醫(yī)學(xué)蛭類與水蛭素：我國醫(yī)學(xué)蛭類的種類特征和生態(tài)分布

1  概述

蛭類動物在我國俗稱螞蟥、水蛭、馬鱉等，全世界有六百余種，我國也有近百種。它們生活在淡水、潮濕的陸地以及海水里，作為暫時性體外寄生蟲有的取食魚、龜、鱉、蛙、水鳥以及像牛、馬和人這樣一些哺乳動物的血液，也有的取食蚯蚓、昆蟲幼蟲、蝦、蟹和螺、蚌之類的無脊椎動物的體液、組織以致整個身體。我國對蛭類動物的記載早在公元前2世紀(jì)漢朝初期的《爾雅》中已經(jīng)出現(xiàn)，對水蛭的應(yīng)用在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記述較為詳細，謂其“主逐惡血、瘀血、月閉、破血消積聚┅┅┅┅”。醫(yī)圣張仲景（168-188）的《金匱玉幽經(jīng)》里所謂“下血”即是抗凝血的“破血”作用，由此可見我國早在公元2世紀(jì)便已發(fā)現(xiàn)水蛭的抗凝血功能了，這比西方國家利用水蛭的歷史要早千年以上。到15世紀(jì)我國明朝李時珍著的《本草綱目》中則對水蛭在內(nèi)科方面的藥效作了詳細的說明，并列舉出不少的民間處方，主要用來治療女子月閉、跌打損傷、漏血不止以及產(chǎn)后血暈等癥。古籍中還記載有把饑餓的螞蟥裝入竹筒扣在洗凈的皮膚上，令其吸食膿血以治療赤白丹腫以及將螞蟥研成干粉末與其它中藥配伍治療跌打損傷等癥。自梁代陶弘景《本草經(jīng)集注》以后歷代的《本草》中都認(rèn)為中藥用的螞蟥是指吸哺乳動物血液的種類。不管是水蛭、草蛭、山蛭、泥蛭，在吸牛、馬和人血這一點上是共同的，而且強調(diào)“用之當(dāng)以小者為佳”。但是我國早期的文獻不可能說清楚使用吸食哺乳動物血液的螞蟥治病的道理，以致在現(xiàn)今的《中國藥典》中仍然將不吸哺乳動物血液的寬體金線蛭（Whitmania pigra ）和尖細金線蛭（Whitmania acranulata ）列為規(guī)定的種類，用作傳統(tǒng)中藥材, 謂其功能是破血通經(jīng)，消積散瘀，消腫解毒和墮胎。在第二屆全國活血化瘀學(xué)術(shù)會議上，還籠統(tǒng)地將主要是寬體金線蛭的水蛭確定為35味活血化瘀中藥之一，歸屬于“作用峻裂的破血藥范疇”，這些都是缺乏科學(xué)依據(jù)的，也給水蛭的醫(yī)藥應(yīng)用造成了很大的混亂。筆者曾對我國安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蘄春幾個主要中藥材市場銷售的水蛭以及近十種水蛭中成藥的原料作了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這些全都是一種不吸哺乳動物血液，終身取食螺類，主要生活在我國山東、江蘇、安徽和湖北廣大湖區(qū)以及長江流域及其以北各地河灘與池塘里的寬體金線蛭，全國每年消耗數(shù)以十噸計的干品，不斷地捕捉大大破壞了這個物種在自然界的資源分布，同時也是與我國古代《本草》中的記載以及現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究成果不相符的。造成這種現(xiàn)狀的原因在于我國中醫(yī)藥管理、研制和臨床應(yīng)用部門缺乏對蛭類動物生物學(xué)與生物化學(xué)的深入認(rèn)識，不知道在動物分類學(xué)上是環(huán)節(jié)動物門一個綱的蛭類動物在我國就有近百個種，它們分屬于不同的目、科和屬，在形態(tài)結(jié)構(gòu)、取食習(xí)性、生活環(huán)境以及體內(nèi)所含生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能方面都是十分不相同的。幾個世紀(jì)以前西歐國家也開始使用水蛭治療心血管病、神經(jīng)系統(tǒng)病、炭疽、青光眼和乳突炎等病。18-19世紀(jì)醫(yī)蛭吸血法在歐洲曾風(fēng)行一時，隨著科學(xué)的進步，這種帶有迷信色彩的治療方法才逐漸被放棄了。

近百余年來，隨著西方國家首先對吸食哺乳動物血液的水蛭唾液腺分泌物的深入研究，人們又發(fā)現(xiàn)了它們在醫(yī)療臨床上的許多新用途。1884年威爾士國家醫(yī)學(xué)院?？死蛱兀↗. B. Haycraft）首先發(fā)現(xiàn)吸血水蛭咽部具有的水溶性抗凝血物質(zhì)。1904年雅各比（C. Jacoby ）將這種物質(zhì)命名為“水蛭素”（Hirudin）。1955年德國馬克沃德特（F. Markwardt）首次從吸血水蛭體內(nèi)分離提取出較純的水蛭素，此后對水蛭素的純化和標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)日臻完善。迄今已有十多個國家公布了水蛭素研究的專利并有英國水蛭生物藥物公司（Biopharm UK Ltd ）、美國水蛭公司（Leeches U.S.A. Ltd ）以及 美國Sigma 生化試劑公司等多家公司在銷售不同純度的天然水蛭素以及其它水蛭產(chǎn)品。研究表明水蛭素是已知最有效的天然凝血酶抑制劑，在治療某些血液性疾病方面優(yōu)于肝素，能夠更有效地抑制凝血酶誘發(fā)的彌散性血管內(nèi)凝血和靜脈血栓形成，在處理諸如敗血休克、動脈粥樣硬化、腦血管梗塞、心血管病、眼科以及遺傳性疾病等缺少抗凝血酶Ⅲ的病例方面顯示出巨大的優(yōu)越性，從而引起各國醫(yī)藥和生物學(xué)工作者的廣泛重視。除此以外，各國科學(xué)家還在吸血水蛭唾液腺分泌物中發(fā)現(xiàn)了許多與吸食哺乳動物血液相關(guān)聯(lián)的生物活性物質(zhì)，如麻醉劑（Anaesthetic）、血管擴張劑（Vasodilator）、水蛭透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase, HAse）、裂纖酶（Hementin）、前列腺素（Prostaglandins）、抗生素（Antibiotic）、安替斯塔辛（Antistasin）以及博待啉（Bdellins）和伊格啉（Eglins）等其它蛋白酶抑制劑。目前國際上是將吸食哺乳動物血液，其唾液腺分泌物中含有水蛭素等多種生物活性物質(zhì)并且在醫(yī)藥上具有廣闊應(yīng)用情景的蛭類動物統(tǒng)稱為醫(yī)學(xué)蛭類。1986年至1990年先后在英國威爾士的斯旺西市、加拿大的多倫多市以及耶路撒冷召開了國際水蛭科學(xué)家學(xué)術(shù)討論會，筆者應(yīng)邀出席了其中兩次會議并在會上發(fā)言介紹了我國蛭類動物研究概況。1990年至2003年先后六次在歐洲各地召開了包括醫(yī)學(xué)蛭類在內(nèi)的國際生物治療學(xué)術(shù)討論會。然而至今我國沒有任何人報道過寬體金線蛭和尖細金線蛭體內(nèi)含有以上任何生物活性物質(zhì)，它們也不吸食哺乳動物的血液，所以在本書中筆者未將其歸入醫(yī)學(xué)蛭類的范圍加以介紹。我國有著豐富的吸食哺乳動物血液，其唾液腺分泌物中含有水蛭素等多種生物活性物質(zhì)并且在醫(yī)藥上具有廣闊應(yīng)用情景的醫(yī)學(xué)蛭類有待我們?nèi)ラ_發(fā)和利用，現(xiàn)將這些醫(yī)學(xué)蛭類的種類特征和生態(tài)分布列述如下。

2  我國醫(yī)學(xué)蛭類的種類特征和生態(tài)分布

蛭類動物（Hirudinea）在動物分類系統(tǒng)中與寡毛類動物（Oligochaeta）作為兩個綱劃歸環(huán)節(jié)動物門（Annelida）的有環(huán)帶亞門（Clitellata）。它們都具有環(huán)帶，又都是雌雄同體動物并通過分泌容納受精卵的卵繭（cocoon）繁殖后代，胚胎發(fā)生也相同，都缺少外骨骼和功能性的葉足。在蛭綱中較高等的類群都有恒定的體節(jié)數(shù)而且又都具有用作運動器官的尾吸盤，其中真蛭亞綱（Euhirudinea）是主要的類群。它們都有32個口后節(jié)，尾吸盤又都由7節(jié)組成，根據(jù)有無可伸縮的吻可以分成為吻蛭目（Rhynchobdellida）和無吻蛭目（Arhynchobdella）。在無吻蛭目中醫(yī)蛭形亞目（Hirudiniformes）較低等，多數(shù)有發(fā)達的顎，每個完全體節(jié)通常5環(huán)或更少。筆者在本書中討論的我國醫(yī)學(xué)蛭類就屬于醫(yī)蛭形亞目醫(yī)蛭科（Hirudinidae）中的醫(yī)蛭屬（Hirudo）和牛蛭屬（Poecilobdella）以及山蛭科（Haemadipsidae）中的山蛭屬（Haemadipsa）。根據(jù)筆者統(tǒng)計，目前我國已發(fā)現(xiàn)醫(yī)蛭屬2種、牛蛭屬6種、山蛭屬10種，它們在醫(yī)藥上都具有廣闊應(yīng)用情景，現(xiàn)將這3屬醫(yī)學(xué)蛭類主要種類的形態(tài)特征及其生態(tài)分布列述如下。

(一) 醫(yī)蛭屬Hirudo Linnaeus, 1758

體中型至大型，長度30-150 毫米。背面通常有縱行的條紋。頭部背面有5對眼，甚明顯。體表感覺乳突通常背面8列，腹面6列。節(jié)IX至XXIII 或XXIV為完全體節(jié)，每節(jié)5環(huán)相等。環(huán)帶占據(jù)15環(huán)，位于X 至XIII 。體內(nèi)嗉囊在節(jié)X 至XIX之間，每節(jié)各有一對大的初生側(cè)盲囊和一對小的次生側(cè)盲囊，末對最大并向后伸至節(jié)XXV。水生種類，已知全世界有17種，我國僅有2種，其區(qū)分見以下檢索表。

  醫(yī)蛭屬分種檢索表

1（2）  背面黃白色縱紋寬闊，灰綠色的縱紋狹窄，腹側(cè)各有一條很細的灰綠色的縱紋，

  陰道囊狹長┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅日本醫(yī)蛭Hirudo nipponia

2 (1)　  背面冬青綠色縱帶寬闊，淡綠色的縱紋狹窄，腹側(cè)沒有細長的縱紋，陰道囊卵

  圓形┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅麗醫(yī)蛭Hirudo pulchra

日本醫(yī)蛭Hirudo nipponia Whitman, 1886 （圖9-1）

身體狹長，略呈圓柱形，背腹稍扁平。體長30-60毫米；最大體寬4.0-8.5毫米；尾吸盤直徑40-5.5毫米。頭部背面有5對眼，大而明顯，在節(jié)II-VI背側(cè)排列成弧形。前3對各占一環(huán)；第3，4對相隔一環(huán)；第4，5對相隔2環(huán)。背面有5條黃白色的縱紋，以中間一條最寬和最長。黃白色的縱紋又將灰綠的底色隔成6道縱紋，以背中兩條最寬闊，背側(cè)的兩對較細。腹面兩側(cè)緣，各有一條很細的灰綠色縱紋。雄性生殖孔位于第31/32環(huán)溝上，雌性生殖孔位于第36/37環(huán)溝上，兩孔相隔5環(huán)。咽部有6條內(nèi)縱褶，背中及腹側(cè)各一對。陰道囊狹長。本種在我國分布很廣，北起東北各省和內(nèi)蒙古，西至四川和甘肅，南達臺灣和廣東，但以長江流域各地數(shù)量較多。廣泛棲息于水田及其與之相通的溝渠、池塘和沼澤中，特別是常年積水或排水不良的漚田和坂心田中數(shù)量最多。在水田里多集中在四角或田邊，也有鉆進田埂泥土中的。每年11月底開始潛入深土中越冬，第二年3月下旬到4月上旬，當(dāng)氣溫達到10-13℃時開始出土活動。在長江中、下游地區(qū)，當(dāng)氣溫升至13-15℃時開始交配，約經(jīng)一個月后開始產(chǎn)繭，再經(jīng)過16-25天孵化，幼蛭即可以從繭中鉆出。通常每繭孵出3-22條幼蛭，多數(shù)10條左右。日本醫(yī)蛭是被中國藥典列入的唯一吸食哺乳動物血液的種類，也是具有很好醫(yī)療效果的種類，可以用于顯微外科手術(shù)后的吸血治療以及水蛭素、水蛭透明質(zhì)酸酶等生物活性物質(zhì)的分離和提取。

圖9-1　 日本醫(yī)蛭Hirudo nipponia Whitman, 1886 背面觀全形圖

  an. 肛門；cs. 尾吸盤；eyes 眼；ggs. 灰綠色的縱紋；

  sen. 體表感覺乳突；yws. 黃白色縱紋. (筆者圖，1996)

  （二） 牛蛭屬Poecilobdella Blanchard, 1893

身體中等大小至大型，長度40-210毫米，體形粗壯。皮膚粗糙，前后端成網(wǎng)狀或有許多疣狀突起。體色艷麗，有線形色斑或條紋，具有綠色、褐色或淡紅顏色。頭部背面5對眼，排列如醫(yī)蛭屬。共有15個完全體節(jié)，各有5環(huán)，在節(jié)IX至XXIII之間。體節(jié)感覺器大而明顯，是區(qū)分體節(jié)的標(biāo)記。兩生殖孔被5-9環(huán)隔開，分別位于節(jié)IX – XIII上。具齒的顎兩側(cè)表面有排列成3或4縱列的唾液腺乳突。雌性生殖器官很特殊，有一個很大的盲囊，陰道長短不一?？傒斅压芘c陰道一起開口向外，或開口到遠離盲囊的陰道管端，或直接開口到盲囊上。水生種類，已知全世界有8種，我國已發(fā)現(xiàn)6種，主要分布在廣東、廣西、云南、海南以及福建等地，其區(qū)分見以下檢索表。

  牛蛭屬分種檢索表

1（5）  陰道短，總輸卵管與其一起開口向外┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅2

2（3）  兩生殖孔被7環(huán)隔開，雌生殖孔在節(jié)XIII的b1/b2上，尾吸盤直徑等于體寬

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅棒紋`牛蛭Poecilobdella javanica

3（4）  兩生殖孔被5環(huán)隔開，雌生殖孔在節(jié)XII的b5/b6上，尾吸盤直徑小于體寬

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅菲牛蛭Poecilobdella manillensis

4（3）  兩生殖孔被9環(huán)隔開，雌生殖孔在節(jié)XIII的b2/a2上，尾吸盤直徑接近體寬

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅遠孔牛蛭Poecilobdella similis

5（1）  陰道有長柄，總輸卵管開口到遠離盲囊的陰道管端，或直接開口到盲囊上 ┅6

6（7）  陰道柄幾乎與盲囊及陰道管的長度相等，總輸卵管開口到遠離盲囊的陰道管端

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅顆粒牛蛭Poecilobdella granulosa

7（8）  陰道盲囊呈卵圓形，總輸卵管直接開口到靠近陰道管的盲囊部位　 ┅┅┅┅

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅湖北牛蛭Poecilobdella hubeiensis

8（7）  陰道盲囊呈棒槌形，總輸卵管直接開口到遠離陰道管的盲囊部位  ┅┅┅┅

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅南京牛蛭Poecilobdella nanjingensis

個體較大，體長40-113毫米或更長；最大體寬3..5 – 20毫米；尾吸盤直徑3 – 14 毫米，明顯小于體寬。身體狹長且扁平?；钪鴷r背面黃褐色或橄欖綠色，背中有一條不顯著的蘭灰色縱紋，體表皮膚體節(jié)感覺器大而明顯。兩生殖孔通常被5環(huán)隔開，雄生殖孔在XI的b5/b6上，雌生殖孔在節(jié)XII的b5/b6上。尾吸盤直徑明顯小于體寬。顎很大，兩側(cè)表面有排列成3或4縱列的唾液腺乳突，通常顎脊上約有150個銳利的齒。射精管粗大，呈紡錘形。精管膨腔短，呈圓球形并被一層疏松的腺體覆蓋著。陰道短，沒有柄，總輸卵管與其一起開口向外。本種在我國分布很廣，北起浙江南部、福建、臺灣、廣東、廣西、海南和香港均有發(fā)現(xiàn)，以兩廣和海南各地數(shù)量較多。生活于水田、溝渠或池塘里，主要吸食水牛和人的血液，造成危害。每當(dāng)插秧或在水田邊洗手造成水的波動時，菲牛蛭隨即漂游而來，甚至順著稻叢爬到人的手上吸血，吸飽血液后有的離去，有的前吸盤松開就像葫蘆狀懸掛在牛的肚皮下。吸一次血可以一年多不再吸血，只要有水仍能夠活得很好。據(jù)中國中醫(yī)研究院基礎(chǔ)理論所歐興長等人的研究證明菲牛蛭所含氨基酸總量為73.11%，在所測十種水蛭中含量最高，其抗凝血酶活性（176抗凝單位/克），在所測四種水蛭中最高。可見用菲牛蛭來分離和提取水蛭素等生物活性物質(zhì)將是十分有前景的。

菲牛蛭 Poecilobdella manillensis (Lesson, 1842) (圖9-2)

 圖9-2　 菲牛蛭 Poecilobdella manillensis (Lesson, 1842)

 a. 背面觀全形圖χ2；b. 雌性和雄性生殖系統(tǒng)ⅹ6

  an. 肛門；cod. 總輸卵管；cs. 尾吸盤；de. 射精管；eb. 射精球；ep. 貯精囊；

  eyes  眼； ga.  蛋白腺；o. 卵巢；od.  輸卵管； pr. 前列腺；sp. 側(cè)中斑點；

  sen.  體節(jié)感覺器；ss. 上緣斑點；vad.  陰道管； vc.  陰道盲囊；vd. 輸精管。

 （筆者圖，1996）

棒紋牛蛭Poecilobdella javanica  (Wahlberg，1855)（圖9-3）

 圖9-3  棒紋牛蛭Poecilobdella javanica  (Wahlberg，1855)

  a. 背面觀全形圖χ1.5；b. 雌性和雄性生殖系統(tǒng)ⅹ4.5

  an. 肛門；at. 精管膨腔；bas. 棒紋；cod. 總輸卵管；cs. 尾吸盤；

  de. 射精管；ep. 貯精囊；eyes  眼； ga. 蛋白腺；o. 卵巢；od.

 輸卵管；ps. 陰莖囊；sp. 側(cè)中斑點；qs. 方形側(cè)緣黑斑；sen. 體節(jié)

  感覺器；te. 精巢；vad.  陰道管； vc.  陰道盲囊；vd. 輸精管。

  （a. 筆者圖；b. 自宋大祥等，1978）

個體很大，體長60 – 170 毫米或更長，個別的可達225毫米；最大體寬為10 – 19 毫米；尾吸盤直徑10 – 19 毫米，常常等于最大體寬。身體狹長且扁平。活著時體表顏色極為艷麗，背面橄欖綠或草綠色，偶爾橄欖棕色。背中自眼間區(qū)至肛門前，有一斷裂為22根棒的黑褐色縱紋。兩生殖孔通常被7環(huán)隔開，雄生殖孔在XI的b5/b6上，雌生殖孔在節(jié)XIII的b1/b2上。皮膚感覺器非常地大而明顯，伸長并與體軸傾斜或成直角。皮膚成網(wǎng)狀，特別是在身體的兩端。尾吸盤很大，直徑常常等于最大體寬的寬度。顎很大，兩側(cè)表面有排列成3或4縱列的唾液腺乳突，通常顎脊上約有100 - 140個銳利的齒。精管膨腔很短，具有比較寬的陰莖囊。陰道也短，沒有柄，總輸卵管與其一起開口向外。本種在我國云南西南部地區(qū)，如西雙版納等地廣泛分布，棲息于水田及其與之相通的溝渠、池塘和沼澤中，數(shù)量眾多。這些孽生地雜草叢生，水流緩慢或停滯。平時它們潛伏在草叢中，當(dāng)人、畜下水產(chǎn)生水波時立即漂游而來并爬到人、畜身上吸血，直至飽食后離去。雨季本種牛蛭最為繁盛，而在干旱季節(jié)里則極少見到，通常潛伏在泥草里越冬。

 （三） 山蛭屬 Haemadipsa Tennent, 1859

 身體小而細長，呈亞圓柱形，從尾吸盤至頭部漸漸變細，大小與形狀又隨取食程度而改變，通常8 – 50毫米長。棋盤格形的皮膚，特別是在頭部及尾吸盤上最明顯。頭部背面有5對大眼，分別位于第2、3、4、5、8環(huán)上或2、3、4、6、9環(huán)上，第4、5對眼被2環(huán)隔開。身體背面通常有縱紋及斑點。完全體節(jié)有5環(huán)。兩生殖孔通常被5環(huán)（節(jié)XIb5/b6 和節(jié) XIIb5/b6）隔開，但少數(shù)種可能被更多的環(huán)隔開。尾吸盤巨大，在其背側(cè)與體部交界處有2或3對葉狀的耳狀突，腹面有許多明顯的輻射肋?？趦?nèi)有3個非常高而明顯的顎，但其上沒有唾液腺乳突，具有銳利并彎曲排列的細齒。射精球不發(fā)達，呈梨形的精管膨腔小，其表面覆蓋有疏松的腺體。陰道分成為狹窄的管部和大而呈圓柱形的盲囊。已知全世界有12種和8亞種，我國已發(fā)現(xiàn)9種和2亞種，主要分布在華南和西南一些潮濕的山林地區(qū)，其區(qū)分見以下檢索表。

山蛭屬分種檢索表

1（2）在第3和第4眼之間幾乎總被多角形小區(qū)隔開，尾吸盤腹面通常有輻射肋74 – 76

  條┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅  3

2（1）在第3和第4眼之間可以或不被多角形小區(qū)隔開，尾吸盤腹面通常有輻射肋71 –

  73條 ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅  4

3（6）背部有3條黑色或暗褐色條紋，中央一條狹細，有時斷裂或完全消失┅┅┅┅

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅森林山蛭Haemadipsa sylvestris

4（5）身體通常紅褐色或橙色，具有黑色斑，背中有一條黃色或黃綠色條紋┅┅┅┅

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅斯里蘭卡山蛭，模式亞種Haemadipsa zeylanica zeylanica

5（8）身體顏色通常易變，但褐色斑點圖案不變，背中較暗的區(qū)域有一條黑色或褐色條紋┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅斯里蘭卡山蛭，敏捷亞種Haemadipsa zeylanica agilis

6（7）背部有3條深褐色條紋，中央一條完整，貫穿前后  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 日本山蛭 Haemadipsa japonica

7（8）背中及兩側(cè)緣上方有3條黑褐色條紋，中央一條粗大 ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 珠峰山蛭 Haemadipsa qomolangma

8（9）背中黃褐色帶狀區(qū)的邊緣有由17對弧形線聯(lián)結(jié)成的兩條黑褐色條紋，中央尚有一

  根細條紋┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 鹽源山蛭 Haemadipsa yanyuanensis

9（10）背中寬闊的淡黃色帶狀區(qū)的邊緣有的地方突向外側(cè)區(qū)內(nèi)，中央及其兩側(cè)有3條

  較細的棕色條紋┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 海南山蛭 Haemadipsa hainana

10（11）背中較寬的淺色帶狀區(qū)兩側(cè)共有6條粗而直的黑色條紋，無中央條紋 ┅┅

 ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 天目山蛭 Haemadipsa tianmushana

11（12）背中寬闊的乳白色帶狀區(qū)共有5個條紋并在各節(jié)上有凸向外的斑塊，中央一條

  狹細 ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅  廣川山蛭 Haemadipsa guangchuanensis

12（11）背中乳白色帶狀區(qū)無中央條紋，內(nèi)背側(cè)一對縱紋粗而直，外背側(cè)一對縱紋細

  ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅   鹽邊山蛭 Haemadipsa yanbianensis

身體短小，略呈圓柱形，前半部逐漸變得狹細。體長10 – 36毫米；最大體寬2 – 5毫米；尾吸盤直徑2.0 – 4.5毫米。體色黃褐，背面有深褐色的縱紋3條，中央一條較粗并貫穿身體前后，腹側(cè)沒有兩條縱紋。頭部背面有5對排列成弧形的大眼，分別位于第2、3、4、5和8環(huán)的背側(cè)，第3、4對眼常在連續(xù)的環(huán)上。完全體節(jié)各有5環(huán)，共有14節(jié)。雄生殖孔位于節(jié)XIb5/b6環(huán)溝上，雌生殖孔位于節(jié)XIIb5/b6環(huán)溝上，兩孔相隔5環(huán)。肛門在最后一環(huán)與尾吸盤交界線上。尾吸盤腹面通常有74 – 76條輻射肋。貯精囊甚大，呈U 形來回折疊。陰道囊是一薄壁的葫蘆形盲囊。本種在我國主要分布于云南西部及西南部（如西雙版納等地區(qū)）、四川西南部，以及臺灣的山地。營陸地生活，棲息溫暖、潮濕的山谷和坡地樹林中，在高山圍成的平壩地帶最多，也見于池塘、溪溝的岸邊和稻田田埂雜草叢以及竹林中，但決不在平原上活動，不水溪亦不會游泳。一般呈點狀或塊狀分布，每平方米的雜草、石頭、泥土范圍內(nèi)可以采集到上百條之多。平時潛伏在草叢根基部分，石縫內(nèi)，苔蘚或落葉與枯枝上。離人、畜1米遠以外即能感覺得到，動作十分敏捷，雨天時更為活躍。在夏秋兩季當(dāng)早晨霧水多時或雨后也極為活躍，靠近中午或下午太陽暴曬時以及干旱季節(jié)里則極少出來活動。在5 – 9月的雨季里山蛭進行繁殖孳生，7月初可見到幼蛭，特別是8月初最多。每下一場雨即孵化出一批幼蛭，長約5 – 9 毫米，呈圓柱形，生長迅速。在10 月至次年3月的旱季里極少見到日本山蛭，通常從11月起在靠近積水的潮濕土里或石縫里蟄伏，次年4 – 5月才出蟄活動。

身體中等大小，呈圓錐形，背面隆起，腹面平坦。體長11 – 36毫米；最大體寬2.5 – 6毫米；尾吸盤直徑2 – 6毫米?；铙w時背面棕色或灰褐色，有許多不規(guī)則的灰黑色或黑色斑點。背中有一條較寬的淺色的帶狀區(qū)，其兩側(cè)共有6條3對粗而直的黑色縱紋。背側(cè)區(qū)色深，多黑褐色斑點。腹面有咖啡色的斑點或由斑點聚集成的斑塊，腹側(cè)有兩對平行的棕色縱紋，腹中為一條狹窄的銀白色區(qū)帶。貯精囊在遠離射精球的地方螺旋盤繞。陰道囊粗而短，前部有一狹窄的頸部。本種僅見于我國，廣泛分布在華東、華中、華南以及西南一些潮濕的山地叢林里。先后在浙江天目山、湖北神農(nóng)架、河南太行山和大別山的南麓、四川峨眉山和鹽邊縣、廣東高州縣以及海南島發(fā)現(xiàn)。棲息于海拔600 – 2200米山地溫暖、潮濕、陰暗的原始森林、灌木叢、冷竹林、溪邊草叢和草坡上，尤其以小道旁邊和枯枝落葉中較多?；顒蛹竟?jié)一般在每年4月下旬夠至9月中、下旬，但以6月下旬至8月中、下旬小雨、雨后或者晨露未干之前時數(shù)量最多，也極為活躍。夏季至秋初在石塊下、枯枝落葉中、草叢和松土內(nèi)以及地表叢生的苔蘚中產(chǎn)繭。冬季僅偶而見與青苔和草被的下面。

 圖9-4  日本山蛭 Haemadipsa japonica Whitman, 1886

  a. 背面觀全形圖χ7；b.頭部背面觀 ⅹ10; c. 雌性和雄性生殖系統(tǒng)ⅹ10

an. 肛門；au. 耳狀突；cs. 尾吸盤；cod. 總輸卵管；de. 射精管；ds. 背感器；

eb. 射精球；ep. 貯精囊；eyes  眼；o. 卵巢；od. 輸卵管；pr. 前列腺；

ps. 陰莖囊； st. 條紋；te. 精巢；va. 陰道囊； vad.  陰道管； vd. 輸精管。

 （a，c筆者圖；b自宋大祥等，1978）

圖9-5 天目山蛭 Haemadipsa tianmushana Song, 1977

a. 背面觀全形圖χ4.5；b. 雌性和雄性生殖系統(tǒng)ⅹ10

an. 肛門；au. 耳狀突；cs. 尾吸盤；cod. 總輸卵管； ds. 背感器；

ep. 貯精囊；eyes  眼；o. 卵巢；od. 輸卵管；pr. 前列腺；ps.陰莖囊；

sp. 斑點；st. 條紋；te. 精巢；va. 陰道囊；vad. 陰道管； vd. 輸精管。

（筆者圖，1996）

3  醫(yī)學(xué)蛭類的唾液腺分泌物及其活性成分

蛭類動物的消化系統(tǒng)都是由口、口腔、唾液腺、食道、嗉囊、腸、直腸和肛門等部分組成的，而所有吸血蛭類的口都開口在前吸盤的腹中，口內(nèi)是一完全圍繞咽的口腔部分，在口腔內(nèi)通常有3個（或2個）呈三角形排列的肌肉性顎，在顎的脊緣上有幾丁質(zhì)或部分是鈣質(zhì)的單列齒，通常唾液腺開口在顎脊上的齒之間，但在牛蛭屬中則開口在顎兩側(cè)分散著的乳突上。由輻射肌和橫肌構(gòu)成的顎能牢固地貼在哺乳動物或人的皮膚上，借助三條或兩條環(huán)形鋸一樣的齒列往復(fù)地動作即可將皮膚割成“Y”形切口。當(dāng)口腔后的肌肉形咽鼓動時，由于負(fù)壓的作用血液可以自由地流入消化道內(nèi)。與此同時，咽頭和食道兩側(cè)的唾液腺分泌包含有水蛭素（hirudin）在內(nèi)的抗凝劑（anticoagulant）、血管舒張劑或叫類組織胺（histamine）以及麻醉劑的分泌物。將其注入傷口并與血液混合，從而使傷口血流量大增，流進嗉囊儲藏的血液不會凝固，來自內(nèi)共生細菌的抗菌素則保護血液使之不致在消化之前就變質(zhì)（見圖9-6）。醫(yī)學(xué)蛭類在醫(yī)療臨床上的許多新用途，無疑是以對其唾液腺分泌物中生物活性成分的深入了解為基礎(chǔ)的。隨著對醫(yī)學(xué)蛭類唾液腺分泌物中生物活性成分認(rèn)識的不斷深化，它們在醫(yī)療臨床以及其它生命科學(xué)中必將發(fā)揮更重要的作用。

圖9-6  日本醫(yī)蛭 Hirudo nipponia 消化系統(tǒng)解剖圖

a.　  消化系統(tǒng)；b. 和 c.  顎及其附屬器官

an. 肛門；cr. 嗉囊;  cs. 尾吸盤；int. 腸；ja. 顎；mth. 口；

oe. 食道；rt. 直腸； salg. 唾液腺； wr.  縱褶。

 （筆者圖，1996）

      (一) 水蛭素（Hirudin）

  關(guān)于天然水蛭素的研究、報道和專利，決大部分是利用歐洲醫(yī)蛭（Hirudo medicinalis）

的頭部和整個身體做材料的，經(jīng)乙醇脫水，然后加丙酮沉淀等一系列的步驟而得到水蛭素粗制品的。1970年德國馬克沃德特（F. Markwardt）采用乙醇分級沉淀、陽離子交換、凝膠過濾以及陰離子交換等步驟獲得了水蛭素純品。1985年沃爾斯曼（P. Walsmann）和馬克沃德特改進了純化方法，采用離子交換與親合色譜相結(jié)合而獲得了高純度的水蛭素。1986年約翰尼斯（Johannes）等人報道了一種五步純化法，其中使用了高效液相色譜新技術(shù)。根據(jù)前人的研究得知水蛭素是由65個氨基酸組成的低分子量多肽，其中谷氨酸和天門冬酰胺的含量較高，分子量為7000左右，含有三個二硫鍵。已分離鑒定出7種異構(gòu)體。二硫鍵是決定其分子構(gòu)型穩(wěn)定性，保持高抗凝活性的關(guān)鍵。當(dāng)二硫鍵被氧化或還原，或者分子發(fā)生了蛋白降解，則失去其抗凝活性。若水蛭素的羧基被酯化，或失去酸性的C-端氨基酸，也會失去與凝血酶結(jié)合的能力。水蛭素的等電點較低，在3.8 – 4.0之間。在室溫下能長期穩(wěn)定，而在70℃以下可以保持活性，干樣也可以保存一年，在水中加入百里酚結(jié)晶亦能保存6個月，其熱穩(wěn)定性隨pH值的減小而增加。水蛭素能被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶破壞，卻不受血纖維蛋白溶酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶A 的影響。水蛭素通過阻塞凝血酶的底物結(jié)合基團致使凝血酶失去活性，處在特異空間部位的水蛭素自由羥基與凝血酶自由氨基通過靜電引力而結(jié)合，產(chǎn)生的絡(luò)合物在凝血酶保持活性的整個PH范圍內(nèi)不會解離。1970年德國馬克沃德特首先報道了一種測定水蛭素含量的方法 - 凝血酶滴定法，即根據(jù)水蛭素與凝血酶反映速度快，在化學(xué)計量學(xué)上呈正相關(guān)關(guān)系，可以用抗凝血酶單位來表示水蛭素的含量，一個抗凝血酶單位(AT-U)是指在37℃下使1個國際單位的凝血酶失活所需的水蛭素量。一個抗凝血酶單位對應(yīng)于0.1微克的純水蛭素，一條成熟的吸血水蛭約含有285個抗凝血酶單位的水蛭素。由于水蛭素具有活性高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易失活以及后期純化成本低的優(yōu)點，是開發(fā)抗凝、溶栓新藥的理想原料。

  （二）水蛭透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase, HAse）

  克勞德（Claude, 1937）首先報道了在醫(yī)蛭提取液中有一種“擴散因子”，后來林克爾等人（Linker et al., 1960）證明這是一種透明質(zhì)酸酶。由于能夠?qū)Ｒ凰馔该髻|(zhì)酸的內(nèi)葡萄糖苷酸鍵，因此是一種內(nèi)切 – β– 葡糖苷酸酶(endoglycuronidase)，只降解透明質(zhì)酸而不降解其它粘多糖，活性能被10ˉ5mol/ LHg++ 完全抑制，但不被肝素抑制。不同于從哺乳動物和其它動物組織中提取出來的內(nèi)切 – β– N乙酰氨基葡糖苷酸酶和從微生物體內(nèi)提取出來的內(nèi)切己糖胺酶。它是分子量為28500的單體蛋白質(zhì)，在50℃以下穩(wěn)定，催化作用的最適pH是5.5，最適溫度是38℃，可溶于50%的硫酸銨溶液，在70%飽和度硫酸銨溶液中的溶解度最小，凍干制劑能保持活力許多個月。水蛭透明質(zhì)酸酶的活力單位被定義為：在pH5.5和38℃的最適條件下，一小時內(nèi)從透明質(zhì)酸中釋放1微克葡萄糖還原當(dāng)量的還原糖所需的酶量。一個這樣的單位大約相當(dāng)于對從哺乳動物來源的透明質(zhì)酸酶規(guī)定的國際單位的20倍，比活力規(guī)定為每毫克蛋白含有的單位數(shù)。赫斯特（Hirst, 1941）證實了水蛭透明質(zhì)酸酶強有力的抗菌性能在于能溶解體內(nèi)和體外細菌的多糖被膜并形成抗體。水蛭透明質(zhì)酸酶能促進藥物迅速穿透皮膚并在皮內(nèi)擴散，在治療血栓性疾病時不被肝素抑制，因而具有比哺乳動物來源的透明質(zhì)酸酶更大的應(yīng)用價值。芭格達薩蘿娃（Bagdasarova, 1969）首先發(fā)現(xiàn)水蛭透明質(zhì)酸酶在治療青光眼（白內(nèi)障）方面有很好的效果。英國人用其治療心血管病，也取得了良好的效果。由于水蛭透明質(zhì)酸酶能降解在細胞間起聯(lián)系作用的粘多糖–透明質(zhì)酸，如果將它與水蛭膠原酶一起使用則可以分散動物組織的細胞，便于挑取單個細胞進行分代培養(yǎng)或細胞克隆，這在生物工程中特別是細胞工程中應(yīng)用很廣泛并已成為眼科和整形醫(yī)學(xué)中的有力工具。不像哺乳動物來源的透明質(zhì)酸酶，水蛭透明質(zhì)酸酶不能降解軟骨素或硫酸軟骨素，故可以在生物化學(xué)上用來原位鑒定透明質(zhì)酸，研究滑液、HA – 纖維蛋白以及其它含HA分子的細胞間基質(zhì)。

  （三）前列腺素(Prostglandins)

  俄羅斯國立莫斯科大學(xué)巴斯柯娃等人(Baskova et al., 1987)應(yīng)用放射免疫方法從歐洲醫(yī)蛭的頭部和整個身體中檢測出前列腺素并且是以6 – Keto – PGF (簡稱 6 – KF) 的前體形式出現(xiàn)，這是一種前列腺素轉(zhuǎn)化成的產(chǎn)物，具有明顯的抑制血小板聚集和抗動脈硬化的功能特性，副作用也小，而血小板聚集是引起動脈粥樣硬化和心肌梗塞的主要起因。6 – KF 前體多為一個具有五碳環(huán)和兩個雙鍵側(cè)鏈的二十碳脂肪酸（PGI2）,它能迅速轉(zhuǎn)化為性能穩(wěn)定的最終產(chǎn)物6 – KF，利用檢測6 – KF的含量變化可以判斷PGI2的含量以及消長變化。研究表明前列腺素是人體內(nèi)分布最廣，作用極大的一類生物活性物質(zhì),它通過對某些激素的調(diào)節(jié)來控制人體平滑肌的收縮、血液供應(yīng)（血壓）、神經(jīng)傳遞、發(fā)炎反應(yīng)、電解質(zhì)出鈉以及血液凝固等生理過程。在實際應(yīng)用中可以作為消散血栓和抗動脈脈粥樣硬化的藥物，是制造一系列具有良好性能藥物的原料。

  （四）安逖斯塔辛（Antistasin）

  美國費城賓夕法尼亞醫(yī)院的生物化學(xué)家加西克等人（Gasic et al., 1983-1986）從一種墨西哥水蛭（Haementeria officinalis）的唾液腺中分離出來一種含有119個氨基酸的多肽，取名安逖斯塔辛（Antistasin，ATS）。無數(shù)動物的和離體的，用水蛭的以及重組體的安逖斯塔辛（rATS）做的實驗證明ATS能通過抑制含有fxα因子的血清酶來阻止血液凝固以及動脈和靜脈血栓形成，抑制培養(yǎng)的主動脈光滑肌增生，也能減少實驗動物腫瘤細胞的擴散，使腫瘤細胞保持運動狀態(tài)而無法聚集在一處。這樣十分有利于腫瘤患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)將腫瘤細胞各個擊破。ATS還在免疫組織化學(xué)實驗中常常用來發(fā)現(xiàn)含有fxα因子的惡性細胞一小細胞癌，是一種具有巨大治療優(yōu)勢的fxα因子抑制劑。fxα因子是一種培養(yǎng)光滑肌細胞的促細胞分裂劑并且能造成從內(nèi)皮細胞來的促細胞分裂劑的釋放。在體內(nèi)，這些影響可能是對內(nèi)膜過度增生促成的主要因素，因此ATS有抑制從內(nèi)膜細胞來的以及在培養(yǎng)中來的fxα因子的作用。在動物模型中已證明ATS的體內(nèi)治療半壽期在30小時以上，它是一種穩(wěn)定的多肽抗凝劑。常用的抗凝劑肝素有較低的治療學(xué)指數(shù)以及較高的出血危險，有可能危及血小板功能的安全并且對抗凝血酶Ⅲ缺乏癥病人的治療是無效的。重組體的安逖斯塔辛（rATS）在體內(nèi)有長的治療半壽期，不會因治療劑量產(chǎn)生出血或影響出血時間。因此rATS是一種對正常止血有最小影響的有效血栓抑制劑。概括地說安逖斯塔辛（ATS）是一種有效的，實用的，具有出血性并發(fā)癥最小危險的抗凝劑，至少有等于促紅細胞生成素（erythropoietin, EPO）一樣的商業(yè)價值。

4 醫(yī)學(xué)蛭類化學(xué)感受器的特異性以及唾液腺分泌物的采集

蛭類動物為了取食、生殖和自身的防御必須不斷地通過光、水波、化學(xué)物質(zhì)及物理刺激來接受周圍環(huán)境的信息，對每種信息又有相應(yīng)的感覺結(jié)構(gòu)。在水蛭身體中部體節(jié)上有由兩極細胞構(gòu)成的皮膚感器（sensillae），這種感器對微弱的水?dāng)_動和光刺激都非常敏感，可以發(fā)現(xiàn)和傳導(dǎo)這些微弱刺激。水蛭對包括食物在內(nèi)的種種化學(xué)刺激，特別是吸血種類對血液刺激的反應(yīng)都局限于頭部背唇及口部皮膚上的化學(xué)感受器(chemoreceptors)。所有的皮膚感受器都是通過神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)，使身體作出相關(guān)行為反應(yīng)的。美國埃利奧特博士（Elliott,1987）發(fā)表了她用掃描和透射電子顯微鏡觀察排列在歐洲醫(yī)蛭頭部及口部皮膚上化學(xué)感受器的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)頭部背唇皮膚上有大小不同的兩類紐扣狀的纖毛墩（mound），較大的一類直徑約35微米，較小的一類直徑約10微米，它們由具有均勻長度的多纖毛細胞組成，這與具有長鞭狀纖毛和短硬纖毛的皮膚體節(jié)感器在形態(tài)和功能上都不相同。除了背唇皮膚上的纖毛墩以外，在口的內(nèi)側(cè)皮膚上還發(fā)現(xiàn)了一類由3一4根短棍棒狀突起構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，也起到化學(xué)感受器的作用。同時她發(fā)現(xiàn)了吸血水蛭對氯化鈉和精氨酸的簡單混合液有如對全血一樣的作用，通過頭部背唇及口部皮膚上的化學(xué)感受器引起取食反應(yīng)。

  圖9-7 吸血水蛭化學(xué)感受器的掃描電子顯微鏡觀察

1 日本醫(yī)蛭頭部背唇化學(xué)感受器掃描電鏡圖；2  日本醫(yī)蛭纖毛感覺墩上的纖毛掃描電鏡圖；3 湖北牛蛭頭部背唇化學(xué)感受器掃描電鏡圖；4 湖北牛蛭纖毛感覺墩上的纖毛掃描電鏡圖；5 日本醫(yī)蛭口部內(nèi)側(cè)皮膚上的短棍棒狀突起掃描電鏡圖；6 湖北牛蛭口部內(nèi)側(cè)皮膚上的短棍棒狀突起掃描電鏡圖　　　　　　　　 （筆者圖，2001）

(一) 掃描電子顯微鏡觀察 

為了弄清我國兩屬吸血水蛭化學(xué)感受器的特異性，筆者與武漢大學(xué)電子顯微鏡室的同事合作做了日本醫(yī)蛭和湖北牛蛭頭部背唇及口部皮膚的掃描電鏡觀察以及取食行為實驗。掃描電鏡觀察結(jié)果證明我國兩種吸血水蛭頭部背唇皮膚上也有兩類大小不等的纖毛感覺墩，呈帶狀排列，約150個左右，每個墩的中央是由長度均一的纖毛狀突起構(gòu)成的紐扣狀結(jié)構(gòu)，前者的纖毛較稠密，后者的纖毛較稀疏。較大的一類纖毛感覺墩在光學(xué)顯微鏡下不具色素斑點，而在掃描電鏡下日本醫(yī)蛭每纖毛感覺墩約有30根等長的纖毛，湖北牛蛭每纖毛感覺墩約有25根等長的纖毛，前者呈稠密的叢狀，后者呈稀疏的環(huán)狀（見照片圖組I: 1, 2 和3，4）。在口部內(nèi)側(cè)皮膚上也有由3 – 4 根短棍棒狀突起構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，日本醫(yī)蛭的突起呈密集叢生狀，湖北牛蛭的突起呈稀疏叢生狀（見照片圖9-7: 5和6）。

（二）　 取食行為實驗 

  為了驗證以上兩種吸血水蛭化學(xué)感受器的分布位置與取食反應(yīng)的關(guān)系，筆者特用兩組小玻璃杯分別盛以新鮮的豬血和牛血，杯口蒙上腸系膜并將其投入內(nèi)有兩種饑餓吸血水蛭的缸中。重復(fù)多次之后發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭頭部背唇及口部皮膚對盛以新鮮豬血的小玻璃杯非常敏感并喜食豬血，湖北牛蛭頭部背唇及口部皮膚對盛以新鮮牛血的小玻璃杯非常敏感并喜食牛血。同時又用經(jīng)過手術(shù)切除頭部背唇和口部皮膚以及只部分切開而不摘除頭部背唇和口部皮膚的兩種饑餓吸血水蛭做了以上實驗，重復(fù)多次之后發(fā)現(xiàn)切除頭部背唇和口部皮膚的個體對盛有新鮮豬血和牛血的小玻璃杯均無任何取食反應(yīng)發(fā)生，然而部分切開又不摘除頭部背唇和口部皮膚的個體對以上的小玻璃杯有與不切除頭部背唇和口部皮膚的個體同樣的取食反應(yīng)發(fā)生。這進一步證明了兩種吸血水蛭的化學(xué)感受器均分布在頭部背唇和口部皮膚上。

（三）　 吸血水蛭化學(xué)感受器的特異性以及唾液腺分泌物的采集 

  為了驗證豬血和牛血中何種成分可以通過兩種吸血水蛭化學(xué)感受器引起取食反應(yīng)。筆者用三組小玻璃杯分別盛以哺乳動物血液中均含有的150mM氯化鈉，1mM L-精氨酸以及150 mM 氯化鈉和1mM L-精氨酸，杯口蒙上腸系膜并將其投入內(nèi)有兩種饑餓吸血水蛭的缸中。重復(fù)多次之后發(fā)現(xiàn)兩種饑餓的吸血水蛭均對盛有150 mM 氯化鈉和1mM L-精氨酸的小玻璃杯非常感興趣，有如取食血液一樣地取食這種混合液。這種對哺乳動物血液中固有成分（氯化鈉和精氨酸）必須濃度的選擇性識別是專一的，這在引起起取食反應(yīng)的過程中起決定作用。由于氯化鈉和精氨酸都是以很高的濃度存在于哺乳動物血液和汗液中的，我們可以利用哺乳動物的血液和汗液在野外誘撲各種吸血水蛭，也可以利用必須濃度的氯化鈉和精氨酸在室內(nèi)從饑餓的活體吸血水蛭體內(nèi)大量提取重要的心血管藥物原料一醫(yī)學(xué)蛭類唾液腺分泌物。一條饑餓的活體吸血水蛭可以反復(fù)使用6 – 7 次，這比用頭部或整個身體勻漿后做生化提取、分離和純化要節(jié)省大量的試劑、時間和金錢。吸血水蛭唾液腺分泌物大量提取技術(shù)的解決，將大大促進醫(yī)學(xué)蛭類的藥物開發(fā)和利用。

5  醫(yī)學(xué)蛭類唾液腺分泌物活性成分的分離、純化與活力測定

(一) 水蛭素的分離、純化與活力測定 

  此段以我國產(chǎn)的日本醫(yī)蛭為對象，先將其充分饑餓再采用以上唾液腺分泌物的采集方法大量提取唾液腺分泌物，置冰箱中冷凍保存待用。解凍后取250 – 300 ml加進4倍置冰箱中4℃下預(yù)冷的含15%水的冷丙酮，攪拌后置冰箱中4℃下讓其沉淀過夜，次日吸出上清丙酮并離心，在所得沉淀中加入預(yù)冷的三氯乙酸（約25 ml）使其溶解，離心除去殘渣，待上樣進行柱層析。

  陰離子交換柱層析  取適量二乙基氨基纖維素陰離子交換劑（DEAE-C52 ）加蒸餾水使其膨脹，按常規(guī)方法依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及 0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分鐘后用蒸餾水洗滌至中性。裝柱（2cm x 60cm）至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L 檸檬酸鈉緩沖液平衡；用5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進行梯度洗脫并用核酸蛋白檢測儀記錄繪制出洗脫曲線，分段收集洗脫液，流速為30ml/小時。經(jīng)檢測將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，再用雙縮脲法測總蛋白質(zhì)含量，繼續(xù)以下凝膠過濾柱層析。

雙縮脲法測總蛋白質(zhì)含量  取一系列試管分別加進0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液（6mg/ml）,用水補足至2ml，然后分別加進4ml的雙縮脲試劑（每

升溶液中含1.50g CuSO4? 5H2O和 6.0gNaKC4H4O6? 4H2O, 30gNaOH)，在室溫下放置30分鐘，用721分光光度計在540nm處比色，光密度分別為0，0.066，0.135，0.210，0.285，0.340。以光密度為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白（BSA）含量為橫坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。取2.0 ml于透析袋中用甘油濃縮后的樣品按上述方法測540nm處的比色，便可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量的微克數(shù)。用測得的蛋白質(zhì)含量結(jié)合用凝血酶滴定測得的數(shù)據(jù)，便可以求算出樣品中水蛭素的比活力。日本醫(yī)蛭唾液腺分泌物提取液純化總得率為15%；純化后的產(chǎn)物的比活力為6708 AT-U/mg 蛋白。

凝膠過濾柱層析  取適量的交聯(lián)葡聚糖離子交換劑（Sephadex-G25）加蒸餾水浸泡4小時，按常規(guī)方法用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 混合液浸泡半小時，抽濾除去鹼液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡。裝柱（1.5cm x 50cm）至所需高度，用pH7.4的0.1mol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的透析袋甘油濃縮液上樣，洗脫并用核酸蛋白檢測儀記錄繪制出洗脫曲線，分段收集洗脫液，流速為90ml/小時。分別檢測活力，將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮。再檢測活力后，待用DU-70貝克曼分光光度計在200nm至400nm波長范圍內(nèi)掃描，便能確定所得產(chǎn)物的純度。

凝血酶滴定法檢測水蛭素的含量  這是德國馬克沃德特（Markwardt，1970）首先報道的一種測定水蛭素含量的方法，這種測定方法用得十分廣泛，至今仍然被美國Sigma 生化試劑公司和英國水蛭生物藥物公司作為標(biāo)準(zhǔn)測定方法而列入水蛭素的規(guī)格和價目表中。具體步驟是用微量進樣器將50微升未知水蛭素含量的被測日本醫(yī)蛭唾液腺分泌物提取液加至溶有0.5%牛血纖維蛋白原的200微升pH7.4的 0.1mol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液中，混合均勻后在室溫下以每分鐘1微升的速度遞次加入100抗凝單位/毫升標(biāo)準(zhǔn)凝血酶稀釋液并及時攪拌，讓其與牛血纖維蛋白原和未知水蛭素含量的被測溶液充分混合均勻，當(dāng)在1分鐘內(nèi)出現(xiàn)膠凍狀凝塊時即為滴定終點。從滴定的凝血酶量，可以推算出被測溶液中水蛭素的活力單位。研究表明水蛭素與凝血酶之間相互作用的部位主要處于水蛭素分子的C端。測定結(jié)果表明日本醫(yī)蛭唾液腺分泌物提取液中水蛭素的含量為4抗凝單位/毫升（AT-U/ ml）。凝血酶滴定法是一種簡易、省時、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的水蛭素活力測定方法，然而測定結(jié)果受到環(huán)境溫度和凝血酶活力的影響很大，也受到操作人員對方法掌握的熟練程度的影響。氣溫太高或太低、凝血酶活力喪失以及試劑稀釋不恰當(dāng)均能造成測定結(jié)果的較大偏差，其最適溫度范圍應(yīng)在25 -37℃之間。除此之外，還有分光光度法、光散射法和血纖維蛋白肽A 放射免疫法等幾種方法可以采用，這里不加多寫。

（二）　 蛭透明質(zhì)酸酶的分離、純化與活力測定

通過硫酸銨分級沉淀進行酶的分離與純化  分別取一定體積的日本醫(yī)蛭和湖北牛蛭唾液腺分泌物提取液，緩慢加固體硫酸銨至40%飽和度，在冰浴中攪拌10分鐘，并在700轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘，取上清液調(diào)硫酸銨飽和度至80%，同上離心取沉淀，將此沉淀懸浮于10 ml pH7.0的70%飽和度硫酸銨溶液中，充分?jǐn)嚢璨⑼想x心取沉淀，溶于5 ml pH7.0的50%飽和度硫酸銨溶液中，同上離心取上清液，裝入透析袋中對無離子水透析，直至用10% BaCl2檢測無沉淀時終止，量取透析后液體體積，留適量用作測酶活及測蛋白質(zhì)含量。整個過程采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法監(jiān)測酶活。

通過二乙基氨基纖維素陰離子交換劑（DEAE-C52 ）柱層析進一步分離與純化酶  將預(yù)處理的DEAE-C52裝柱（1.5cm x 50cm），用pH7.1的0.05mol/L  Tris-HCl 緩沖液平衡過夜。上樣后，待記錄儀基線平穩(wěn)后再依次用pH6.0的0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液，pH5.6的0.1 mol/L 乙酸緩沖液（含0.1 mol/L NaCl）, pH4.0的0.1 mol/L 乙酸緩沖液（含0.2 mol/L NaCl）洗脫，流速為40ml/小時。測定結(jié)果表明pH5.6下的洗脫峰水蛭透明質(zhì)酸酶（HAse）酶活力最高。將該峰的洗脫液裝入透析袋中對無離子水透析，然后加入3倍體積的冷丙酮沉淀，最后將沉淀抽干置-20℃下保存。

制定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線  用15℃下烘干到衡重的葡萄糖配制250微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)液，在成梯度容量的各標(biāo)準(zhǔn)液中加3毫升3，5-二硝基水楊酸(DNS),在沸水浴中5分鐘顯色后用自來水冷卻至室溫并加蒸餾水稀釋。用72型分光光度計在550nm處測定光密度OD值 ,用OD550對葡萄糖微克數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中酶活力的測定  在0.8 ml pH5.5的0.02 mol/L 檸檬酸緩沖液中加 0.2 ml　　  的5mg/ml透明質(zhì)酸溶液和0.2 ml 待測樣品于38℃水浴中精確保溫30分鐘，然后將試管浸入沸水中終止反應(yīng)。取0.1 ml以上降解液加3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑顯色，同時用0.2 ml煮沸的酶液作對照測A550（吸光率），根據(jù)光密度OD550從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出還原糖的微克數(shù)。每毫升樣品中酶活力單位數(shù)（I.U./ml）= 還原糖在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的微克數(shù)X 12。結(jié)果表明用常規(guī)糖定量3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測水蛭透明質(zhì)酸酶（HAse）較傳統(tǒng)濁度法更簡單和可靠，靈敏性和專一性都較好。日本醫(yī)蛭的產(chǎn)率為17.8%，湖北牛蛭的產(chǎn)率為14.3%。

用福林(Folin)-酚試劑法測蛋白質(zhì)含量  首先按照常規(guī)方法測定吸光率A540，制定出牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)含量(mg/ml) = A540 x 3.91,取1.0 ml樣品按上法測A540便可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到對應(yīng)的微克數(shù)。用測得的蛋白質(zhì)含量可以推算出樣品的比活力。結(jié)果表明日本醫(yī)蛭的比活力為3529u/mg, 湖北牛蛭的的比活力為2352 u/mg。從以上結(jié)果看出，兩者在分離和純化之后比活力都提高很多，且比活力之比在純化之后下降了。從理論上看，經(jīng)過純化之后兩者的比活力應(yīng)該很接近，但其比活力之比仍大于1，這說明湖北牛蛭純化的結(jié)果不如日本醫(yī)蛭理想。