一種小球藻室外塘口規(guī)模化培養(yǎng)方法

一種小球藻室外塘口規(guī)?；囵B(yǎng)方法

胡佳雯，聶志娟，孫 毅，陳春光，徐 跑，徐鋼春

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無(wú)錫 214081；2.江蘇恒泰環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司，江蘇 無(wú)錫 214124)

小球藻是一種普生性單細(xì)胞真核微藻，生長(zhǎng)繁殖迅速、光合效率高，單位面積光合作用產(chǎn)出率為高等植物的10 倍以上，被譽(yù)為“罐裝的太陽(yáng)”。小球藻體內(nèi)富含高達(dá)總體重58%的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸及維生素等(黃燕娟等，2013)，營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好、無(wú)殘餌污染，是高效、天然、健康的魚(yú)、蝦、蟹、貝類(lèi)幼體優(yōu)質(zhì)的開(kāi)口餌料，也是濾食性魚(yú)和雜食性魚(yú)成體的食物源。通過(guò)光合作用，小球藻不僅產(chǎn)生氧氣供養(yǎng)殖生物利用，還可以高效吸收養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽等對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有毒有害的物質(zhì)，凈化養(yǎng)殖水體(劉梅等，2015)。

本實(shí)驗(yàn)在室外塘口邊采用池塘水進(jìn)行小球藻培養(yǎng)，探究室外環(huán)境下最適的培養(yǎng)條件，建立一種塘口配套小球藻快捷、高效的培養(yǎng)方式，降低成本，提高便利性，推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展。

一、材料與方法

1.材料

實(shí)驗(yàn)藻種選自課題組純化分離的淡水小球藻。實(shí)驗(yàn)用具為容積100 升白色塑料桶、300 目篩絹網(wǎng)、攪拌器、水泵、顯微鏡、魯哥試劑。小球藻培養(yǎng)基配方為無(wú)菌有機(jī)肥5 克/升、維生素C 5.8 毫克/升、硫酸鎂60 毫克/升、檸檬酸6 毫克/升、氯化鈣30 毫克/升、磷酸氫二鉀40 毫克/升、硫酸鋅0.2 毫克/升、氯化錳1.8 毫克/升、碳酸鈉20 毫克/升、納米纖維素15 毫克/升、沼澤紅假單胞菌1×106CFU/毫升。培養(yǎng)水源為室外養(yǎng)殖池塘水。

2.方法

(1)室外塘口培養(yǎng)。水泵抽取養(yǎng)殖池塘水后經(jīng)300目篩絹網(wǎng)過(guò)濾至干凈的培養(yǎng)桶內(nèi)，每升培養(yǎng)水體加10 毫升培養(yǎng)基；調(diào)節(jié)藻種與池水的溫度至溫差不超過(guò)5℃后按比例接種，攪拌均勻后陽(yáng)光下靜置培養(yǎng)。每天監(jiān)測(cè)水溫、氣溫、光照。

(2)水質(zhì)檢測(cè)。檢測(cè)培養(yǎng)用水中溶氧、總磷、總氮、亞硝酸鹽、氨氮、化學(xué)需氧量(COD)、pH。其中溶氧、pH 及總磷、總氮分別采用哈希便攜式溶氧儀、便攜式pH 計(jì)以及總磷、總氮在線分析儀(型號(hào)LB-1000TN)檢測(cè)。

(3)不同小球藻接種量對(duì)培養(yǎng)效果的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)置V(藻種)∶V(培養(yǎng)水體)為1∶2、1∶5、1∶10共3組接種比例，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，共設(shè)9組培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組，每組培養(yǎng)水體為100 升。接種結(jié)束后，每隔24 小時(shí)采集500 毫升培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)液中小球藻細(xì)胞的密度顯微計(jì)數(shù)觀察，實(shí)驗(yàn)周期5天。

(4)培養(yǎng)后期不同處理方式對(duì)小球藻培養(yǎng)效果的影響。按V(藻種)∶V(培養(yǎng)水體)為1∶5 接種比例接種9組100升的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組，相同條件下培養(yǎng)5 天后，藻液濃度進(jìn)入平穩(wěn)期，將其中3 組補(bǔ)加與初始等量的培養(yǎng)基、3組補(bǔ)加與初始雙倍量的培養(yǎng)基、3 組不添加。接種結(jié)束后，每隔24 小時(shí)采集500毫升培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)液中小球藻細(xì)胞的密度顯微計(jì)數(shù)觀察，實(shí)驗(yàn)周期10天。

(5)浮游植物的顯微計(jì)數(shù)。在培養(yǎng)結(jié)束后取樣500毫升，采用魯哥試劑固定浮游植物。靜置48小時(shí)后濃縮至50 毫升，然后吸取100 微升于浮游植物計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡10×40 放大倍數(shù)下對(duì)浮游植物進(jìn)行分類(lèi)鑒定計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品須計(jì)數(shù)100個(gè)視野且次數(shù)不低于3次，結(jié)果取3次計(jì)數(shù)平均值。浮游植物生物量計(jì)算公式如下：

N＝A×Vs×n/(Ac×Va)

其中N 表示每升水樣中浮游植物數(shù)量，A 表示計(jì)數(shù)框面積，Vs表示濃縮后水樣體積，n表示計(jì)數(shù)所得浮游植物數(shù)量，Ac 表示計(jì)數(shù)面積，Va 表示計(jì)數(shù)框體積。

二、結(jié)果

1.培養(yǎng)用水水質(zhì)指標(biāo)和環(huán)境條件

池塘水質(zhì)：溶氧5.25 毫克/升、總磷0.164 毫克/升、總氮2.187 毫克/升、亞硝酸鹽0.016 毫克/升、化學(xué)需氧量(COD)10.5 毫克/升、氨氮0.250 毫克/升、pH 7.8。每天監(jiān)測(cè)水溫、氣溫、光照等環(huán)境條件。實(shí)驗(yàn)期間每天8:00-16:00，水溫為22～35℃，光照強(qiáng)度為10 000～125 000 勒克斯。

2.不同小球藻接種量對(duì)培養(yǎng)效果的影響

不同接種量組實(shí)際培養(yǎng)液效果見(jiàn)圖1，培養(yǎng)液水體明顯變綠、變濃。1∶2的接種比例組，第2天小球藻細(xì)胞濃度達(dá)最高，為3.82×107個(gè)/毫升；1∶5 的接種比例組，第3 天小球藻細(xì)胞密度達(dá)最高，為3.81×107個(gè)/毫升；1∶10的接種比例組實(shí)驗(yàn)期間濃度緩慢增加，最高為1.51×107個(gè)/毫升。1∶2 接種組和1∶5 接種組小球藻生長(zhǎng)性能、比增長(zhǎng)速率顯著優(yōu)于1∶10 接種比例組(P＜0.05)，但1∶2 與1∶5 組的比增長(zhǎng)速率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

圖1 室外小球藻培養(yǎng)效果

培養(yǎng)至第5 天，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組浮游植物豐度，結(jié)果顯示，小球藻為1∶2、1∶5、1∶10組培養(yǎng)液中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)藻種，所占比例分別為99.17%、99.25%、92.15%，其他為隱藻、甲藻、硅藻。綜上，按V(藻液)∶V(培養(yǎng)水體)為1∶2和1∶5接種培養(yǎng)小球藻，藻相好、生長(zhǎng)快、濃度高、純度高，培養(yǎng)液小球藻細(xì)胞純度比例高達(dá)99%以上。結(jié)合藻種有效使用率和擴(kuò)培效果，1∶5 的接種比例組更適合實(shí)際接種應(yīng)用推廣。

3.培養(yǎng)后期不同處理方式對(duì)小球藻培養(yǎng)效果的影響

培養(yǎng)至第10 天，不同補(bǔ)料量組培養(yǎng)液中小球藻密度變化情況表明，未補(bǔ)料組在第5天后小球藻細(xì)胞密度緩慢增加，至第7 天藻細(xì)胞密度達(dá)最高，為4.27×107個(gè)/毫升；補(bǔ)加初始雙倍量培養(yǎng)基組，小球藻細(xì)胞密度在第6 天至第10 天持續(xù)降低，從4.14×107個(gè)/毫升降至2.72×107個(gè)/毫升，顏色由綠色變?yōu)楹诤稚?，伴有刺激性臭味；補(bǔ)加與初始等量培養(yǎng)基組在補(bǔ)料后小球藻密度增加，第6天為4.12×107個(gè)/毫升，第10 天增至5.43×107個(gè)/毫升，增加了1.31×107個(gè)/毫升。在培養(yǎng)結(jié)束后，未補(bǔ)料組和補(bǔ)加與初始等量培養(yǎng)基組小球藻為培養(yǎng)液中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)藻種，所占比例分別為99.22%和99.37%；補(bǔ)加與初始等量培養(yǎng)基組小球藻占比最高，較未補(bǔ)加組提高了0.15%。

綜上，在小球藻生長(zhǎng)進(jìn)入平緩期后補(bǔ)加與初始等量培養(yǎng)基可提高小球藻細(xì)胞密度，且小球藻細(xì)胞純度比例高達(dá)99%以上，可降低成本、提高小球藻培養(yǎng)效率。

三、討論

小球藻培育至高峰期后可進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料量與初始量相等，以獲取更高濃度小球藻。每天要攪拌數(shù)次使藻相均勻，同時(shí)監(jiān)測(cè)水溫，超過(guò)35℃時(shí)需要加蓋防曬網(wǎng)，以防止水溫過(guò)高。

小球藻作為有益藻，可立體高效供氧，調(diào)控養(yǎng)殖水體微生態(tài)環(huán)境，廣泛應(yīng)用于魚(yú)、蝦、蟹生態(tài)養(yǎng)殖。姚冬梅等(2022)發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對(duì)蝦池塘接種小球藻，接種小球藻的試驗(yàn)組較對(duì)照組藍(lán)藻門(mén)生物平均密度下降76.32%、綠藻門(mén)生物平均密度上升70.32%，說(shuō)明池塘接種小球藻可以有效抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻的生物防治。目前小球藻的培養(yǎng)模式主要為封閉式管道培養(yǎng)及開(kāi)放式培養(yǎng)。蔣禮玲等(2010)研究發(fā)現(xiàn)，在柱狀光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)小球藻，最高密度僅為0.57×107個(gè)/毫升，充入煙道氣(含有10%～15%的CO2)組小球藻密度增加10 倍。充入CO2增加了成本且易污染藻種。小球藻開(kāi)放式培養(yǎng)模式成本雖低，但占地面積大，藻種密度低。李大高等(2015)發(fā)現(xiàn)池塘培育小球藻濃度為(7～10)×106個(gè)/毫升，且需嚴(yán)格控制原生動(dòng)物等敵害生物。本研究建立了一種小球藻塘口規(guī)模化培養(yǎng)新模式，在室外塘口培養(yǎng)，只需簡(jiǎn)單操作和合理接種，培養(yǎng)效果有保障，藻相穩(wěn)定且培養(yǎng)純度達(dá)99%以上，濃度可高達(dá)5.43×107個(gè)/毫升，培養(yǎng)成本低，適合在中小型養(yǎng)殖戶中推廣應(yīng)用。