的水產(chǎn)生物，在貝類方面，靜水壓方法應(yīng)用不多，僅在皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[23]、悉尼巖牡蠣(Saccostreacommercialis)[24]、太平洋牡蠣(Crassostreagigas)[3]等貝類有所報(bào)道。

CB在魚類及其他水產(chǎn)動物中應(yīng)用較少，而在貝類和甲殼類水產(chǎn)動物雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)中應(yīng)用較為常見，目前已在長牡蠣(Crassostreagigas)[25]、僧帽牡蠣(Ostreacucullata)[26]、海灣扇貝(Argopectenirradians)[27]、華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)[28]中有較高的誘導(dǎo)效果。近年來，在蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、泥蚶(TegillarcagranosaLinnaeus)、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)、皺紋盤鮑多倍體育種方面也有較新進(jìn)展[1]。利用CB，包振民等[29]也誘導(dǎo)出中國明對蝦三倍體，陳立僑[30]等誘導(dǎo)出中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)三倍體，相建海等[31]誘導(dǎo)出中國明對蝦四倍體胚胎，崔朝霞[32]誘導(dǎo)出中華絨螯蟹的四倍體胚胎。6-DMAP在魚類中應(yīng)用較少，主要應(yīng)用在貝類誘導(dǎo)多倍體中，在蝦蟹和棘皮動物方面也有見報(bào)道。貝類中利用6-DMAP誘導(dǎo)蝦夷扇貝[33]、太平洋牡蠣[4-34]、櫛孔扇貝[26]、縊蟶[35]、泥蚶[36]等的三倍體。在蝦蟹方面， Xiang等[37]、Coman等[38]、崔朝霞等[39]分別利用6-DMAP誘導(dǎo)出中國明對蝦、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)、中華絨螯蟹的三倍體。Sellars等[40]、崔朝霞等[32]分別誘導(dǎo)出日本囊對蝦和中華絨螯蟹四倍體。

生物學(xué)方法是通過物種種間或者種內(nèi)的雜交方法，進(jìn)而獲得多倍體的手段。此方法在魚類中應(yīng)用的比較多，如劉少軍等[41]用不同倍性的團(tuán)頭魴和黃尾密鲴進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，獲得不同倍性的魴鲴與鲴魴，同樣的方法應(yīng)也用在紅鯽與黃尾密鲴，紅鯽與翹嘴紅鲌中。但是在貝類、蝦蟹類應(yīng)用的較少，棘皮動物中未見報(bào)道。如圖1所示，是荒井克俊[42]以貝類為例所總結(jié)出人工誘導(dǎo)多倍體的原理示意圖。

目前研究有效誘導(dǎo)獲得水產(chǎn)動物四倍體的技術(shù)，是染色體組操作研究的熱點(diǎn)。以往研究表明，四倍體的誘導(dǎo)率很低，但是，如果能夠獲得少量的可育四倍體，再通過交配就可獲得一個(gè)四倍體群體，盡管這種四倍體群體只具有很窄的遺傳基礎(chǔ)，仍可為生產(chǎn)三倍體提供物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物技術(shù)，染色體操作育種可以有更進(jìn)一步的發(fā)展和應(yīng)用。

圖1 水產(chǎn)動物(貝類)人工誘導(dǎo)多倍體原理

1.2 檢測多倍體的方法

1.2.1 染色體制備法 傳統(tǒng)的染色體制備原理是使分裂的細(xì)胞停止在中期，破膜以后平鋪在載玻片上，吉姆薩染色觀察。首先在制備染色體的選材方面，魚類[43-44]染色體制備所用的組織主要有鰓絲、腎、鰭條、血液、受精卵、胚胎等。貝類[45]一般選擇胚胎制作染色體,但胚胎的獲取受繁殖季節(jié)限制,成貝也用鰓細(xì)胞制作染色體[46]。蝦類[47]、海膽類[48]以早期胚胎為染色體制備的首選材料。染色體制備的步驟首先是秋水仙素處理，讓染色體停止在細(xì)胞分裂中期，然后用低濃度溶液低滲，一般選擇KCl溶液，或者檸檬酸鈉溶液，低滲的目的是為了讓細(xì)胞膨大，染色體分開不相互重疊，然后用預(yù)冷的卡諾固定液固定以后-20 ℃冰箱過夜就可滴片。滴片后吉姆薩染液染色，直接鏡下觀察。圖2所示是李霞等[49]通過該實(shí)驗(yàn)方法獲得二倍體泥鰍細(xì)胞的染色體及核型。通過染色體制備來確定水產(chǎn)動物的倍性更直接，準(zhǔn)確、有說服力，但是相應(yīng)的制作過程比較麻煩，并且如何快速、簡便地獲得形態(tài)好，分裂指數(shù)高的染色體，也需要一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)支持。

圖2 二倍體泥鰍染色體及核型分析

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測法 流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)現(xiàn)代化DNA倍性分析的高新技術(shù)，通過對細(xì)胞的光散射和不同熒光的多參數(shù)同步測定，可對單細(xì)胞的生物DNA倍性進(jìn)行快速、精確的定性和定量分析。流式細(xì)胞儀主要由液流系統(tǒng)、光學(xué)檢測系統(tǒng)和信號處理系統(tǒng)組成。DNA倍性分析的基本原理是將經(jīng)特異性熒光染料染色的待測樣品制成單細(xì)胞懸液，在氣壓推動下進(jìn)入流動室，通過激發(fā)光源照射可激發(fā)經(jīng)熒光染色DNA分子促發(fā)熒光，測定熒光強(qiáng)度，與測定裝置相連的計(jì)算機(jī)分析軟件可對熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。通過流式細(xì)胞分析儀對大量的處于分裂間期的細(xì)胞 DNA含量進(jìn)行檢測，然后經(jīng)與儀器連接的計(jì)算機(jī)自動統(tǒng)計(jì)分析，最后繪制出 DNA含量 (倍性)的分布曲線圖[50]。在實(shí)際測量水產(chǎn)動物倍性的時(shí)候，選擇一個(gè)已知倍性的同類材料作為參考，將峰的位置設(shè)定在相應(yīng)位置，然后將待測樣品峰出現(xiàn)的位置與其比較，就能準(zhǔn)確知道待測樣品的DNA含量，然后就能快速得到待測樣品的倍性。圖3所示是陳春山等[51]通過Pactec CyFlow Cube 8 型流式細(xì)胞儀檢測魚苗血液DNA相對含量的方法確定三倍體倍化率示意圖。

如今，由于流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞核DNA含量的精確度高，通過比較細(xì)胞核 DNA含量來鑒定倍性的可靠性比間接鑒定更為準(zhǔn)確，并且測量一個(gè)樣只需要短短幾分鐘的時(shí)間，因此越來越多的科研人員選擇在倍性檢測中使用流式細(xì)胞術(shù)。

圖3 二倍體和三倍體細(xì)鱗鮭相對含量

2 雌核發(fā)育

雌核發(fā)育技術(shù)一般是指采用物理、化學(xué)方法滅活精子，滅活后的精子與正常的卵子授精，精子起到刺激作用，精核不與卵核融合形成合子，胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳的控制下進(jìn)行的一種發(fā)育方式。

雌核發(fā)育在魚類育種中已經(jīng)取得了很大的成就，由于不少魚類在生長和個(gè)體大小等重要經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)出顯著的性別異形，例如鯉魚[52]、牙鲆[53]、虹鱒[54]、大西洋鮭[55]、半滑舌鰨[56]、金錢魚[57]等都是雌性個(gè)體較大的養(yǎng)殖魚類。王延暉等[58]也證明了雌性黃河鯉魚較雄性黃河鯉魚生長速度快，個(gè)體大，并且正常黃河鯉魚在自然生長過程中的繁殖會消耗大量能量，影響生長，因此開展雌核發(fā)育實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)全雌群體對黃河鯉魚的生產(chǎn)有積極的影響。因?yàn)橛酗@著經(jīng)濟(jì)性狀的優(yōu)勢，相比蝦蟹，貝類、棘皮動物、魚類育種研究中要更加深入，并且很多魚類雌核發(fā)育的品種已經(jīng)做到了產(chǎn)業(yè)化，投入到了生產(chǎn)之中。比如牙鲆、方正銀鯽已經(jīng)成為雌核發(fā)育技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)的代表性魚類。人工雌核發(fā)育草魚制成的雜交抗病苗種已投入商品生產(chǎn)階段，生產(chǎn)出的苗種抗病力強(qiáng)，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。而在貝類、棘皮動物中，齊明君等[59]報(bào)道過紫貽貝雌核發(fā)育二倍體的相關(guān)研究,商文聰?shù)萚60]通過電刺激誘導(dǎo)櫛孔扇貝雌核發(fā)育，并得到了單倍體胚胎。丁君等[61]初步研究過中間球海膽雌核發(fā)育單倍體胚胎，曹學(xué)彬等[62]研究過馬糞海膽雌核發(fā)育的早期胚胎，聶鴻濤等[63]對刺參雌核發(fā)育二倍體進(jìn)行過相關(guān)報(bào)道。圖4是范兆延[64]總結(jié)出雌核發(fā)育二倍體人工誘導(dǎo)原理示意圖。

圖4 雌核發(fā)育二倍體人工誘導(dǎo)的原理

3 雄核發(fā)育

雄核發(fā)育是指遺傳失活的卵子與精子受精,產(chǎn)生的后代僅含有父本遺傳物質(zhì)個(gè)體的繁殖方式。雄核發(fā)育可以通過人工誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)，方法通常使用紫外線、X射線、γ射線等物理方法處理的卵子，使其失活后參與受精，再在適當(dāng)時(shí)間通過冷、熱、高壓等處理使精核的染色體加倍，進(jìn)而發(fā)育成為完全是父本性狀的二倍體。

與人工誘導(dǎo)的雌核發(fā)育相比，人工誘導(dǎo)的雄核發(fā)育個(gè)體生存率更低，雄核發(fā)育在植物育種中應(yīng)用較多，水產(chǎn)動物中僅在魚類有些研究。早在1996年，Corley-Smith等已經(jīng)通過熱休克處理的方法獲得了斑馬魚雄核發(fā)育二倍體。近年來周賀等[65]、Morishima et al.[66]、王玉生等[67]、林忠喬等[68]利用溫度休克的方法分別得到紅鰭東方鲀雄核發(fā)育單倍體、泥鰍的雄核發(fā)育后代、大鱗副泥鰍雄核發(fā)育單倍體、泥鰍雄核發(fā)育二倍體。關(guān)于貝類雄核發(fā)育的研究在國內(nèi)外都很少，僅在蝦夷扇貝[69]、櫛孔扇貝[70]、太平洋牡蠣[71]等物種中有研究，在棘皮動物中未見報(bào)道。

4 總結(jié)與展望

隨著水產(chǎn)動物種質(zhì)退化的現(xiàn)象加劇，優(yōu)質(zhì)新品種的培育需求極為迫切。多倍體所具有的優(yōu)良品質(zhì)符合當(dāng)下及未來水產(chǎn)養(yǎng)殖的需求，而通過染色體操作獲得多倍體是目前獲得多倍體最有效的方法，所以未來的水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)可能會以染色體操作作為常規(guī)育種手段，從而獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)下的染色體操作還未完全成熟，有很多未探索的區(qū)域，多種經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動物的多倍體還未培育成功，若將水產(chǎn)動物染色體操作育種技術(shù)發(fā)展成熟，將會大大提高我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。