蝦苗感染蝦肝腸胞蟲過程解析及防控建議

一 、微孢子蟲簡介

微孢子蟲（Microsporidia）是包括人類在內(nèi)的其他真核生物的高度專業(yè)化的專性細胞內(nèi)寄生蟲，目前被認為是真菌的姐妹群（sister group），自19世紀第一次在家蠶中發(fā)現(xiàn)微孢子蟲（Nosema bombycis），造成了養(yǎng)蠶業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。它們在過去長期被認為是真核生物演化的一個早期階段的遺跡，這個階段是在生物獲得線粒體之前，細胞內(nèi)沒有過氧化物酶體以及典型的高爾基體等真核生物特有的細胞器。但最近的研究工作使這個問題變得復(fù)雜了，因為研究人員發(fā)現(xiàn)，它們含有一個很小的線粒體殘跡，被稱為mitosome。Mitosome的功能還存在爭議，但微孢子蟲基因組已知編碼線粒體鐵-硫團結(jié)構(gòu)的幾個組分?，F(xiàn)在，Golberg等人描述了兩種微孢子蟲的幾個鐵-硫團組分的克隆、定性和亞細胞定位。雖然一些組分定位于mitosome，但其他組分則是在胞質(zhì)中，這便提出了關(guān)于它們的功能是怎樣協(xié)調(diào)的問題。他們獲得的數(shù)據(jù)支持這樣一種觀點：Mitosome的一個關(guān)鍵作用是在包括Nar1和Rli1在內(nèi)的胞質(zhì)鐵-硫蛋白的生物合成中，它們對細胞生存至關(guān)重要。

二 、蝦肝腸胞蟲的發(fā)現(xiàn)及疫病流行

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）于2004年首次在泰國的斑節(jié)對蝦（黑虎蝦，Penaeus monodon）肝胰腺組織中被發(fā)現(xiàn)為一種未鑒定的微孢子蟲，但直到2009年才被鑒定為新的物種，可引起斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖過程出現(xiàn)生長緩慢綜合征（Monodon slow growth syndrome，MSGS），同時也是感染南美白對蝦（Penaeus vannamei）的致病原，被感染后的對蝦養(yǎng)殖過程中表現(xiàn)出生長速度緩慢、大小明顯分化的肝胰腺微孢子蟲?。℉epatopancreatic microsporidiosis，HPM）病癥，對蝦農(nóng)養(yǎng)殖造成了嚴重的經(jīng)濟損失，因此，EHP是繼白斑?。╓SD）、急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）后成為影響泰國對蝦養(yǎng)殖第三個最棘手的問題。

EHP 孢子掃描電鏡觀察結(jié)果

目前，眾所周知，EHP在亞洲廣泛存在（例如泰國、中國、印度、越南、印度尼西亞和馬來西亞），最近委內(nèi)瑞拉也有報道，已對全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)構(gòu)成威脅。通過共生及飼喂實驗證明，EHP可通過養(yǎng)殖水體得以傳播，以及經(jīng)口攝食寄生EHP 的鮮活餌料、病蝦、死蝦而感染，即所謂的水平傳播。而針對行業(yè)內(nèi)宣稱的EHP垂直傳播，即通過親蝦傳播給子代則缺乏系統(tǒng)科學(xué)證明，眾所周知，EHP是一種專性、細胞內(nèi)寄生的寄生蟲，其進行細胞侵染時是需要一系列合適的條件才能進入細胞內(nèi)部，普遍認為，在感染第一步EHP孢子壁上的蛋白（spore wall proteins，SWPs）與宿主細胞的糖胺聚糖（Glycosaminoglycans，GAGs）相互作用，然后在適合的條件下，極管通過擠壓穿透宿主細胞膜，這個過程2毫秒內(nèi)就能得以完成，最后極管作為導(dǎo)管將具感染性的孢子體轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，開始進入寄生細胞內(nèi)的生命周期階段。EHP最適合寄生的對蝦肝胰腺組織為其增殖提供了條件，而侵染生殖細胞概率幾乎為零，況且生殖細胞還要通過細胞分裂才能發(fā)育成熟，而引起人們普遍認為EHP可以垂直傳播的緣故在于，對感染EHP的親蝦，其生產(chǎn)的無節(jié)幼體、蝦苗幾乎都檢測出EHP陽性，但實質(zhì)仍缺乏真正意義上的垂直傳播驗證實驗。那我們該如何破解EHP垂直傳播的疑惑呢？

對蝦混養(yǎng)感染模式圖（摘自Paul Vinu Sa）

首先最容易想到的辦法是，通過對親蝦產(chǎn)卵池中的受精卵進行收集清洗消毒，使受精卵表面的粘附物、微生物等得以清除，然后轉(zhuǎn)移到新的孵化池中進行孵化生產(chǎn)，待發(fā)育到無節(jié)幼體后進行抽樣檢測。剛發(fā)育的無節(jié)幼體本身是一個封閉體，無口無肛門，與外界是相對隔離的，EHP是無法進入到無節(jié)幼體內(nèi)部的，故引起EHP傳播的途徑必定是幼體表面粘附了親蝦產(chǎn)卵池水體中的孢子體，而孢子體則由親蝦排便帶入。因此，我們通過生產(chǎn)實踐中的“洗卵”操作、轉(zhuǎn)移受精卵發(fā)育等方式是可以有效避免無節(jié)幼體攜帶EHP孢子體的風(fēng)險，進而從幼體這一源頭減少蝦苗培育過程中EHP的感染。以上是一種有效處理預(yù)防EHP感染的方法，但是一旦確認親蝦感染了EHP，使用該方法則需要更多注意事項，各操作員工、工具、清洗消毒方法等都要做好全面的防范措施，最大限度控制因人為因素途徑而傳播EHP。

三 、蝦肝腸胞蟲與宿主相互作用機制

然而，關(guān)于EHP如何與宿主細胞相互作用的機制仍然不太清楚，為了更好的認識這一侵染過程，國外學(xué)者從EHP的全基因組測序入手，首次鑒定出了EHP的孢壁蛋白（EhSWP1），并利用其基因序列建立了一種更為特異的PCR檢測方法，稱為SWPPCR，其中擴增EhSWP1基因全長特異性引物為EHP_SWP01_F：5'–ATA TCCATG GGC ATG TTA GAA GAT GCA AAG-3'和EHP_SWP01_R：5'-ATA TCT CGA GAG AAA ATTTTT CAA GGT G-3'。通過對EhSWP1的功能結(jié)構(gòu)描述，表明它包含三個肝素結(jié)合基序（HBMs）和一個二聚化生成彎曲的蛋白結(jié)構(gòu)（BAR2結(jié)構(gòu)域），其存在于成熟孢子壁的外孢子層和內(nèi)孢子層中，并已被證明與肝素結(jié)合，這表明作為宿主細胞感染過程的早期步驟，它可能通過表面肝素與宿主細胞結(jié)合，并在毒害宿主細胞中起到重要作用。由此可見，我們可以假設(shè)，EHP使用這個識別過程來啟動宿主細胞感染，寄希望這一理解可以為尋求、識別及攻擊EHP脆弱的靶點，以發(fā)展預(yù)防和治療方法來控制對蝦養(yǎng)殖業(yè)的EHP。

亞細胞定位（摘自Jaroenlak等）

為了侵入蝦細胞，EHP必須接近蝦肝胰腺小管上皮細胞，根據(jù)結(jié)果，假設(shè)EHP的孢子通過EhSWP1的3個HBMs中的帶正電的殘余物和細胞表面帶負電的肝素之間的靜電相互作用被上皮細胞吸引，一旦錨定，EHP孢子就會伸出極管，穿透宿主細胞膜，并將孢子體釋放到宿主細胞質(zhì)中，在宿主細胞質(zhì)中發(fā)生下一個發(fā)育階段。

示意模型（摘自Jaroenlak等）

四 、蝦肝腸胞蟲防控及建議

國內(nèi)學(xué)者通過實時熒光定量PCR研究發(fā)現(xiàn)，肝胰腺中EHP載量在103copies/（ng Hp DNA）以上時，表現(xiàn)出較高的風(fēng)險水平，且對蝦EHP 的載量指數(shù)與對蝦生長速率呈負相關(guān)，但在較低的差異范圍內(nèi)，EHP載量與對蝦生長的相關(guān)性不明顯。感染EHP的對蝦，截止到目前還沒有治療該疾病的藥物。因此養(yǎng)殖過程中需要認真關(guān)注重要的易感染環(huán)節(jié)，應(yīng)該作為重點控制的對象，從親蝦的檢測、苗種的檢測、飼料的檢測、餌料的控制、水體及對蝦的疫情檢測方面控制EHP的傳播和發(fā)病。育種前用2.5％氫氧化鈉溶液對所有育種工具進行消毒處理，保證蝦苗為無特定病原（SPF）的苗種，養(yǎng)殖池塘塘底用生石灰充分消毒，放苗前對蝦苗PCR檢測確保不攜帶有EHP病原，飼料投喂方面要盡量避免投喂鮮活餌料，可以將鮮活餌料冰凍或者巴氏滅菌法處理后在進行投喂。行業(yè)更需要引起重視的是蝦苗培育過程中的EHP防控，在高密度工廠化育苗過程中，蝦苗感染EHP的幾率和風(fēng)險遠遠大于低密度的成蝦養(yǎng)殖過程，且被EHP感染的蝦苗極具威脅性，導(dǎo)致養(yǎng)殖成功率大打折扣，同時對養(yǎng)殖水平提出更高的要求，因此，作為養(yǎng)殖戶選擇蝦苗的首要標準是無攜帶EHP病原的蝦苗。

對檢測確診感染了EHP的蝦苗，育苗企業(yè)應(yīng)在育苗場進行無公害化處理，嚴禁蝦苗流入市場，而對于養(yǎng)殖中的對蝦而言，需養(yǎng)殖戶日常根據(jù)蝦苗的生活狀態(tài)、生長速度及個體均勻度做初步判斷，畢竟影響蝦苗生長的因素太多了，要不要抽樣進行EHP病原檢測完全取決于養(yǎng)殖戶自己。在國內(nèi)養(yǎng)殖大蝦應(yīng)對EHP的影響時，業(yè)內(nèi)有許多不同的觀點與措施，意識并未趨于一致性，在養(yǎng)殖戶眼中，蝦塘中沒有EHP肯定是最好不過的，但EHP的病原體無處不在，要想避免病原幾乎是不可能，所以一般會采取一些特殊的養(yǎng)殖方式來應(yīng)對疑似感染或已感染EHP的蝦塘。EHP對大蝦養(yǎng)殖中后期似乎沒有太多威脅，因為它不會造成對蝦大量死亡，而此時的養(yǎng)殖收益已經(jīng)可以達到養(yǎng)殖盈虧平衡點了，養(yǎng)殖戶采用輪補、疏塘等方式促進蝦生長進而增加養(yǎng)殖收益。

總而言之，對蝦育苗企業(yè)需要義不容辭地對蝦苗EHP的安全擔(dān)當與負責(zé)，堅持企業(yè)初心，為行業(yè)提供優(yōu)質(zhì)蝦苗、良心蝦苗，期待未來學(xué)者依據(jù)EHP侵染宿主的機制開發(fā)出一種預(yù)防及治療EHP的方法。

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