論文：重慶養(yǎng)殖場(chǎng)鱖群體微衛(wèi)星遺傳多樣性研究

重慶養(yǎng)殖場(chǎng)鱖群體微衛(wèi)星遺傳多樣性研究

范士琦，馮婧昀，苗曉敏，郭慧，陶怡曦，李云

（1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,漁業(yè)與水產(chǎn)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.西南大學(xué)淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市水產(chǎn)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

鱖（Siniperca chuatsi）俗稱桂花魚、翹嘴鱖，隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes），鱸形目（Perciformes），科（Serranidae），鱖亞科（Siniperinae），鱖屬（Siniperca），廣泛分布于中國(guó)長(zhǎng)江和黑龍江水系及其附屬湖泊水庫(kù)以及朝鮮半島、越南部分地區(qū)，為名貴水產(chǎn)品[1-3]。2020 年我國(guó)鱖養(yǎng)殖的總產(chǎn)量達(dá)37 萬(wàn)t，廣東生產(chǎn)的鱖苗種占全國(guó)的95%以上[3]。鱖作為重要養(yǎng)殖魚類，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)其形態(tài)特征、養(yǎng)殖性能、種質(zhì)資源、生理機(jī)能、遺傳育種等方面開展了廣泛研究[4-8]，取得了豐富的成果，目前已經(jīng)報(bào)道的鱖新品種有“華康1 號(hào)”“長(zhǎng)珠雜交鱖”“廣清1號(hào)”“鼎鱖1 號(hào)”等[9-12]。盡管長(zhǎng)江流域有著豐富的天然鱖種質(zhì)資源，但位于長(zhǎng)江上游的川渝地區(qū)鱖養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)起步較晚。近幾年，重慶市鱖消費(fèi)市場(chǎng)需求旺盛，鱖苗種需求持續(xù)增加，外購(gòu)苗種質(zhì)量不穩(wěn)定，加上長(zhǎng)途運(yùn)輸易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)大，制約了重慶鱖養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[13]。

遺傳多樣性可以直接體現(xiàn)種群長(zhǎng)期進(jìn)化和發(fā)展中的遺傳變異，因此開展魚類遺傳多樣性的研究，可為了解魚類的種質(zhì)資源現(xiàn)狀和遺傳改良奠定基礎(chǔ)[14-15]。微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)是目前發(fā)展最快的一類分子標(biāo)記，在魚類遺傳發(fā)育、DNA 指紋圖譜制作分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和標(biāo)記輔助選擇中廣泛使用[8]。微衛(wèi)星DNA 在真核及原核生物基因組中被普遍應(yīng)用，其特點(diǎn)相較于其他諸如RFLP、RAPD、AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)而言，多態(tài)性更高[16-17]。現(xiàn)通過微衛(wèi)星DNA 遺傳多樣性，對(duì)重慶地區(qū)3 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的鱖群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，擬為重慶鱖養(yǎng)殖種質(zhì)資源調(diào)查提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為優(yōu)質(zhì)苗種生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

活體鱖采自重慶市潼南區(qū)興水養(yǎng)殖場(chǎng)（XS）、名優(yōu)魚養(yǎng)殖場(chǎng)（MY），以及重慶市巫溪縣鱖養(yǎng)殖場(chǎng)（WX）。3 個(gè)群體樣本的外部形態(tài)特征和可數(shù)性狀標(biāo)準(zhǔn)均符合《鱖》（SC 1038—2000）的分類特征。各養(yǎng)殖場(chǎng)均隨機(jī)采集樣本50 尾，分別測(cè)量體高和體長(zhǎng)。其中，MY 養(yǎng)殖場(chǎng)鱖平均體質(zhì)量為（73.76±20.16）g，平均體長(zhǎng)為（14.21±1.09）cm；XS 養(yǎng)殖場(chǎng)鱖平均體質(zhì)量為（49.60±14.91）g，平均體長(zhǎng)為（12.79±1.50）cm；WX 養(yǎng)殖場(chǎng)鱖平均體質(zhì)量為（32.94±7.25）g，平均體長(zhǎng)為（11.03±0.77）cm。捕撈后立即取尾鰭固定在95%乙醇中，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

1.2 微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記

所有鱖樣本基因組DNA 提取均采用酚-氯仿抽提法[18]。根據(jù)文獻(xiàn)[19-21]，篩選出23 對(duì)鱖微衛(wèi)星引物（由上海生工合成）。從3 個(gè)鱖群體中分別任選2 尾鱖的模板DNA 與23 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增篩選出10 對(duì)擴(kuò)增效率高、多態(tài)性較好的引物（表1），并合成熒光基團(tuán)標(biāo)記引物（上海生工）。

表1 10 對(duì)熒光引物基本信息

其中，微衛(wèi)星引物JX867997、JX867983、JX867992參考文獻(xiàn)[20]，另外7 個(gè)引物參考文獻(xiàn)[19，21]。10對(duì)引物的正向引物（5′端）添加HEX（藍(lán)色）或FAM（綠色）或TAMRA（黑色）熒光標(biāo)記，反向（3′端）不添加，然后分別與模板DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。并通過ABI3730XL 遺傳分析系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行STR 分型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Genemapper 軟件，分析SSR 數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析包括等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)威納指數(shù)（H′）、基因流（Nm）、基因分化系數(shù)（FST）等參數(shù)；哈迪溫伯格平衡（Hardy-Weinberg）檢驗(yàn)遺傳距離和遺傳相似系數(shù)；使用PIC_Calc 0.6 軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體遺傳多樣性

用10 個(gè)多態(tài)性好的微衛(wèi)星引物共檢測(cè)到95個(gè)等位基因（表2），Na為4～22，均值為9.5。就PIC而言，DQ789300 的多態(tài)性為中度（0.25＜PIC＜0.5）外，另外9 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均有高度多態(tài)性（PIC＞0.5）。10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)FIS值為-0.390 9～0.146 9，F(xiàn)IT值為-0.339 4～0.188 6，平均值為-0.051 8；FST值為0.012 2～0.087 6。就Nm而言，除了DQ789391 的值＜4 外，其微衛(wèi)星位點(diǎn)的Nm值均＞4。

表2 10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的固定指數(shù)（F）和Nm①

篩選出的10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在3 個(gè)鱖群體中的遺傳多樣性參數(shù)見表3。由表3 可見，鱖群體的Na均值為6.4～7.4，Ne均值為3.635～3.767，Ho均值為0.733～0.755，各群體He均值為0.674～0.711。3 個(gè)鱖群體I 均值為1.378～1.427，其中XS 群體最低，MY群體最高。

表3 3 個(gè)鱖群體微衛(wèi)星遺傳多樣性參數(shù)①

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

3 個(gè)鱖群體間遺傳相似系數(shù)（對(duì)角線上）和遺傳距離（對(duì)角線下）見表4。由表4 可見，不同鱖群體間的遺傳距離值為0.087 1～0.136 0，遺傳相似系數(shù)值為0.889 5～0.916 6，＞0.05，其中MY 群體與XS 群體間相似系數(shù)值（0.916 6）高于MY 群體與WX 群體間遺傳相似系數(shù)（0.872 8）。對(duì)重慶地區(qū)3 個(gè)鱖群體的分子方差分析結(jié)果表明（表5），95.44%的遺傳變異來自個(gè)體內(nèi)，4.47%的變異來自群體間，群體內(nèi)變異組成為0.09%。

表4 3 個(gè)鱖群體間遺傳相似系數(shù)（對(duì)角線上）和遺傳距離（對(duì)角線下）

表5 3 個(gè)鱖群體的分子方差分析（AMOVA）

3 討論

3.1 3 個(gè)鱖群體的遺傳多樣性

微衛(wèi)星標(biāo)記分析遺傳多樣性會(huì)受到種群樣本量的影響，通常認(rèn)為用于微衛(wèi)星標(biāo)記研究的樣本量在≥20 個(gè)時(shí)，才能穩(wěn)定反映出等位基因和有效基因數(shù)[22]。本試驗(yàn)的各群體的樣本量為50 尾，可以反映出3 個(gè)鱖群體間的遺傳變異程度。Buchanan 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，高度多態(tài)表現(xiàn)為PIC＞0.5，中度多態(tài)時(shí)PIC值為0.25～0.50，而PIC＜0.5 時(shí)，則為低度多態(tài)；另外，微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)是等位基因數(shù)在4 個(gè)以上[24]。本研究中，除了DQ789300 位點(diǎn)屬于中度多態(tài)外，其余9 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC 均在0.5 以上，屬于高度多態(tài)；從Na來看，除DQ789300 外，其余微衛(wèi)星位點(diǎn)的Na均≥4，能將群體遺傳變異程度很好表現(xiàn)出來。

本研究所使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)所獲得的遺傳分析結(jié)果是可靠的，引物JX867983、JX867992 和JX86997，在150 個(gè)樣本中觀察到的等位基因數(shù)為7～11 個(gè)，低于文獻(xiàn)[25]運(yùn)用相同引物對(duì)3 種鱖屬魚類進(jìn)行遺傳分析所得到的等位基因數(shù)（11～19 個(gè)），這可能與本研究樣本為同種樣本有關(guān)。

本研究中，MY、XS、WX 群體的Na和Ne平均值分別為6.4，7.4，6.9 和3.675，3.635，3.767，不同群體之間差異較小。Na平均值與李珊[26]對(duì)清水江野生斑鱖群體的研究結(jié)果相差不大（Na=3.668 0）。Takezaki等[27]通過微衛(wèi)星分析得出，群體間有遺傳多樣性表現(xiàn)在雜合度為0.3～0.8。MY、XS、WX 群體的平均Ho和He分別為0.733、0.755、0.736 和0.711、0.682、0.674，雜合度較高，群體變異豐富[18]。彭敏燕等[28]在對(duì)3 個(gè)鱖野生群體的微衛(wèi)星遺傳多樣性研究中得出平均Ho和He分別為0.255 4～0.698 9 和0.710 0～0.744 6，低于本研究中群體結(jié)果平均Ho，稍高于本研究群體平均He值。從H′來看，各群體均值為1.378～1.427，高于梅秋蘭等[29]對(duì)鱖原種群體和鱖群體使用微衛(wèi)星技術(shù)研究得出的H′均值（1.078 和0.689）。本研究中，重慶市3 個(gè)鱖群體遺傳多樣性較高，提示3 個(gè)鱖養(yǎng)殖群體苗種來源的親代繁育群體數(shù)量較大，遺傳異質(zhì)性較高，也反映出苗種產(chǎn)地人工選擇壓力小等原因[30]。

3.2 3 個(gè)鱖群體間的遺傳結(jié)構(gòu)

固定指數(shù)是研究遺傳分化的重要指標(biāo)，它包括FIT、FIS和FST3 種參數(shù)[31-32]。其中，F(xiàn)IS表示群體偏離隨機(jī)交配的程度，當(dāng)FIS＜0 認(rèn)為群體在該位點(diǎn)存在雜合子過?，F(xiàn)象，F(xiàn)IS＞0，則表示雜合子缺失，F(xiàn)IS=0 時(shí)，即為達(dá)到平衡[33]。在本研究中，除了W19518、DQ789290、DQ789391 位點(diǎn)FIS＞0 外，其他位點(diǎn)的FIS均＜0，表明存在雜合子過剩，異交程度高。群體間的遺傳分化程度可以通過FST揭示出來，分化程度較小時(shí)FST＜0.05，分化程度中等時(shí)為0.05～0.15，當(dāng)FST＞0.15 時(shí)，表示群體間的分化程度高[34]。本研究中，有70%的微衛(wèi)星位點(diǎn)的FST值均＜0.05，表明3 個(gè)群體間的分化程度低。針對(duì)Nm而言，一般認(rèn)為如果Nm＞1，則表示不會(huì)有顯著的遺傳分化，當(dāng)Nm＞4 時(shí)，則被認(rèn)為分化程度很小[35]，本研究中，各位點(diǎn)的Nm均＞4，也證明3 個(gè)鱖群體間均未出現(xiàn)遺傳分化現(xiàn)象。而根據(jù)AMOVA 來看，個(gè)體內(nèi)部變異（95.44%）是遺傳變異的最主要源頭，群體間的變異程度僅占4.47%，這也符合FST得出的分析結(jié)果。

研究群體多樣性的重要因素之一是遺傳距離的大小，其與群體分化時(shí)間成正相關(guān)[36]。根據(jù)3 個(gè)鱖魚群體間的遺傳相似度、遺傳距離數(shù)據(jù)，MY 群體與XS 群體遺傳相似度最大（0.916 6），且遺傳距離最短，而WX 群體與其他2 個(gè)群體的遺傳相似度略小，遺傳距離略大。文獻(xiàn)[37]表明，同種間的群體遺傳相似度為0.80～0.97，遺傳距離為0.03～0.20。本研究結(jié)果顯示，遺傳相似度為0.872 8～0.916 6，遺傳距離為0.087 1～0.136 0，可判定3 個(gè)群體為同一物種，且群體分化時(shí)間短。根據(jù)調(diào)查，XS、WX2 個(gè)群體苗種分別來源于廣東清遠(yuǎn)、佛山，MY 群體屬于重慶本地儲(chǔ)養(yǎng)親體的自繁苗種，其親體從廣東佛山引入，提示3 個(gè)群體的親本可能來源于共同的祖代群體，也與廣東鱖（翹嘴鱖）的養(yǎng)殖祖代群體于1980 年代引自長(zhǎng)江中下游的歷史相吻合[1，3]。

許多研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖群體比野生群體發(fā)生瓶頸效應(yīng)和種質(zhì)同質(zhì)化的可能性更大，這些都會(huì)導(dǎo)致遺傳基因的丟失和群體遺傳性的降低。在對(duì)來自湘江的野鯉養(yǎng)殖群體和野生群體的研究中發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)群體間的遺傳變異水平很大[38]；趙祥等[39]研究后發(fā)現(xiàn)，對(duì)比野生群體來看，黃姑魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性降低十分顯著。在對(duì)鱖的遺傳多樣性研究中，方展強(qiáng)等[40]研究得出鱖養(yǎng)殖群體與野生群體之間遺傳差異十分顯著，養(yǎng)殖群體要顯著低于野生群體；梅秋蘭等[30]也基于微衛(wèi)星對(duì)鱖養(yǎng)殖群體和原種群體的遺傳差異進(jìn)行了分析比較，得出鱖原種群體遺傳多樣性較為豐富的結(jié)論。因此，在原種場(chǎng)親本群體和后備群體的選擇時(shí)，選擇遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)的親本，并開展群體遺傳多樣性分析，對(duì)保持親本群體的遺傳多樣性非常有必要性[41]。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)重慶3 個(gè)鱖養(yǎng)殖群體進(jìn)行分析，結(jié)果表明，3 個(gè)鱖群體內(nèi)的遺傳多樣性較高，群體間的遺傳分化水平低，表明3 個(gè)群體內(nèi)保留有較高的遺傳異質(zhì)性，群體間有較近的親緣關(guān)系，反映了群體親本源自共同的祖代。在生產(chǎn)中，要提高苗種質(zhì)量、存活率和養(yǎng)殖性能，需加強(qiáng)親本選育過程的遺傳選擇壓力，提高已育成良種的生產(chǎn)力和覆蓋率。