論文：水生動物缺氧誘導因子研究進展

        水生動物缺氧誘導因子研究進展

寧冰玉，鄒雯靜，趙聞卓，康定邦，孫景賢，常亞青，湛垚垚

（大連海洋大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

氧氣是需氧生物進行各項生理活動的必要條件，氧穩(wěn)態(tài)是機體維持正常生命活動的必要條件[1]。在低氧或缺氧條件下，需氧生物的發(fā)育[2]、代謝[3]與免疫[4]等均會受到不同程度的影響，甚至導致炎癥和腫瘤等病理性改變[5]。

缺氧誘導因子（Hypoxia inducible factor，HIF）是一種由α 和β 亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其中α 亞基（HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α）的表達為氧依賴性，而β 亞基（HIF-1β，又稱ARNT）的表達為組成性[5]。自1991 年首次發(fā)現(xiàn)以來，大量研究證實，缺氧誘導因子是需氧生物細胞響應低氧或缺氧脅迫的關(guān)鍵因子[6,7]。通常情況下（常氧狀態(tài)），HIF-α 亞基中的脯氨酸殘基會被脯氨酰羥化酶（Prolyl hydroxylase，PHD）羥基化，隨后，這些羥基化的HIF-α 亞基會在E3 泛素連接酶作用下通過泛素體系降解；當?shù)脱趸蛉毖鯐r，隨著細胞中的PHD活性降低，泛素體系對胞質(zhì)中HIF-α 亞基的降解作用減弱，穩(wěn)定的HIF-α 亞基可通過易位作用進入細胞核，與核內(nèi)的HIF-β 亞基形成異源二聚體，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)許多與炎癥、細胞分化以及細胞增殖相關(guān)的基因（如血管內(nèi)皮生長因子和促紅細胞生成素等）的相對表達，幫助機體適應或應對低氧或缺氧脅迫[5]（圖1）。

與陸生環(huán)境相比，水生動物賴以生存的水環(huán)境中的溶解氧濃度約為8～9 mg·L-1（20℃）遠低于大氣中的氧含量（約300 mg·L-1），且會隨著水流、溫度以及季節(jié)等因素的變化而波動[8]。因此，水生動物與陸生動物相比，可能更為頻繁地遭遇缺氧脅迫。缺氧不僅影響水生動物的攝食、生長與繁殖[1]，還影響水生動物的免疫防御能力[6,7]。水體缺氧可顯著抑制挪威海鰲蝦（Nephrops norvegicus）的攝食量[9]；當水體溶解氧濃度為2.6 mg·L-1時，紅大馬哈魚（Oncorhynchus nerka）基本不能生長[2]；缺氧也會導致軟口魚（Chondrostoma nasus）的胚胎存活率和孵化率顯著下降[10]。

關(guān)于水生動物缺氧誘導因子的相關(guān)研究最早可以追溯到21 世紀初，目前已在軟體動物（Mollusks）、節(jié)肢動物（Arthropods）、棘皮動物（Echinoderms）和魚類中取得了一定的研究成果[6,7]。本文通過綜述近年來水生動物缺氧誘導因子各亞基的序列特征、進化特點及其生物學功能，旨在系統(tǒng)梳理水生動物中缺氧誘導因子的相關(guān)分子生物學數(shù)據(jù)，為深入了解和掌握水生動物中缺氧誘導因子的生物學功能提供基礎(chǔ)。

1 水生動物缺氧誘導因子的序列特征及系統(tǒng)發(fā)育特點

按照功能的不同，水生動物中的缺氧誘導因子家族可分為4 種亞基，分別為HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α 和HIF-1β。截至2021 年6 月，在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中登陸的水生動物的缺氧誘導因子全長氨基酸序列為380 條，其中，HIF-1α 占62%（234 條）、HIF-2α 占4%（17條）、HIF-3α 占3%（10 條），HIF-1β 占31%（119條）。比較發(fā)現(xiàn)，水生動物中的缺氧誘導因子4 種亞基的全長為100～1 571 個氨基酸（aa），其中，HIF-1α 的全長為100～1 571 aa，其中絕大部分（700 aa 左右）比大多數(shù)陸生動物（800 aa 左右）短；HIF-2α 的全長為684～1 058 aa，大多與陸生動物（866～874 aa）相近；HIF-3α 的全長為249～643 aa，與陸生動物（333～692 aa）相近；HIF-1β 的全長為150～1 691 aa，其中99%（不超過781 aa）比陸生動物（776～886 aa）短。

通過Pfam 在線服務（http://pfam.xfam.org/）對4種陸生動物和20 種水生動物的缺氧誘導因子（表1）進行保守結(jié)構(gòu)域分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，在魚類中，除了鱖（Siniperca chuatsi）的保守結(jié)構(gòu)域與陸生動物的相同外，絕大多數(shù)魚類比陸生動物缺少PAS 蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Per-Aart-Ser Protein Binding Domain，PAS）。值得注意的是，大西洋鮭（Salmo salar）的HIF-1α中存在PAS 11 結(jié)構(gòu)域，而PAS 3 結(jié)構(gòu)域和HIF-1α C 末端反式結(jié)合結(jié)構(gòu)域（HIF-1α C terminal transactivation domain，HIF-1α CATD）均不存在。在貝類中，除太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的HIF-1α 保守結(jié)構(gòu)域與陸生動物相同外，其余種類的種間變異較大，其中，與陸生動物相比，赤貝（Anadara broughtonii）的HIF-1α 中存在PAS 11 結(jié)構(gòu)域，PAS 3 結(jié)構(gòu)域和HIF-1α CATD 結(jié)構(gòu)域均不存在。蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）和雜色鮑（Haliotis diversicolor）的HIF-1α 中存在HLH-DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Helix-loop-Helix DNA Binding Domain，HLH），而HIF-1α CATD 結(jié)構(gòu)域不存在。與陸生動物相比，甲殼類動物的HIF-1α 中存在PAS11 結(jié)構(gòu)域，缺少了HIF-1 結(jié)構(gòu)域、PAS3 結(jié)構(gòu)域和HIF-1α CATD結(jié)構(gòu)域。對HIF-2α 保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果顯示，魚類的HIF-2α 比陸生動物的HIF-2α 多了PAS結(jié)構(gòu)域。對HIF-1β 保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果顯示，本研究中所選物種中HIF-1β 的保守結(jié)構(gòu)域均相同，這也從側(cè)面反映出HIF-1β 在物種進化上的高度保守性。

對3 種陸生動物和15 種水生動物缺氧誘導因子的α 亞基（表1）進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，所有物種的HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α 分別優(yōu)先聚支，提示，HIF-α 不同亞基間的分化較早。但是，大西洋鮭的HIF-1α 優(yōu)先與其他脊椎動物的HIF-3α 聚支，而與HIF-1α 的進化距離較遠。大西洋鮭的HIF-1α 序列較短，可能缺少部分氨基酸，因此，還需要更多的研究來完善大西洋鮭中缺氧誘導因子的系統(tǒng)發(fā)育信息。脊椎動物的HIF-1α和HIF-2α 優(yōu)先聚支，具有較近的親緣關(guān)系，而HIF-3α 則單獨聚支，與HIF-1α 和HIF-2α 親緣關(guān)系較遠，提示，HIF-1α 和HIF-2α 在進化過程中相對保守。

表1 NCBI 數(shù)據(jù)庫中常見水生動物HIF 家族成員氨基酸序列統(tǒng)計及用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的氨基酸序列信息（截至2021 年6 月）Tab.1 Statistics on the amino acid sequence and amino acid sequence information for domain analysis and constructing phylogenetic tree of HIF family members in common aquatic animals in NCBI database（by June 2021）

對4 種陸生動物和13 種水生動物缺氧誘導因子的β 亞基（表1）進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖3）發(fā)現(xiàn)。不同物種的HIF-1β 優(yōu)先聚支，提示，HIF-1β 亞基在不同物種中具有明顯差異。其中貝類動物中雙殼綱的物種優(yōu)先聚支，說明在雙殼綱中可能出現(xiàn)單系發(fā)育現(xiàn)象。

2 水生動物中缺氧誘導因子的生物學功能

2.1 維持機體氧穩(wěn)態(tài)

維持水生動物體內(nèi)的氧穩(wěn)態(tài)是缺氧誘導因子的基本生物學功能。研究顯示，缺氧誘導因子家族成員在氧氣可利用性變化過程中，對細胞和系統(tǒng)氧穩(wěn)態(tài)主要起調(diào)節(jié)器作用[11]。Chen 等[11]的研究證實，棲息于氧氣較稀薄（DO：2 mg·L-1）的高原魚硬刺高原鰍（Triplophysa scleroptera）的心臟、肝臟、大腦、脾臟、腎臟五個主要器官中的HIF-1α 蛋白水平顯著高于生活于常氧（300 mg·L-1）狀態(tài)下的大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus），表明高原魚體內(nèi)缺氧誘導因子含量高的原因可能與選擇壓力下hif-1α 轉(zhuǎn)錄活性的顯著增強有關(guān)。在缺氧條件下，鯽體內(nèi)的HIF-1α 蛋白水平升高，處于缺氧條件下鯽鰓表面積與比常氧狀態(tài)下的對照組增大了7.5 倍，提示，HIF-1α 可能參與缺氧條件下鯽鰓的形態(tài)改變過程，使生物適應缺氧環(huán)境[12]。還有研究顯示，當受到不同程度缺氧脅迫時，太平洋鯡（Clupea pallasii）、河鱸（Perca fluviatills）、歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）等水生動物肝臟中的hif-1α 的相對表達量均呈現(xiàn)顯著增加趨勢，表明魚類肝臟中的hif-1α 具有作為環(huán)境缺氧生物標志物的應用潛力[13]。

2.2 調(diào)節(jié)機體的免疫與應激反應

除了調(diào)節(jié)機體氧穩(wěn)態(tài)外，HIF-1 在水生動物響應病害侵染及應激源的免疫防御過程中也發(fā)揮調(diào)控作用。在響應病毒感染方面，鱖HIF-1α 的過量表達可抑制鱖虹彩病毒（Mandarin fish ranavirus，MRV）和鱖彈狀病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCARV）感染鱖仔魚細胞系細胞（Mandarin fish fry-1，MFF-1）的過程，而敲低hif-1α 則可增加鱖感染上述兩種病毒的機率[14]。Xu 等[3]發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，草魚（Ctenopharyngodon idella）鰓中的hif-1α和Toll 樣受體4（Toll Like Receptor 4，TLR4）的相對表達量均呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢。TLR4 通過識別并結(jié)合相應病原微生物表面的病原模式相關(guān)分子誘導某些免疫效應分子（如炎性細胞因子）表達[15]，因此，Xu 等[3]提出草魚中的hif-1α 可能通過調(diào)控TLR4的表達而參與草魚的免疫防御反應。鯉上皮瘤（Epithelioma papulosum cyprini，EPC）細胞中的hif-1α 具有促凋亡因子的作用[6]，而斑馬魚（Danio rerio）中hif-1α 的活化則可抑制細胞凋亡和細胞自噬，減少中性粒細胞的凋亡，增強斑馬魚的免疫能力[16]。鯉（Cyprinus carpio）感染乳酸乳球菌菌株后48 h內(nèi)，體內(nèi)hif-1 的相對表達量呈高表達，表明hif-1可能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控開關(guān)，調(diào)節(jié)鯉體內(nèi)相關(guān)免疫應答因子的表達以響應乳酸乳球菌的早期感染[4]。

在響應應激源方面，Gong 等[17]發(fā)現(xiàn)，大口黑鱸（Micropterus salmoides）肝臟和脾臟中的hif-1α 可參與由酵母水解物引起的氧化應激反應，通過介導中性粒細胞炎性浸潤，促進大量產(chǎn)生活性氧簇和活性氮簇自由基，增加血漿中超氧化物歧化酶的活性，提高大口黑鱸的抗氧化能力和免疫防御反應。與健康的對照組相比，患高碳酸血癥（Hypercapnia）的塞內(nèi)加爾鰨（Solea senegalensis）頭腎中hif-1的相對表達呈顯著增加趨勢，提示，hif-1 可以作為一種治療魚類高碳酸血癥的分子靶向基因[18]。Fitzgerald 等[19]發(fā)現(xiàn)，hif 的活化和高表達可降低銅等重金屬對斑馬魚胚胎的毒性。

2.3 調(diào)控機體的能量代謝

有研究顯示，缺氧條件下，水生動物體內(nèi)的hif-1 主要通過上調(diào)乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）等關(guān)鍵酶的表達，參與調(diào)節(jié)糖酵解與三羧酸循環(huán)能量代謝過程。Robertson 等[28]發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫時，大口黑鱸體內(nèi)的hif-1α 可作為葡萄糖代謝的主要調(diào)節(jié)因子促進糖酵解代謝[17]。受到缺氧脅迫后，草魚體內(nèi)的hif-1 可通過上調(diào)細胞中3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和異檸檬酸脫氫酶（Isocitrate dehydrogenase，IDH）的含量，調(diào)控草魚體內(nèi)糖的無氧酵解和有氧代謝途徑，促進草魚適應缺氧環(huán)境[3]。厚鰭圖麗魚（Astronotus crassipinnis）在受到低氧脅迫后，也是通過上調(diào)體內(nèi)hif-1α 的表達從而激活并上調(diào)LDH 含量，促進厚鰭圖麗魚的糖酵解代謝[24]。還有研究證實，瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）暴露在缺氧（2 mg·L-1）下，hif-1α 含量上調(diào)，腦和肝臟中的糖酵解關(guān)鍵酶（磷酸果糖激酶，己糖激酶，丙酮酸激酶）的活性和LDH 的含量均呈顯著上升趨勢，而三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶——檸檬酸合酶的含量卻顯著下降，表明在缺氧狀態(tài)下，hif-1α參與調(diào)控瓦氏黃顙魚腦和肝臟中的無氧代謝能力增加，有氧代謝能力下降的過程[25]。在甲殼動物也發(fā)現(xiàn)，處于低氧脅迫條件下（2 mg·L-1）的日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[21]、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）[22]和凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[23]可通過上調(diào)肌肉中hif-1 的相對含量增強LDH 的相對表達，加快體內(nèi)糖酵解的速率以產(chǎn)生更多能量。

2.4 調(diào)控機體發(fā)育

在低氧及缺氧條件下，hif-1 的異常表達可以影響魚類的胚胎發(fā)育。與健康魚相比，患有M74 綜合癥（卵黃囊魚苗死亡率異常高的現(xiàn)象）的大西洋鮭卵黃期仔魚體內(nèi)的hif-1α 靶基因血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）下調(diào)，提示，患M74 綜合癥的大西洋鮭仔魚高死亡率可能與hif-1α 靶向調(diào)控VEGF 有關(guān)[26]。Robertson 等[28]研究顯示，與處于常氧狀態(tài)下的對照組魚相比，生活于低氧狀態(tài)下的斑馬魚胚胎中hif-1α 在各發(fā)育階段始終處于高表達狀態(tài)[27]，而這種胚胎期hif-1 的持續(xù)高表達可能對個體后期的表型形成產(chǎn)生復雜而深刻的影響[28]。

研究證實，hif-1 可參與調(diào)控魚類幼魚或成魚的整體表型、器官形態(tài)及性別分化等。Robertson 等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，斑馬魚hif-1 的激活與幼魚或成魚表型的改變密切相關(guān)，推測斑馬魚幼魚耐缺氧性的增強可能是hif-1 介導的皮膚重塑的結(jié)果。斑馬魚的hif-1 在不同發(fā)育時期，可以通過靶向調(diào)節(jié)不同基因的轉(zhuǎn)錄，而影響斑馬魚的發(fā)育過程[28]。值得注意的是，Robertson 等[28]發(fā)現(xiàn)，與常氧狀態(tài)下的對照組相比，長期生活于低氧條件下的斑馬魚種群中雄性的比例更高，其機制可能是由于受hif-1β調(diào)控的芳香酶（Aromatase，CYP19）的活性受損導致睪丸激素生成增加[29]。因此，有學者指出，hif-1 的異常激活可能會間接破壞發(fā)育過程中類固醇激素的產(chǎn)生[30]。

3 展望

綜上所述，缺氧誘導因子不僅在水生動物應答低氧脅迫中扮演著重要角色，還可反映水生動物遭遇低氧脅迫程度，在環(huán)境保護和養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有作為水質(zhì)監(jiān)測指示分子標記的潛在應用價值。但是，目前水生動物中缺氧誘導因子的研究才剛剛起步，水生動物缺氧誘導因子的序列和結(jié)構(gòu)信息仍不全面、生物功能解析及表達調(diào)控的研究仍相對匱乏，今后應重點開展以下三方面的工作：首先，應大范圍開展水生動物中缺氧誘導因子基因（特別是hif-2α、hif-3α 和hif-1β）的鑒定工作，在全面獲得水生動物缺氧誘導因子基因的序列信息和結(jié)構(gòu)信息的基礎(chǔ)上，進一步梳理和分析水生動物中缺氧誘導因子的系統(tǒng)發(fā)育特點及規(guī)律；其次，充分利用高通量測序和生物信息數(shù)據(jù)分析技術(shù)，深入研究不同水生動物缺氧誘導因子的生物功能，分析和比較不同水生動物缺氧誘導因子表達規(guī)律和代謝調(diào)節(jié)等共性特征以及種屬特異性特征，在此基礎(chǔ)上，從分子互做層面（如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互做、miRNA-mRNA 互做）深入挖掘影響水生動物缺氧誘導因子表達的調(diào)控元件；最后，系統(tǒng)評估水生動物缺氧誘導因子作為水質(zhì)環(huán)境指示物和生物響應缺氧等脅迫指示物的潛在應用價值，探討如何通過調(diào)控水生動物缺氧誘導因子的表達而增強水生動物耐低氧特性的方法。