小龍蝦感染白斑綜合征病毒的研究

近年來，我國小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，2018年總產(chǎn)量達163.87萬噸，養(yǎng)殖總面積達1680萬畝。小龍蝦病害的發(fā)生也越來越頻繁，白斑綜合征(white spot syndrome，WSS)是對蝦的嚴重傳染性疫病，自1992年暴發(fā)以來，已在世界范圍內(nèi)傳播開來，每年給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)的宿主范圍非常廣泛，可感染40多種對蝦和非對蝦甲殼動物以及水生浮游動物，并表現(xiàn)出不同程度的感染性，這種廣泛的宿主范圍被認為是WSSV難以控制并大面積傳播的主要原因。

本研究在2018－2019年，從江蘇省泗洪縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)共采集76個外觀正常、無發(fā)病癥狀的小龍蝦樣本，每個樣本150只，通過PCR檢測白斑綜合征病毒，為淡水甲殼動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中WSSV的診斷與檢測及其流行研究提供科學依據(jù)。

一、材料與方法

1.小龍蝦 實驗用小龍蝦來自泗洪縣石集鄉(xiāng)、龍集鎮(zhèn)、臨淮鎮(zhèn)、青陽街道不同養(yǎng)殖塘口，平均規(guī)格10克/只，每個塘口采集小龍蝦數(shù)量不低于150只，把小龍蝦的鰓剪下研磨后存于酒精中，放于-20℃下保存，具體采集情況見表1。

表1 小龍蝦采集時間、地點

2.主要試劑 Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒、核酸染料購自生工生物工程(上海)股份有限公司，用于PCR擴增的PremixTaq酶、DL2000DNAMarker購自TaKaRa，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3.主要儀器 各種規(guī)格移液器選用艾本德公司產(chǎn)品，LG16-W高速離心機為北京京立離心機有限公司產(chǎn)品，S1000ThermalCyclerPCR儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品，INFINITY-3026凝膠成像儀為法國VILBERLOURMAT公司產(chǎn)品，BG-Power600電泳儀為北京百晶生物技術有限公司產(chǎn)品。

4.WSSV的PCR檢測 吸取0.5毫升用無水酒精保存的蝦鰓，12000轉/分離心3分鐘，倒去酒精，加入1毫升生理鹽水反復吹打，12000轉/分離心3分鐘，倒去生理鹽水，底部為待檢測的鰓樣品，按照試劑盒操作步驟提取DNA。PCR反應體系為50微升，包括PremixTaq酶25微升、DNA模板5微升、引物(F1)1微升、引物(R1)1微升、去離子水18微升(以上都在冰上操作)；引物為F1:5'-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3'，R1:5'-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3'。PCR反應條件為：94℃預變性4分鐘，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，30個循環(huán)，72℃延伸10分鐘，4℃保溫，擴增1447bp片段。PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，結果在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

二、結果與分析

2018年5月22日共采集小龍蝦樣本23個，陽性檢出數(shù)量20個，陽性檢出率為87%；2018年7月25日共采集小龍蝦樣本11個，陽性檢出數(shù)量4個，陽性檢出率為36.4%；2019年3月28日、4月6日共采集小龍蝦樣本21個，陽性檢出率為0；2019年5月14日共采集小龍蝦樣本21個，陽性檢出數(shù)量17個，陽性檢出率為81%，具體實驗結果見圖1～4(M為DNAMarker)。

三、討論

從實驗結果可以看出，外觀正常、無癥狀的小龍蝦也會攜帶白斑綜合征病毒，且陽性檢出率和溫度有一定的關系。在3、4月水溫14～15℃、7月水溫30℃時，病毒的陽性檢出率較低，甚至為零；當水溫在20℃左右時，病毒的陽性檢出率較高，達到80%以上。

圖1 2018年5月22日樣本PCR電泳圖譜

圖2 2018年7月25日樣本PCR電泳圖譜

圖3 2019年3月28日、4月6日樣本PCR電泳圖譜

圖4 2019年5月14日樣本PCR電泳圖譜

白斑綜合征為季節(jié)性發(fā)病，華東地區(qū)發(fā)病季節(jié)在5月初至7月初，這就是很多養(yǎng)殖戶說的小龍蝦“五月瘟”。在水溫20℃左右時，白斑綜合征病毒在小龍蝦體內(nèi)的攜帶率比較高，所以我們在養(yǎng)殖過程中應注重提高小龍蝦的體質，改善養(yǎng)殖環(huán)境，要在小龍蝦攜帶病毒的前提下仍然能夠健康生長，可從以下幾個方面控制。

1.放苗時間盡量控制在4月25日之前 5月以后小龍蝦白斑綜合征病毒帶毒率高，蝦苗在回捕和運輸過程中易缺氧、受傷，投放到塘口易發(fā)生應激反應，在這種條件下病毒會大量增殖，如果選在5月放苗，蝦苗更容易發(fā)生死亡。

2.放養(yǎng)密度不宜過大 放養(yǎng)密度過大，排泄物、殘餌過多，水質底質惡化，溶解氧不足，小龍蝦體質下降，抗病能力減弱。

3.改善水體環(huán)境 養(yǎng)護好水草，定期使用微生物制劑如乳酸菌、EM菌等，調節(jié)池塘生態(tài)環(huán)境。

4.投喂高蛋白質的優(yōu)質配合飼料 優(yōu)質配合飼料可以提高小龍蝦的抗病能力。

5.進地籠的小龍蝦全部捕出 在起捕上市的過程中，所有進地籠的小龍蝦無論大小全部捕出，不要回塘。小龍蝦在地籠袋口處比較擁擠，容易引發(fā)缺氧和受傷，體質下降，病毒易增殖，加之小龍蝦領地意識強，回塘的小規(guī)格蝦容易受到留塘蝦的攻擊，導致白斑綜合征病毒擴散。