論文：棘胸蛙出血性敗血癥的病原菌分離鑒定與病理學研究

     棘胸蛙出血性敗血癥的病原菌分離鑒定與病理學研究

任思宇，吳春艷，汪開毓，王雯慧，劉震坤，楊延輝

( 1.重慶三峽職業(yè)學院，重慶 404155； 2.甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070； 3.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130 )

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，俗稱石棒、石蛙等，屬叉舌蛙科棘胸蛙屬，主要分布于我國南部山區(qū)的溪流生境中。20世紀80年代初期，國內便開始了棘胸蛙的人工養(yǎng)殖，2000年后逐步實現了規(guī)?；l(fā)展。隨著行業(yè)規(guī)模的擴大，高致死的細菌性傳染病逐漸成為制約棘胸蛙養(yǎng)殖的關鍵因素，目前已有致病性蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)[1]、布氏檸檬酸桿菌(Citrobacterbraakii)[2]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[3-4]及肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[5]等感染棘胸蛙后導致嚴重死亡的報道。2019年6月，重慶市石柱縣某養(yǎng)殖場的棘胸蛙出現大量死亡，死亡蛙呈典型的出血性敗血癥癥狀，可見明顯的紅腿與腹水癥；個別病蛙單側眼渾濁，整個養(yǎng)殖場的發(fā)病率約40%，某些單獨養(yǎng)殖室內的發(fā)病率接近60%，發(fā)病后死亡率約80%。筆者采集病樣，進行實驗室病原學檢測，開展藥敏試驗、組織病理學與超微病理學等研究，旨在明確該病的致病原因，探索感染后造成的病理損傷，為棘胸蛙的健康養(yǎng)殖與疾病防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發(fā)病棘胸蛙體質量為(130±20) g，采自重慶市石柱縣某養(yǎng)殖場。健康棘胸蛙表現活躍，體表無損傷，體質量(120±10) g，購自重慶市彭水縣某養(yǎng)殖場，實驗室暫養(yǎng)7 d后未見任何疾病表現；在回歸感染前，隨機選取其中5只蛙進行寄生蟲與細菌的檢測，未發(fā)現有感染。健康棘胸蛙暫養(yǎng)于實驗室內的玻璃缸中，缸內水深約1 cm，并鋪設干養(yǎng)區(qū)。每日換水1次，控制環(huán)境溫度為(25±2) ℃。每日8:00、18:00投喂黃粉蟲，自由采食。腦心浸出液肉湯(BHI)，購于北京陸橋技術有限責任公司；2×Taq PCR Mastermix (KT201)、細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)，購于天根生化科技(北京)有限公司；細菌微量生化反應管、藥敏紙片，購于杭州微生物試劑有限公司；血平板(成品培養(yǎng)基024070)，購自于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；嗜水氣單胞菌CW(基因登錄號：MN475912)，由“長江上游魚類資源保護與利用”四川省重點實驗室惠贈。

1.2 病原菌的分離純化

取發(fā)病棘胸蛙的體表潰瘍處組織、體表黏液以及腸道內容物制作壓片，采集心血制作血涂片以檢測寄生蟲的感染。在無菌條件下，用接種環(huán)挑取發(fā)病棘胸蛙的肝臟與腹水，劃線接種于BHI平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取單一的優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，獲得純化菌株。

1.3 回歸感染試驗

將健康棘胸蛙隨機分為5組(10尾/組)，其中4組為感染組，1組為對照組。感染組中，每組分別腹腔注射密度為1×105、1×106、1×107、1×108cfu/g的病原菌生理鹽水重懸液，每尾注射量為0.2 mL；對照組腹腔注射等量的無菌生理鹽水。接種后連續(xù)觀察14 d，記錄棘胸蛙死亡的時間與數量，并進行細菌的再次分離鑒定。

1.4 表型特征鑒定和16S rDNA、gyrB基因鑒定及系統發(fā)育分析

參照文獻[6]對分離菌進行表型特征鑒定，并將其接種于血平板上，觀察溶血特性，并將嗜水氣單胞菌CW作為參照菌株共同進行試驗。抽提分離菌的DNA作為模板，采用16S rDNA與gyrB基因的相關引物進行PCR擴增，擴增產物純化后提交至北京擎科生物科技有限公司成都分公司進行測序分析。序列結果在GenBank中進行BLAST比對分析，并采用MEGA 6.0構建系統發(fā)育樹。PCR反應體系為：25 μL的2×Taq PCR Mastermix，2 μL模版DNA，2 μL上游引物，2 μL下游引物，加水至50 μL。反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。16S rDNA、gyrB基因的擴增引物分別為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，3′-TACGGC TACCTTGTTACGAC-5′；5′-GAAGTCATCATG ACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，3′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNA CRTCNGCRTCNGTCAT-5′。

1.5 藥敏試驗

無菌條件下將密度為1.0×107cfu/g的病原菌液涂布于BHI平板上，用滅菌后的鑷子將藥敏紙片粘貼于平板表面，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑(重復3次)，根據杭州微生物試劑有限公司抑菌圈標準判定該細菌的藥物敏感性。

1.6 組織病理學觀察

取自然發(fā)病和健康棘胸蛙的肝臟、腎臟、脾臟、心臟及腦等組織，固定于10%中性甲醛溶液中，制作石蠟切片，經蘇木精-伊紅染色后，置于顯微鏡(LC30，Olympus CX33)下觀察并采集病理圖片。

1.7 超微病理學觀察

將自然發(fā)病和健康棘胸蛙的脾臟(組織大小為1 mm×1 mm×2 mm)，固定于4 ℃預冷的電鏡專用固定液(2.5%的戊二醛溶液)中。透射電鏡樣品經洗滌后放入1%的鋨酸中固定2～4 h；梯度丙酮脫水后，放入1∶1(體積比)的環(huán)氧樹脂和丙酮中置換2 h，再放于純環(huán)氧樹脂中40 ℃置換2 h；包埋固化后經醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色，放于透射電子顯微鏡(日立H-600IV)下觀察。

2 結 果

2.1 發(fā)病棘胸蛙的臨床癥狀

自然發(fā)病蛙均出現行動遲緩、精神沉郁、食欲減退的癥狀，半數以上的病蛙腳掌處可見潰爛，個別病蛙出現單側或雙側眼渾濁(圖1a)。約75%的病蛙在發(fā)病后的3 d內死亡，病蛙腿部、腹部發(fā)紅腫脹(圖1b、圖1c)，蹼間出血明顯(圖1d)，口腔中可見出血點或出血斑(圖1e)；病蛙死亡前全身顫抖、站立不穩(wěn)或出現不規(guī)則的轉圈運動，死亡時四肢僵直。解剖后可見肝臟出血(圖1f)，脾臟顏色暗黑、極度腫脹(圖1g)，腸系膜嚴重充血(圖1h)，并伴有大量腹水。約5%的病蛙在發(fā)病后5～10 d死亡，病蛙體表及內臟器官的出血情況相對較輕，但可見心包積液，個別可見典型的絨毛心癥狀(圖1i)。

圖1 自然發(fā)病棘胸蛙的臨床癥狀與解剖學變化

2.2 病原菌的分離與回歸感染

發(fā)病棘胸蛙經采集心血制作血涂片，采集腸道內容物、體表黏液及潰瘍處組織制作壓片后，顯微鏡下觀察未發(fā)現寄生蟲感染。從病蛙的肝臟與腹水中分離出1株優(yōu)勢菌SZW-003，該菌在BHI平板上長勢良好，28 ℃培養(yǎng)24 h后可長出淡黃色菌落，菌落邊緣整齊，表面圓潤。

腹腔注射SZW-003菌株的生理鹽水重懸液后12 h，棘胸蛙反應遲鈍，對換水、投喂等刺激因素不敏感，執(zhí)握時掙脫能力下降。最高密度組在接種后18 h即出現死亡，其他各組在第2、3天均陸續(xù)出現死亡。感染蛙的臨床癥狀及病理表現和自然發(fā)病棘胸蛙相似，呈出血性敗血癥表現(圖2)。7 d后，感染試驗組再無死亡現象，試驗過程中對照組無任何變化(表1)。通過寇氏法計算得出菌株SZW-003對棘胸蛙的半致死密度為1.59×106cfu/g；從回歸感染組發(fā)病棘胸蛙的肝臟中再次分離細菌，獲得的菌株16S rDNA和gyrB測序結果與菌株SZW-003一致。

圖2 回歸感染棘胸蛙的臨床癥狀與解剖學變化

表1 菌株SZW-003的人工感染試驗結果

2.3 病原菌的表型特征鑒定

生理生化反應顯示：菌株SZW-003山梨醇、山梨糖、鼠李糖、尿素、肌醇為陰性；枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、半乳糖、膽汁七葉苷、硫化氫、吲哚、硫化氫、V-P試驗、木糖、乳糖、賴氨酸、精氨酸為陽性(表2)。將菌株接種于血平板上呈典型的β溶血。

表2 菌株SZW-003分離株與參照菌株的生理生化特性

2.4 病原菌的系統發(fā)育分析

對菌株SZW-003的16S rDNA與gyrB基因進行擴增，分別得到1400 bp及約1100 bp的PCR產物，將測序結果進行BLAST比對分析，用MEGA 6.0構建系統發(fā)育樹。16S rDNA的結果顯示，菌株SZW-003與嗜水氣單胞菌(MF079290、MF716694)的同源關系最近(圖3)。gyrB的結果顯示，菌株SZW-003與編號為JX025785、JQ085472的嗜水氣單胞菌在發(fā)育樹中聚在一簇，親緣關系最近(圖4)。上傳菌株SZW-003序列至GenBank，獲得16S rDNA登錄號為MW767835，gyrB基因登錄號為MZ223373。

圖3 菌株SZW-003的16S rDNA系統發(fā)育樹

圖4 菌株SZW-003的gyrB序列系統發(fā)育樹

2.5 嗜水氣單胞菌SZW-003的藥物敏感性

藥敏試驗結果顯示，嗜水氣單胞菌SZW-003對恩諾沙星、四環(huán)素、阿奇霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、氟苯尼考、頭孢噻肟、慶大霉素等多種藥物敏感，對頭孢氨芐、阿莫西林、青霉素、氨芐西林等藥物耐藥(表3)。

表3 嗜水氣單胞菌SZW-003藥物敏感性試驗

2.6 組織病理學觀察

組織病理學觀察結果表明：病蛙肝臟中部分肝細胞腫脹，呈局灶性的裂解壞死，但未出現炎癥細胞的浸潤(圖5a)；腦組織中大量神經細胞腫脹變性，細胞核消失，胞內精細成分不清晰，并可見空泡狀結構(圖5b)；腎小管上皮細胞透明變性，呈均質的紅染結構，局部腎小管裂解脫落僅見輪廓；腎間質的結締組織松散，纖維斷裂，大量單核細胞及中性粒細胞浸潤(圖5c、圖5d)；心肌纖維未出現明顯損傷，但心包膜極度腫脹，其外可見大量的炎性滲出物，包含中性粒細胞、漿細胞及單核細胞，部分炎性細胞壞死裂解后僅剩細胞核殘片(圖5e)；脾紅髓細胞排列疏松散亂，大量紅細胞瘀滯其中，纖維架構大面積斷裂，脾索消失，完整性嚴重受損，網狀細胞壞死脫落(圖5f)；白髓中淋巴細胞排列疏松，出現核固縮樣壞死，白髓面積顯著縮小，周圍的黑色素巨噬細胞中心崩解消失(圖5g)；肺與腸道未出現明顯的病理變化。

健康棘胸蛙肝臟染色清晰，細胞界限明顯(圖5h)；腦組織中神經細胞正常，細胞核與核仁可辨(圖5i)；腎臟中腎小球與腎小管著色適中，未見透明變性與炎癥細胞浸潤(圖5j)；心臟中心肌纖維正常，心外膜與心包膜典型，心包腔中無炎性滲出物(圖5k)；脾臟紅白髓結構清晰，未見充血、出血及纖維斷裂(圖5l)。

圖5 自然發(fā)病棘胸蛙與健康棘胸蛙的組織學觀察

2.7 超微病理學觀察

超微病理學研究顯示，發(fā)病棘胸蛙脾臟內細胞離散，嗜酸性粒細胞壞死，纖維腫脹斷裂，細胞碎片散亂分布于細胞間(圖6a、b)；血管壁膠原纖維腫脹斷裂，管內外均可見裂解的纖維殘痕；較正常的網狀細胞表面可見大量胞質突起，但含有較多腫脹溶酶體的網狀細胞胞質突起減少，正在向典型與非典型兩類黑色素巨噬細胞轉變(圖6c、d)；受損的網狀細胞內線粒體腫大，淋巴細胞空泡化明顯(圖6e)；游離的巨噬細胞中可見吞噬的細菌顆粒(圖6f)。健康棘胸蛙超微結構觀察顯示，細胞間距正常，纖維結構清晰未斷裂，脾索內皮細胞完整，脾竇內分布有適量的紅細胞(圖6g、h)。

圖6 發(fā)病棘胸蛙與健康棘胸蛙脾臟的透射電鏡觀察

3 討 論

3.1 棘胸蛙感染嗜水氣單胞菌后的臨床癥狀

20世紀70—90年代，人們發(fā)現嗜水氣單胞菌的感染給無尾類的生存造成了巨大隱患，甚至認為該菌是無尾類自然種群規(guī)模下降的重要原因[7-8]。本試驗中，棘胸蛙多在發(fā)病后3 d內死亡，表現出多組織器官的廣泛性出血，這與已有的報道[9-10]一致。但值得注意的是，本試驗中少數病蛙的出血癥狀輕微，但可見心包積液及絨毛心；該類病蛙約在發(fā)病后5～10 d死亡，推測是因循環(huán)系統功能的嚴重受損所致；搜索文獻后發(fā)現，本試驗是無尾類感染嗜水氣單胞菌后出現心包積液與絨毛心的首次報道。盡管本試驗中，嗜水氣單胞菌感染棘胸蛙后發(fā)生了敗血癥，但有研究顯示，敗血癥只是細菌感染后所引發(fā)的一種臨床癥狀，不同細菌的感染均可引發(fā)[11]，因此不能成為疾病確診的依據，有關病原的診斷還需要結合實驗室方法進行鑒定。

3.2 棘胸蛙出血性敗血癥的病因分析

Forbes等[12]研究表明，無尾類自身免疫功能受到抑制是導致嗜水氣單胞菌感染的重要原因。他們發(fā)現，無尾類在冬眠期間因免疫功能降低可引發(fā)感染，尤其在冬眠后的回暖期，病菌繁殖加快，但機體免疫能力未能隨之激活，此時易出現發(fā)病的高峰期，且體表損傷可顯著提高疾病的發(fā)生率。本病例發(fā)病時的環(huán)境溫度為13.0～18.5 ℃，而棘胸蛙的最適生存溫度為20～27 ℃；此外，當環(huán)境溫度回升至15.7 ℃時棘胸蛙便出現繁殖行為[13-14]。因此，筆者認為低溫限制了棘胸蛙的免疫功能是本次疾病發(fā)生的根本原因，而求偶打斗與攝食競爭導致的體表損傷更促進了病菌的感染，這與已有的研究結果相一致。

3.3 棘胸蛙出血性敗血癥的病理分析

截至目前，有關無尾類感染嗜水氣單胞菌后的病理報道較少。Hill等研究了嗜水氣單胞菌、分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)及壺菌(Batrachochy-triumdendrobatidis)聯合感染非洲爪蟾(Xenopuslaevis)后所引起的病理損傷；余秋寒等利用大鯢(Andriasdavidianus)源嗜水氣單胞菌對美蛙(Ranagrylio)進行感染，發(fā)現肝臟、腎臟的變性與壞死嚴重。本試驗是針對嗜水氣單胞菌作為原發(fā)性單因素感染無尾類后，有關組織病理學與超微病理學研究的首次報道。筆者發(fā)現，病蛙脾臟是受損最嚴重的器官，而肝損傷較輕微，這與余秋寒等的研究結果不同。與之類似的是，魚類在暴發(fā)該病后的病理損傷也差別明顯。白鰱(Hypophthal-michthysmolitrix)、南方鲇(Silurusmeridio-nalis)及斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)發(fā)病后，主要表現為肝臟的彌漫性壞死；而Baumg-artner等報道，斑點叉尾感染后肝損傷輕微、脾臟損傷嚴重。綜上，無尾類和魚類發(fā)病后的病理損傷，會因感染動物的不同及嗜水氣單胞菌來源的差異而有所不同。此外，發(fā)病棘胸蛙脾臟與腎臟的纖維顯著斷裂，這可能說明嗜水氣單胞菌SZW-003菌株能分泌裂解纖維的相關毒素，從而引起嚴重損傷;有關該菌株毒力的強弱及分泌毒素的類型還需要進一步的研究。

3.4 棘胸蛙出血性敗血癥的防控建議

藥敏試驗顯示，嗜水氣單胞菌SZW-003菌株對阿莫西林、青霉素及頭孢氨芐等β內酰胺類藥物耐藥，而對喹諾酮類、氯霉素類及四環(huán)素類等藥物敏感，這與已報道的棘胸蛙源及其他蛙源的嗜水氣單胞菌藥敏結果相似[22-24]。與此不同的是，近年來源于大鯢與魚類的嗜水氣單胞菌大多表現出耐藥譜廣、耐藥率高等特點，尤其對恩諾沙星、氟苯尼考等水產常用抗生素表現出嚴重的耐藥性[15,19]，有學者研究認為，這與大鯢和魚類養(yǎng)殖過程中濫用抗生素，造成水環(huán)境中嗜水氣單胞菌的獲得性耐藥不斷加重有關[19]。雖然無尾類對水環(huán)境的依賴程度較低，且目前蛙源的嗜水氣單胞菌對許多水產用抗生素依然敏感，但生產上也一定要克服未明確病原就盲目使用抗生素的情況，避免在將來出現無藥可用的局面。此外，有報道顯示，無花果根、銀合歡種子及葫蘆巴等植物性藥物在控制嗜水氣單胞菌感染時有良好的效果[25-26]，因此，加強植物性藥物的研發(fā)與使用可能是將來有效防治嗜水氣單胞菌病的重要途徑。

4 結 論

本試驗確定了嗜水氣單胞菌是導致此次棘胸蛙出血性敗血癥的病原菌，該菌感染后可造成棘胸蛙脾臟、心外膜等多個組織器官的病理損傷，最終導致嚴重的功能障礙而死亡。該病原對許多抗生素呈現出耐藥性，尤其對β內酰胺類抗生素廣泛耐藥，此次疫病可結合氟苯尼考、恩諾沙星等藥物進行治療。