魚類重要病毒之分子檢測技術研發(fā)與應用

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本文轉載自《農業(yè)生技產業(yè)季刊》2009年NO.20（有刪改），作者洪健睿、吳鴻程。在水產養(yǎng)殖蓬勃發(fā)展的同時，病害也在困擾著養(yǎng)殖戶們，水產先聲精選此文，結合網絡資料，整理成文，供廣大水產養(yǎng)殖的朋友學習與思考。知識，永遠也不會過時；學習，永遠都不晚。

前言

水產養(yǎng)殖業(yè)者欲偵測種魚、魚卵、稚魚、成魚、飼料及培育環(huán)境是否潛含病毒，政府相關單位監(jiān)測養(yǎng)殖場病毒危害情況時，皆需要有可信的檢測方法，目前實驗技術日新月異，新穎快速的方法不斷進化，檢測診斷之準確性也大幅度提升。以下整理與摘要說明檢測魚類病毒的方法原理及目前研發(fā)的實況。

魚類重要病毒的分子檢測技術

對未知病源體的首次鑒定，通常要依柯霍法測(Koch'spostulates)，培養(yǎng)及純化病源體，若依此法則歷程，所需時間太長，難用于疫情的監(jiān)控。當疾病病源體確定后，后續(xù)的診斷方法已經由科技方法創(chuàng)新，大幅度縮短操作分析時間。在眾多的診斷方法中，病毒引發(fā)魚類疫病之診斷鑒定，主要是鑒別病毒的蛋白質或是遺傳物質（DNA或RNA），檢測技術可分為：血清學檢測技術及分子生物學檢測技術兩類。

一、血清學檢測技術

主要是以病毒的蛋白質為抗原，以免疫學的原理，產生可判識病毒蛋白質的抗體，此類技術亦稱為免疫檢測技術。通常以病毒的結構性蛋白質為抗原，可測定檢體中是否有病毒存在。若要檢測病毒在檢體中是否處于活躍的復制期，常以非結構性蛋白質為抗原。如，神經壞死癥病毒的B2蛋白質（Su,2009；圖一所示）。血清學檢測技術的關鍵性條件，是生產具有特異性抗體，尤其是單株抗體，可增強檢測技術的敏感性及準確性，目前在NNV已有豐碩的研究成果(Shieh,2005)。

當抗體和抗原結合后，為了放大結合訊號利于判讀，其標示的方法，常用的方法為膠金標志法(colloidalgold-labeled)、酵素連結免疫吸附法(enzyme-linkimmunosorbentassay,ELISA)等兩大類及較新穎的免疫磁減量檢測系統(tǒng)。相關說明如下：

1.快速檢測試劑套組(one-stepdiagnosiskit)

此試劑主要是根據(jù)膠金標志，同時配合免疫層析法，所研發(fā)出來的快速診斷法，目前市售的驗孕棒均以此技術制作而成。膠金標志的原理係利用氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液，在靜電作用下形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠金。由于膠金顆粒表面所攜帶負電荷對于蛋白質表面所帶之正電荷具有相當強之吸附能力，可形成非共價結合。當膠金標記物與相對應的蛋白質在結合處大量聚集時，肉眼即可見紅褐色或紫色斑點，因而可用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中。免疫層析法是先將抗體固定在硝化纖維膜上（或是其他材質），使其無法移動而成為固定相，測試時將硝化纖維膜一端浸入液態(tài)待測樣品內，以毛細作用力，將液體吸往固定的抗體區(qū)，配合膠金標志的呈色機制，當有抗體和抗原大量結合時，可在標示區(qū)顯示顏色，達成快速檢測診斷之目的。此試劑具有簡單、快速、專一又便宜的優(yōu)點，適合專業(yè)及非專業(yè)人士操作，且方便于養(yǎng)殖現(xiàn)場使用（齊，2006）。

2.酵素鍵結免疫吸附法(ELISA)

此測定方法是將酵素以化學鍵結方式標記于抗體或抗原上，當相對應之抗體或抗原結合后，形成有酵素標記之免疫復合物，一旦免疫復合物上之酵素遇到相對應之酵素基質，則可將無色之酵素基質催化成有色之產物，放大免疫復合物的訊息，再依據(jù)顏色深淺或有無，進行定量或定性分析。分析時，使用已經固定在96孔盤上的抗體或抗原，形成固定項，加入待測樣品，經結合形成免疫復合物，用水沖洗未能結合的物質，再加入相對的酵素標記抗體或抗原，水洗后加入酵素基質呈色。市售之ELISA試劑套組通常會具備三種基本試劑材料，包括固相的抗原或抗體、酵素標記之抗原或抗體、酵素基質。依據(jù)應用性、樣本之性狀及檢測所需具備之條件，目前設計出各種不同之檢測方法，包括雙抗體三明治法、間接免疫吸附法、競爭法、阻斷法或捕獲法等。ELISA因一次可進行多樣本的分析，適合定量分析，由于實驗結果需要特殊判讀機，常用于實驗室內，不適于養(yǎng)殖現(xiàn)場使用。

3.MagQu的免疫磁減量檢測系統(tǒng)

此系統(tǒng)是將抗體以共價鍵方式結合在MagQu磁量生技公司出品的磁珠上，當磁珠上抗體與病毒結合后，造成個別磁珠聚集，減少磁珠在磁場的旋轉量，稱為免疫磁減量(簡稱IMR)，IMR測定儀中可將微弱的磁訊號轉變?yōu)榭闪繙y的電壓訊息，具相當高的靈敏度。中研院吳金洌特聘研究員與海洋大學呂明偉助理教授，以魚類的神經壞死癥病毒(NNV)，透過磁珠轉動速度來偵測NNV病毒量，可以偵測102TCID50/ml以下的病毒量，顯示此技術具有高度檢測敏感性。此外，進行專一性試驗，此平臺進行胰臟壞死癥病毒及虹彩病毒等兩種病毒檢測，所得之檢測值皆低于背景值，顯示本技術平臺具有可信賴的檢測專一性。

二、分子生物學檢測技術

在魚體初期感染或是健康帶源魚體內，病毒之遺傳物質DNA或RNA的含量不多，不易檢測。1983年KaryB.Mullis博士發(fā)明了聚合酶鏈反應(PCR)技術，開啟了分子生物學的新領域。PCR技術之必備要件包括核酸模版、引子、耐高溫之DNA聚合酶、四種合成鹼基之去氧核糖核苷三磷酸，在可設定溫度循環(huán)參數(shù)之反應儀中，透過高溫將雙股DNA變性成單股，而后降溫讓人工合成之引子得以與模版單股DNA上可配對之鹼基結合，而后再提升至適合DNA聚合酶催化之溫度，催化依模版DNA序列合成互補性DNA。若病毒之遺傳物質為RNA，必須先經過反轉錄(reversetranscription,RT)使RNA變成cDNA(complementDNA)，才進行PCR反應。由于聚合酶鏈反應技術操作簡便、敏感度很高，PCR儀器便迅速普及于一般實驗室，是目前最常用于診斷動物疾病的技術。若要定量病源體含量，通常會配合膠體電泳分析，但合適的PCR循環(huán)次數(shù)卻不易決定。近期以PCR技術為基礎，已發(fā)展出快速精準的即時定量PCR(Real-timePCR)及恒溫圈環(huán)形核酸增幅法(LAMP)等。

1.即時定量PCR

即時定量PCR是利用與DNA結合的特殊螢光染料，當PCR擴增DNA時，DNA會與螢光染料結合，增強螢光強度。經由測定螢光強度，可即時判定DNA含量，整個PCR反應過程中，可完整記錄DNA含量的變化，有別于傳統(tǒng)PCR將DNA增幅放大后，將DNA標定螢光物質，再進行電泳分析并偵測螢光值，進而定量。以即時定量PCR測定石斑魚神經壞死病毒，其偵測靈敏度高于傳統(tǒng)PCR十倍以上（莊，2004）。即時定量PCR的靈敏度高，只要設計專一性核酸引子，在定量方面，其準確性及時效性有很好的表現(xiàn)，但需要特殊儀器且較難攜帶，常用于一般實驗室，不適合野外、魚場使用。

2.微流體即時定量PCR

PCR儀器，主要是提供可調式的溫度控制。若要改善即時定量PCR儀器之可攜帶性，首要條件就是縮小儀器。臺灣電子資訊產業(yè)在全球能獨據(jù)鰲頭，所依據(jù)的就是發(fā)達的微機電系統(tǒng)。微機電系統(tǒng)技術是一種包括光、機、電、材料、控制、化學、生醫(yī)等多重科技整合的技術，利用此制造技術可使產品因微小化而提高其性能、品質、可靠度及附加價值，同時可降低制造成本。成功大學陳宗岳副教授及李國賓特聘教授共同合作，以微機電制程技術，開發(fā)出微型微流體檢測晶片技術，該項技術并已經技轉承虹科技公司。此系統(tǒng)包含微型溫控模組與微流體輸送模組。前者由于感測器及加熱器都整合在PCR晶片的內部，晶片得以快速且準確執(zhí)行溫度的循環(huán)控制，后者整合蠕動式微型氣動幫浦與微管道，提供了生物相容性高及可拋棄性。以微流體晶片系統(tǒng)對神經壞死病毒之RNA片段進行偵測，偵測極限最低濃度可達到每微升10個病毒RNA，若增加螢光偵測模組之偵測極限，2009年的研究雛型儀器最低濃度可達到每微升為1,000個病毒RNA，此項技術，除可將儀器微型化，亦增加系統(tǒng)攜帶性（李，2008）。

3.恒溫圈環(huán)形核酸增幅法(LAMP)

Notomi在2000年研發(fā)出只需一個反應溫度之核酸擴增技術LAMP，并取得該項技術的專利。LAMP具有快速、高專一性及高敏感度之特點，僅需于60-65°C恒溫下反應35分鐘至1小時即可偵測病毒，操作簡單且不需昂貴的設備，適合應用于養(yǎng)殖現(xiàn)場。LAMP所用之DNA聚合酶為具核酸股置換活性的BstDNA聚合酶，在標的DNA片段選取6個區(qū)域，設計成2對專一性的內引子及外引子，藉由聚合酶作用，擴增標的DNA片段，可專一性的偵測特定病毒。因內引子之特殊設計，擴增產物會由許多莖-環(huán)結構的DNA連結，在LAMP反應中，三磷酸去氧核苷酸(dNTP)在進行DNA的合成時，會釋放出磷酸根離子和反應緩沖液內鎂離子，形成白色焦磷酸鎂沉淀，可經由副產物焦磷酸鎂所形成之白色沉淀物或將DNA產物以螢光劑染色，快速以肉眼觀察結果。在RNA病毒方面，需配合可在高溫反應的反轉錄酶(AMVRTase)。LAMP檢測技術，不同于PCR，只需一種操作溫度，不需要有升溫及降溫的動作，因此反應時程也比傳統(tǒng)PCR快，方便養(yǎng)殖現(xiàn)場應用，因此可及早偵測水產生物是否感染病毒，避免引入帶病毒之魚種，并可在養(yǎng)殖期間做好監(jiān)控措施，減少病毒爆發(fā)及疫情擴散。但LAMP引子設計復雜且限制多，是急需突破之瓶頸。目前已應用于許多水產生物，包括石斑魚神經壞死癥病毒檢測(Xu,2009)。

魚類病毒的分子檢測技術研發(fā)方向

魚類病毒的分子檢測技術，主要是利用酵素免疫、化學呈色發(fā)光及分子生物學。而檢測試劑需要下列的要求：(1)準確性：精準及特異性的檢測出標的物質；(2)敏感性：能在標的物質非常稀少情況驗出；(3)穩(wěn)定性：檢驗試劑在長時間存放不易變質；(4)簡易性：儀器簡便，易于攜帶；(5)經濟性：價格便宜，養(yǎng)殖業(yè)者能負擔，便于大量篩選樣本。目前的檢測試劑仍無法完全符合上述條件，但若能針對某些使用者的需求加以研發(fā)，仍大有可為。針對使用對象的需求，可將檢測試劑研發(fā)分為二個方向：

一、養(yǎng)殖現(xiàn)場使用之簡易型

養(yǎng)殖環(huán)境的檢測是防疫的第一線，最好是有生產履歷性的全面檢測，也是最需要快速檢驗的關鍵地方。但養(yǎng)殖現(xiàn)場中沒有研究設備，所以檢測試劑之使用要簡單、快速、便宜、不需要專業(yè)檢驗人員，可隨時隨地檢測，試劑保存容易者為佳。漁業(yè)的檢測通常需要在現(xiàn)場檢測或者立即得到檢測結果，現(xiàn)場使用常以快速檢測試劑套組為主，而快速檢驗試劑套組主要利用免疫技術結合膠金標志，目視即可判斷結果，然而檢體通常并非純物質，所含的夾雜物質易造成非特異性結合之偽反應，使準確性下降，最好能使用單株抗體以提高專一性，所以研發(fā)的重點包括如何生產便宜的單株抗體。免疫磁減量檢測系統(tǒng)，不需用水洗為其特色，若測定儀體積能小型化，則更方便于養(yǎng)殖現(xiàn)場使用。LAMP技術雖然只需要單一溫度設備，亦能應用于養(yǎng)殖現(xiàn)場，但是DNA聚合酶的穩(wěn)定性、多對引子對的設計及螢光染料的價格等，仍有需要改進的空間，目前仍在先導期實驗中。微流體即時定量PCR，以微流體晶片結合螢光偵測模組，將即時定量PCR儀器縮小為可攜帶型，增加其便利性。由于微流體即時定量PCR與LAMP的檢測標的物皆為DNA或RNA，因此須開發(fā)簡易且效果佳的純化套組以搭配使用。

二、實驗室使用

政府、學校、民間研發(fā)單位，有專精的檢驗人員及設備，除了可用上述養(yǎng)殖現(xiàn)場使用之簡易型檢驗試劑外，ELISA及即時定量PCR，因有儀器輔助，故其可檢測之種類相當多，且可用于標的物定量，擴大其使用范圍及精確性。由于遺傳工程、基因重組及單源抗體等技術的不斷研究與發(fā)展，使得研發(fā)期程大幅縮短，實驗室使用產品推陳出新更為迅速。

魚類病毒的分子檢測技術研發(fā)方向

由于石斑魚在魚苗養(yǎng)殖階段，常遭受神經壞死病毒為害，而在成魚則面臨虹彩病毒感染之威脅。朝亞太種苗中心發(fā)展，應建立生產優(yōu)質無病毒魚苗技術，除了在飼育管理外，開發(fā)飼料添加物，將促進生長或用來治療及控制疾病的產品添加入飼料，提升魚抵抗疾病的能力；在環(huán)境管理面，則徹底執(zhí)行養(yǎng)殖場的衛(wèi)生管理，例如養(yǎng)殖場環(huán)境、孵化池和水源消毒等，可以避免病源侵入養(yǎng)殖場的機會（周，2008）。除此之外病毒檢測亦是重要一環(huán)，茲將病毒檢測技術應用性分列如下：

1.篩選無病毒種魚

以PCR進行病毒檢測，去除帶原之種魚，這是生產優(yōu)質無病毒魚苗的第一步，源頭無法控管，將無法帶動無病毒魚苗。

2.篩出病毒帶原魚

臺灣養(yǎng)殖的石斑魚普遍有NNV帶原的現(xiàn)象，帶原現(xiàn)象不只存在于發(fā)過病的殘活魚，也存在看似健康的魚體內。持續(xù)性感染魚可以釋放具感染性的NNV至飼養(yǎng)環(huán)境中，會造成NNV在環(huán)境中的散佈。當魚篩出為病毒帶原魚者，應將殘活魚銷毀，以防疫情擴大。

3.飼育及環(huán)境管理之病毒監(jiān)控

無病毒飼料及環(huán)境的維持是養(yǎng)殖上的一大重點，亦是開發(fā)現(xiàn)場使用病毒檢測套組的主要使用對象，因為養(yǎng)殖業(yè)者需要進行長期且多項目之監(jiān)控。

4.疫病的快速鑒定

當疫病大流行時，病源體鑒定的準確性及時效性相當重要，有效的魚病檢測系統(tǒng)能快速決定藥物治療策略，或將無法治療的病體銷毀，避免疫情擴大。

5.檢疫制度的建立

由疫區(qū)運送往非疫區(qū)的種苗必須嚴格要求提出檢疫證明，藉以防止種苗運送所造成之傳播。檢疫證明須由政府可信任之檢驗單位提出。

6.生產履歷的建立

紀錄種魚、稚魚、成魚等各階段之完整生產過程及病毒監(jiān)控結果，除了可作為優(yōu)質無病毒魚苗的證明外，更可提供消費者最安全的水產品。

魚類病毒的分子檢測技術研發(fā)方向

水產養(yǎng)殖業(yè)要立足臺灣，放眼世界。在WTO前提下，經濟已呈現(xiàn)全球化，臺灣水產養(yǎng)殖應由勞力密集及高度依賴水及土地資源的傳統(tǒng)養(yǎng)殖，進化到以資訊、知識、技術密集的種苗產業(yè)。以種苗為另一個出發(fā)點，建立“優(yōu)質”水產品的形象，以確保臺灣與國際上其他國家水產品之產品區(qū)隔，迅速發(fā)展成為亞太種苗中心。政府依此目標，建立相關政策，由產官學共同參與、推動及落實。在疾病防治方面，由上游學術機構合力研究病因、病源檢測鑒定方法，再技轉民間生產。配合民間推廣單位，如：水產種苗協(xié)會，推進科技及產業(yè)結合，輔導產業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境改善，辦理魚苗品質認證制度，提升整體產品競爭力。魚苗生產業(yè)者，可利用快篩試劑進行魚苗健康之自我監(jiān)控，建立生產履歷；政府衛(wèi)生試驗單位，則執(zhí)行水產動物疾病監(jiān)測工作，長期監(jiān)測養(yǎng)殖場病毒危害情況，了解養(yǎng)殖魚病毒的感染實況。由上而下整合研究科技，由內而外保證魚苗優(yōu)質、無病毒，如此水產養(yǎng)殖產業(yè)將能永續(xù)發(fā)展。