關(guān)于重組水蛭素及其在我國(guó)的研究進(jìn)展

由于用醫(yī)學(xué)蛭類提取和純化出天然水蛭素非常困難，產(chǎn)量太少大大限制了對(duì)它的研究和應(yīng)用。近二十年來，分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)迅速發(fā)展，使得大量合成重組水蛭素成為可能，從而推動(dòng)了重組水蛭素在藥理學(xué)和醫(yī)療臨床方面的研究工作。自從1986年以來，國(guó)外及我國(guó)國(guó)內(nèi)已有許多實(shí)驗(yàn)室利用DNA重組技術(shù)將化學(xué)合成的水蛭素基因克隆進(jìn)大腸桿菌和酵母細(xì)胞中，并得到了具有生物活性的重組水蛭素。從醫(yī)學(xué)蛭類頭部提取RNA,再應(yīng)用CDNA法合成水蛭素基因也獲得了成功。目前國(guó)外已有多家生物技術(shù)公司正在盡力將重組水蛭素開發(fā)成為治療腦心血管疾病的新藥，如法國(guó)的Transgene公司和Sanofi公司，德國(guó)的Genbiotec公司和Hoechst 公司，瑞士的Ci-ba-Geigy公司，美國(guó)的Sri公司和Biagen公司等。據(jù)我國(guó)的國(guó)外醫(yī)藥雜志報(bào)道歐共體已批準(zhǔn)Novartis公司的重組水蛭素上市，美國(guó)批準(zhǔn)了Medicines公司的重組水蛭素衍生物（片段）比伐盧定（Bivalirudin, Angiomax TM）上市，德國(guó)Hoechst Marion Roussel公司的抗凝藥Lepirudin (商品名Refludan ；化學(xué)名 1 - L - 蘇氨酸-63-脫硫水蛭素)已在歐美上市。在美國(guó) Sigma生化試劑公司現(xiàn)今的產(chǎn)品價(jià)目表中也列出了用酵母菌細(xì)胞生產(chǎn)的重組水蛭素以及各種重組水蛭素片段的規(guī)格和價(jià)格（見附錄I）。我國(guó)也有多個(gè)科研院所和高等院校正在用不同的方法進(jìn)行重組水蛭素的合成研究和藥物開發(fā)，國(guó)家也已將其列為“八五”科技攻關(guān)項(xiàng)目,其中復(fù)旦大學(xué)分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室宋后燕教授領(lǐng)銜研究的“注射用基因工程雙功能水蛭素”獲得國(guó)家有關(guān)部門批準(zhǔn)正式進(jìn)入臨床研究。北京大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系朱圣庚教授領(lǐng)銜研究的轉(zhuǎn)基因水蛭素技術(shù)已轉(zhuǎn)讓給汕頭雙駿生物醫(yī)藥有限公司。現(xiàn)將有關(guān)方面的國(guó)內(nèi)、外情況分別介紹如下。

(一) 重組水蛭素的合成 

 目前各國(guó)合成重組水蛭素主要采用了以下幾種方法：

Bergmann, C. 等人（1986）在 Hoppe-Saler生物化學(xué)雜志第367期上報(bào)道了應(yīng)用化學(xué)合成的寡聚脫氧核苷酸，通過酶連接到水蛭素基因226-bpDNA上。在大腸桿菌中，在乳糖啟動(dòng)子的控制下，水蛭素的合成基因與β-半乳糖苷酶一起作為一個(gè)融合蛋白獲得表達(dá)，或者在αPL啟動(dòng)子控制下，作為一個(gè)非雜交蛋白獲得表達(dá)。這種非雜交蛋白產(chǎn)物具有水蛭素的生物活性。具體做法是根據(jù)已知水蛭素的氨基酸序列，設(shè)計(jì)18個(gè)寡聚脫氧核苷酸片段。為了促進(jìn)整個(gè)基因的合成，將其分成A, B, C三段，并裝配有適當(dāng)?shù)南拗泼傅那形稽c(diǎn)。作者在基因裝配方面用了兩種方法，一種是首先合成短的交疊互補(bǔ)寡聚核苷酸（10-30核苷酸單位），再用酶促連接方法產(chǎn)生雙鏈DNA片段；另一種是合成較大的單鏈DNA片段（30核苷酸單位以上），經(jīng)退火得到完整的雙鏈DNA片段。后者稱為補(bǔ)平法，只需合成和純化少量的寡核苷酸，就能獲得5 – 10倍的雙鏈基因片段，又能去掉磷酸化步驟。補(bǔ)平法制備全長(zhǎng)的雙鏈DNA片段產(chǎn)率較高，片段的克隆也更容易完成。用非融合蛋白表達(dá)水蛭素更加合適，

Dodt, J. 等人（1986）在FEBS Lett. 第202卷第2期上報(bào)道了應(yīng)用鹼性磷酸酶信號(hào)序列在大腸桿菌中表達(dá)、分泌和加工水蛭素。首先合成一個(gè)為大腸桿菌鹼性磷酸酶（PHOA）信號(hào)肽編碼的DNA片段，并將此片段插入PKK223-3表達(dá)載體中。在此信號(hào)肽的末端緊隨Hind酶切位點(diǎn)。將化學(xué)合成的水蛭素基因插入此酶切位點(diǎn)中，在半乳糖苷酶啟動(dòng)子的控制下，該雜交蛋白得到表達(dá)，并分泌到大腸桿菌的外周胞質(zhì)中。具體做法是寡聚脫氧核苷酸SP1和SP2以固體硅膠作支持劑手工合成，SP3和SP4用磷酸酰胺法在DNA合成儀上進(jìn)行裝配，然后用HPLC純化這些寡核苷酸。用這四個(gè)合成的寡聚脫氧核苷酸SP1至SP4合成一個(gè)為鹼性磷酸酶信號(hào)肽編碼的DNA片段。此DNA片段插入PKK223-3表達(dá)載體的EcoR1和Hind酶切位點(diǎn)處。形成的載體PHIR21含有水蛭素基因，該載體在一半乳糖苷酶啟動(dòng)子的控制下，進(jìn)行融合蛋白的合成，這個(gè)合成過程從N端開始，首先合成信號(hào)肽PhoA，緊接著是水蛭素的合成。大腸桿菌BMH71-18在含有氨芐青霉素（100μg/ml）LB培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)，應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)其濃度為0.5mM。水蛭素活性，是在25℃下通過生色底物ChromzymTH來測(cè)定。基因表達(dá)誘導(dǎo)24小時(shí)后，從大腸桿菌（BMH71-18）載體 PHIR21的胞質(zhì)抽提液測(cè)得350AT-U的水蛭素抗凝活性單位。將大腸桿菌的胞質(zhì)抽提液通過DEAE-Sephadex-25柱進(jìn)行分離純化并用HPLC進(jìn)一步純化，最后得到的兩個(gè)色譜峰的抗凝活性為550 – 570 AT-U/mg。

Loison, G.等人（1988）在生物技術(shù)學(xué)雜志(Bio/technology)第6期上報(bào)道了用酵母細(xì)胞有效地生產(chǎn)重組水蛭素變異體Ⅱ(r–HV–2 )。他們將成熟的水蛭素編碼序列放入酵母Mfal基因前序列框架中，可轉(zhuǎn)錄不同融合基因的多拷貝質(zhì)粒含有Mfa1的啟動(dòng)子，在尿嘧啶原營(yíng)養(yǎng)型中用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一個(gè)酵母菌株。從其酵母培養(yǎng)基上清液中蛋白質(zhì)的分析表明，在所有的情況下水蛭素都能有效地分泌。但是只有緊隨著YSEF裂解位點(diǎn)含有成熟的水蛭素變異體Ⅱ（HV–2）序列的前體，才能夠正確加工產(chǎn)生具有生物活性的水蛭素。具體做法是從醫(yī)學(xué)蛭類頭部分離出一種多A?RNA,制備一個(gè)c – DNA庫(kù)。從此c – DNA庫(kù)（天然水蛭素編碼HV–2）分離出一個(gè)Pst1片段，克隆進(jìn)PBR322  的Pst1位點(diǎn)(pTG717)。從pTG717所得的Pst1片段（含有水蛭素基因）經(jīng)純化后，用Hinf1  和Aha111酶解，此Hinf1―Aha111片段(225bp)與合成的寡核苷酸混合。這些設(shè)計(jì)的寡核苷酸用以重新構(gòu)建成熟的水蛭素變異體Ⅱ（HV–2） 編碼序列，并在5′―末端加上一個(gè)ATG起始密碼。重新構(gòu)建的基因插入 pTG880的Bg111和Sma1位點(diǎn)，新生成的質(zhì)粒pTG 882 中，水蛭素序列在PGK轉(zhuǎn)錄信號(hào)控制下進(jìn)行表達(dá)。質(zhì)粒pTG1819裝配pTG 881，這里的Mfa1編碼序列是在PGK啟動(dòng)子控制下，取代它原來的啟動(dòng)子。在pTG1818發(fā)酵液中，用反相層析HPLC進(jìn)行純化，得到一個(gè)重組水蛭素活性峰的比活性為13000 AT-U/mg，得到另一較低的重組水蛭素活性峰的比活性為4000 AT-U/mg。 在pTG1833發(fā)酵液中，用反相層析HPLC進(jìn)行純化，得到一個(gè)重組水蛭素活性峰的比活力為13000 AT-U/mg，N端序列與水蛭素變異體Ⅱ（HV–2）序列相符合。水蛭素分子N端的1 – 5個(gè)氨基酸與C端區(qū)形成緊密的結(jié)合，而此結(jié)合狀態(tài)直接影響水蛭素的活性。當(dāng)天然水蛭素（HV–2）的N端略微延伸幾個(gè)氨基酸，將大大降低水蛭素的活性。當(dāng)N端多加一個(gè)蛋氨酸時(shí)，重組水蛭素變異體Ⅱ（r–HV–2）抗凝血酶降低活性5倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用大腸桿菌生產(chǎn)水蛭素的產(chǎn)率很低，原因之一是在其N端需要多加一個(gè)蛋氨酸作為起始密碼，另一原因是水蛭素在大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)生蛋白質(zhì)的降解作用。用酵母菌可將異質(zhì)蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，而且形成的多肽不含有多余的起始密碼一蛋氨酸。

  中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所申同建等人（1991）在中國(guó)科學(xué)B集第8期上報(bào)道了人工合成的水蛭素基因在酵母中的表達(dá)。他們根據(jù)水蛭素變異體Ⅱ（HV–2）氨基酸序列設(shè)計(jì)并合成了水蛭素基因，在酵母α– 因子表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。經(jīng)過誘變得到穩(wěn)定的攜帶水蛭素表達(dá)質(zhì)粒的酵母菌株，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 – 48小時(shí)后，可以在培養(yǎng)液中測(cè)得10 – 20AT-U/ml分泌水蛭素表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)純化得到色譜純(HPLC)的水蛭素，其N端氨基酸序列與天然產(chǎn)物完全相同，具有強(qiáng)烈的抗凝血和抑制凝血酶活性。從500 ml培養(yǎng)液中可以得到約3000 AT-U的純水蛭素，比活力為6600 AT-U/mg。

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所郭娟、王荷碧等人（1995）在中華血液學(xué)雜志第9期上報(bào)道了水蛭素變異物1活性多肽基因的化學(xué)合成及克隆。她們根據(jù)水蛭素變異物（HV1）的氨基酸序列，選擇在原核細(xì)胞中高表達(dá)的密碼子，設(shè)計(jì)了221個(gè)鹼基對(duì)長(zhǎng)度的HVI DNA片段。分成14個(gè)寡核苷酸片段進(jìn)行化學(xué)合成，各片段連接成為HVI全基因后，細(xì)EcoRT、BamHI切點(diǎn)克隆入PUC18/19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105，蘭白菌落法篩選陽性克隆。限制性內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)以及DNA序列分析證實(shí)了HVI全基因的正確性，克隆成功并獲得了活性表達(dá)。

上海醫(yī)科大學(xué)分子遺傳研究室顧銀良和羅春真（1996）在上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)第3期上報(bào)道了水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。他們?cè)O(shè)計(jì)了特異性更高的水蛭素新變異體，化學(xué)合成了編碼水蛭素基因，并融合了RGD3肽編碼序列。通過連接、克隆、酶切篩選、DNA序列分析得到真核表達(dá)質(zhì)粒pAPR – HD, 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHL細(xì)胞，經(jīng)G418 篩選，獲得了表達(dá)克隆。結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)液中，重組水蛭素衍生物的活性達(dá)到10AT-U/ml, 并有抗血小板凝集作用。結(jié)論：水蛭素新變異體具有預(yù)防血栓性疾病的應(yīng)用前景，但其表達(dá)水平和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。

  軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物研究所劉剛和慕邵峰（1998）在中國(guó)藥物化學(xué)雜志第1期上報(bào)道了合成水蛭素羧端肽段及其類似物的抗凝活性。水蛭素C端肽段為抗凝的活性部位。為了進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系的研究，構(gòu)建C端肽段類似物的化學(xué)庫(kù)，他們首先利用同步多中心合成技術(shù)合成了7種水蛭素C端肽段類似物。經(jīng)HPLC制備純化，純度為96%以上。電噴霧質(zhì)譜確認(rèn)了合成肽的分子量。用新鮮人血漿進(jìn)行了凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)，凝血酶時(shí)間(TT)及凝血酶原時(shí)間(PT) 測(cè)定。顯示水蛭素羧端20個(gè)氨基酸殘基肽片是抗凝活性必須的基本骨架。其中應(yīng)當(dāng)包含封閉凝血酶催化位點(diǎn)和陰離子結(jié)合位點(diǎn)的特異結(jié)合序列以及保持量者間多功能性的連接橋。該院生物工程研究所劉鳳云和李秀珍（1998）在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊第12期上報(bào)道了水蛭素12肽與低分子量尿激酶融合基因的構(gòu)建和表達(dá)。為了獲得即能抗栓又能溶栓的雙功能蛋白，并在大腸桿菌中表達(dá)，她們通過化學(xué)合成水蛭素12肽基因編碼序列，采用DNA重組技術(shù)將水蛭素12肽基因片段連接到低分子量尿激酶cDNA片段51端，構(gòu)建成融合基因。結(jié)果構(gòu)建成了水蛭素12肽與低分子量尿激酶的融合基因，并在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。重組融合蛋白具有抗栓與溶栓的雙功能。得出的結(jié)論是：運(yùn)用DNA重組技術(shù)可將兩種不同功能的蛋白合理地融合在一起，使其具有溶纖活性和抗凝活性。

中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥教研室譚樹華、吳梧桐等人（1998）在藥物生物技術(shù)第1期上報(bào)道了水蛭素變異體Ⅲ（HV3）基因合成、克隆與鑒定。她們根據(jù)水蛭素變異體Ⅲ（HV3）的氨基酸序列設(shè)計(jì)并合成了六對(duì)共12條寡核苷酸鏈。經(jīng)退火配對(duì)，連接成完整的HV3編碼基因228bp)，并克隆到載體 PUC18中。通過α-互補(bǔ)及小量抽提質(zhì)粒酶切鑒定，篩得陽性重組水蛭素，克隆其中PUCH33，經(jīng)正、反向引物測(cè)序、鑒定，與設(shè)計(jì)的序列完全相符。譚樹華、吳梧桐等人（1999）在中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)第1期上報(bào)道了在大腸桿菌中分泌表達(dá)水蛭素變異體Ⅲ基因的初步研究。她們?cè)O(shè)計(jì)合成了兩對(duì)（四條）寡核苷酸鏈，經(jīng)退火、拼連成L―門冬酰胺酶信號(hào)肽簡(jiǎn)并基因，同時(shí)利用密碼子的簡(jiǎn)并性在該基因3′端基因內(nèi)引入了一個(gè)Nhe I限制酶切位點(diǎn)。此外，用PCR技術(shù)在HV3基因5′端引入Nhe I限制酶切位點(diǎn)，利用該酶切位點(diǎn)將信號(hào)肽基因與HV3基因進(jìn)行連接并且保護(hù)原有閱讀框架不變，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pUCSH，測(cè)序結(jié)果表明融合基因核苷酸序列與設(shè)計(jì)要求完全一致，將該融合基因插入pKK2332中構(gòu)建成HV3分泌表達(dá)質(zhì)粒pKSH并在大腸桿菌中分泌表達(dá)。譚樹華、吳梧桐等人（1999）在中國(guó)生化藥物雜志第1期上報(bào)道了新型大腸桿菌融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水蛭素變異體Ⅲ基因研究。她們選用大腸桿菌L―門冬酰胺酶(ASPs II)高效表達(dá)質(zhì)粒PKA作為融合表達(dá)載體，將水蛭素變異體Ⅲ（HV3）人工合成編碼基因插入pKA質(zhì)粒的ASPs II編碼基因 ansB中，使ASPs II 1N端的89個(gè)氨基酸殘基通過甲硫氨酸殘基與HV3形成融合蛋白，從而構(gòu)建成ASPsII – HV3 融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pKAH，通過基因操作將該質(zhì)粒的低拷貝數(shù)復(fù)制原點(diǎn)更換成pUC 高拷貝數(shù)復(fù)制原點(diǎn)，進(jìn)而構(gòu)建成 ASPs II – HV3融合蛋白高效表達(dá)載體pUKAH。該質(zhì)粒在大腸桿菌JM105宿主細(xì)胞中表達(dá)后，融合蛋白(15.6KD)占細(xì)菌總蛋白的105%。該校李兵、譚樹華等人（2002）在藥物生物技術(shù)第2期上報(bào)道了水蛭素基因工程菌培養(yǎng)。他們采用了正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了水蛭素基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，得到較佳的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，優(yōu)化了發(fā)酵工藝。搖瓶培養(yǎng)22小時(shí)，發(fā)酵液抗凝血酶活性可達(dá)850 AT-U/ml。25升發(fā)酵罐培養(yǎng)18小時(shí)，發(fā)酵液中抗凝血酶活性亦可達(dá)800 AT-U/ml。水蛭素表達(dá)量在原有基礎(chǔ)上有了大幅度提高，為大規(guī)模培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)建立了可行路線。

中國(guó)中醫(yī)研究院基礎(chǔ)所王克林、徐琦等人（1999）在中國(guó)海洋藥物第1期上報(bào)道了熱啟動(dòng)聚合酶鏈反應(yīng)快速擴(kuò)增水蛭肽基因的研究。他們指出應(yīng)用這種技術(shù)可使DNA為221bp, 這與理論預(yù)計(jì)相符，同時(shí)確定了退火溫度為50℃時(shí)的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果較好，這為進(jìn)一步探討水蛭肽基因克隆、表達(dá)與調(diào)控規(guī)律打下了基礎(chǔ)。徐琦、王克林等人（2000）還在中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志第5期上報(bào)道了水蛭抗凝多肽基因在大腸桿菌中的表達(dá)。他們應(yīng)用我國(guó)產(chǎn)的吸血水蛭通過逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR技術(shù)取得了水蛭素基因并將其克隆進(jìn)質(zhì)粒PGEM – 32f(+)中，應(yīng)用所得水蛭素基因克隆進(jìn)我國(guó)特有的表達(dá)載體PBV – HV菌株。該菌株通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)獲得了高效表達(dá)并得到具有生物活性的水蛭素。菌體粗提液經(jīng)乙醇分級(jí)沉淀、分子篩柱層析和HPLC純化得到了純品水蛭素。

南京大學(xué)生物化學(xué)系范堯、王進(jìn)等人（2001）在生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展第1期上報(bào)道了一種水蛭素類融合蛋白與凝血酶作用的動(dòng)力學(xué)模擬。他們通過將凝血酶抑制劑水蛭素的C端20肽片段嫁接到血小板結(jié)合蛋白Annexin V上，可以期望獲得即具有抗凝血活性，又具有導(dǎo)向性的新型工程蛋白質(zhì)分子，利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)手段模擬該融合蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，并對(duì)該融合蛋白對(duì)凝血酶的抑制作用進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬，驗(yàn)證了上述想法。

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院心內(nèi)科穆瑞斌、秦永文等人（2002）在中華醫(yī)學(xué)雜志第9期上報(bào)道了重組多功能抗凝多肽的表達(dá)及活性測(cè)定。他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)具有多重抗凝功能的重組多肽分子結(jié)構(gòu)，由谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（STST）作為載體蛋白與重組抗凝多肽融合而成。編碼重組抗凝多肽的DNA序列是根據(jù)氨基酸序列逆向翻譯后經(jīng)人工合成，并插入表達(dá)質(zhì)粒pGE x 5 x 3 中，與其中的編碼GST序列的3′端融合。采用大腸桿菌DH500進(jìn)行原核表達(dá)。應(yīng)用親和層析的方法得到純化的融合蛋白。重組抗凝多肽含有31個(gè)氨基酸，由3個(gè)功能部分組成。

長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和長(zhǎng)春生物制品研究所翁梁、劉丹等人（2002）在中國(guó)生化藥物雜志第2期上報(bào)道了PCR方法在水蛭素基因克隆方面的新用途。他們改進(jìn)了傳統(tǒng)的PCR方法，根據(jù)已知天然水蛭素基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)123 nt且3′端具有15 nt互補(bǔ)序列的單鏈DNA。通過低溫復(fù)性使其互補(bǔ)結(jié)合后，進(jìn)行延伸反應(yīng)，得到微量雙鏈水蛭素基因。再以該基因作為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果獲得了水蛭素基因。此法對(duì)于獲得象水蛭素基因這類序列，已知片段不太長(zhǎng)，且為不易得到的基因提供了一種可行方法。

南京理工大學(xué)化工學(xué)院李大力等人（2002）在生物技術(shù)第3期上報(bào)道了水蛭肽基因的克隆及其轉(zhuǎn)化甘藍(lán)。他們將合成的水蛭肽基因轉(zhuǎn)移至甘藍(lán)，構(gòu)建了水蛭素的植物表達(dá)載體PROK – L，使用甘藍(lán)的下胚軸和根瘤農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化，再生植株經(jīng)卡那霉素篩選，檢測(cè)結(jié)果表明所得到的抗性植株均為轉(zhuǎn)化基因植株，獲得了轉(zhuǎn)化水蛭肽基因的甘藍(lán)植株。又據(jù)悉上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院等單位正合作進(jìn)行水蛭素轉(zhuǎn)基因作物種植與相關(guān)深加工的研究。

  （二）重組水蛭素的藥理學(xué)研究 

  重組水蛭素與天然水蛭素在結(jié)構(gòu)上稍有不同，即位于63位酪氨酸處是非硫酸酯化的，這使得它與凝血酶的結(jié)合能力只有天然水蛭素的1/10 – 1/15。如果將重組水蛭素硫酸酯化，則與天然水蛭素的作用相差無幾。血管內(nèi)血栓的形成，雖然有多種原因，但最根本的過程還是凝血酶引起的凝血作用。許多血栓形成的動(dòng)物模型已用于重組水蛭素的抗栓作用研究，有的還和肝素作了比較?，F(xiàn)將有關(guān)重組水蛭素的藥理學(xué)研究現(xiàn)狀分述如下。

Nowak, G.等人(1988) 在Folia Haematol.（溶血）(Leipzig) 第115期上報(bào)道了重組水蛭素在狗體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究。雌性警犬的體重為17 –19.5公斤，在給藥前和給藥后的一定時(shí)間間隔內(nèi)，檢測(cè)血樣和尿樣，直至480分鐘為止。給藥的方法是靜脈注射，靜脈點(diǎn)滴，皮下注射。重組水蛭素與天然水蛭素在狗體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)行為很接近。不論是靜脈給藥還是皮下給藥，兩種水蛭素都能得到幾乎相同的血濃度。兩者的差別主要表現(xiàn)在重組水蛭素通過腎臟的排出率比天然水蛭素的排出率要高20% – 25%。重組水蛭素只通過腎臟排出，幾乎不經(jīng)過其它代謝的消除過程。Henschen, A. 等人(1988)在該刊同一期上將兩種水蛭素通過腎臟前后進(jìn)行了比較，通過反向HPLC分離，氨基酸組成和序列分析證明了水蛭素是經(jīng)過腎臟以不改變活性的形式從尿中排出的。

Doutremepnich, C.等人(1991)在止血雜志（Haemostasis）第21卷增刊1上報(bào)道了三種重組水蛭素的抗靜脈血栓作用，并與肝素作了比較。重組水蛭素I是由酵母菌制得的，重組水蛭素II和Ⅲ是由大腸桿菌制得的，肝素未經(jīng)分餾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肝素的高劑量組（400μg/kg）和重組水蛭素II的各個(gè)劑量組及重組水蛭素Ⅲ的高劑量組（50μg/kg）均有明顯的抗血栓作用，重組水蛭素I的各個(gè)劑量組雖然能使血栓重量有一定程度的減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。這表明三種重組水蛭素的活性也是不完全一樣的，這可能是由于合成方法的不同而得到不同結(jié)構(gòu)的重組水蛭素造成的。Talbot, M. D. 等人(1991)在該刊同一期上報(bào)道了重組脫硫水蛭素(desulphatohirudin)對(duì)大鼠動(dòng)脈血栓癥的作用。他們通過機(jī)械損傷（用夾子反復(fù)夾緊大鼠的動(dòng)脈血栓）形成模型。損傷部位血液成分標(biāo)記的放射性強(qiáng)弱（111I標(biāo)記血小板，53Cr標(biāo)記紅細(xì)胞，125I標(biāo)記纖維蛋白原和纖維蛋白）作為定量測(cè)定血栓形成程度的指標(biāo)。他們研究了重組水蛭素的抗動(dòng)脈血栓作用，并與未分餾肝素以及低分子肝素Fragmin作了比較。結(jié)果證明皮下注射重組水蛭素能夠抑制纖維蛋白和血小板在損傷血管上的積累，并且這種作用與皮下注射劑量有關(guān)。又據(jù)Nowak, G.等人(1991) 在該刊同一期上指出重組水蛭素還能夠抑制用各種方法在不同動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)散布的血管內(nèi)凝血（DIC）。包括凝血激酶在大鼠體內(nèi)誘發(fā)的DIC；內(nèi)毒素在兔和豬體內(nèi)誘發(fā)的DIC；同時(shí)靜脈滴注腎上腺素和凝血酶的狗體內(nèi)誘發(fā)的DIC。當(dāng)重組水蛭素的濃度達(dá)到20 – 30μg/ ml時(shí)，則能抑制各種DIC的形成。Basic–Micic, M. 等人（1991）在該刊同一期上報(bào)道了重組水蛭素對(duì)不同的血小板功能的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明在全血中用重組水蛭素，枸櫞酸鈉和未分餾的肝素抗凝，血小板的計(jì)數(shù)值相近。在富血小板的血漿中，重組水蛭素抗凝的血小板計(jì)數(shù)值比用枸櫞酸鈉抗凝的血小板的計(jì)數(shù)值稍高，而用未分餾的肝素抗凝的血小板的計(jì)數(shù)值比用枸櫞酸鈉抗凝的血小板的計(jì)數(shù)值還要低。在以重組水蛭素抗凝的富血小板的血漿中，血小板自發(fā)聚集受到抑制，肝素的抑制效果不如重組水蛭素。而在以枸櫞酸鈉抗凝的富血小板的血漿中，血小板自發(fā)地聚集。Narayanan, K. 等人 (1991) 在該刊同一期上報(bào)道了重組水蛭素在再造顯微外科中的作用觀察。他們用大鼠的股動(dòng)脈吻合模型做試驗(yàn)，分成為生理鹽水；1 mg/ml肝素生理鹽水溶液；1μg/ ml重組水蛭素生理鹽水溶液3組。在股動(dòng)脈處做一標(biāo)準(zhǔn)切口，在傷口吻合過程中分別用以上3種溶液清洗傷口，3秒鐘后觀察結(jié)果。在防止傷口血栓形成方面肝素優(yōu)于生理鹽水，重組水蛭素又優(yōu)于肝素。在再造顯微外科手術(shù)中，常常因?yàn)樵谖呛咸幯芩ㄈ鴮?dǎo)致失敗，肝素可以用來作為抗凝劑，但是容易引起出血，重組水蛭素則可以避免這些副作用。

我國(guó)核醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所萬衛(wèi)星、張榮軍等人（1999）在中華核醫(yī)學(xué)雜志第4期上報(bào)道了99Tcm –重組水蛭素的制備及血栓動(dòng)物模型顯像研究。他們采用亞氨基噻吩鹽酸鹽修飾法制備99Tcm –重組水蛭素（99Tcm –rH），并進(jìn)行小鼠體內(nèi)分布及兔股動(dòng)脈、靜脈血栓模型顯像分析。結(jié)果表明：99Tcm –rH的標(biāo)記率為90.8%，PD10過柱前后放化純度分別為88.8%和93.9%，比活度為3292GBq/g; 在小鼠心、腦、肝、脾、肺攝取低，腎濃聚高，15分鐘達(dá)到（64.72±5.04）% ID，血清除迅速；兔股動(dòng)脈、靜脈血栓1小時(shí)可清晰顯影，T/B分別為224和195。萬衛(wèi)星、張榮軍等人（1999）在該刊同一期上報(bào)道了血栓動(dòng)脈模型的99Tcm –重組水蛭素顯像研究。為了探討以凝血酶為靶，重組水蛭素（rH）為配基進(jìn)行血栓顯像的潛在價(jià)值。采用氯胺T法制備125 I–rH，以及體外放射配體結(jié)合法分析rH對(duì)凝血酶，纖維蛋白復(fù)合物的親和、定量關(guān)系和時(shí)間反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。采用亞氨基噻吩鹽酸鹽修飾法制備99Tcm –重組水蛭素（99Tcm –rH），進(jìn)行小鼠體內(nèi)分布測(cè)定及犬動(dòng)脈、靜脈血栓模型顯像。結(jié)果表明rH不能直接與纖維蛋白原結(jié)合，當(dāng)凝血酶與纖維蛋白形成復(fù)合物后才能與其形成三元復(fù)合物，且這種結(jié)合呈高親和，特異和可逆性。99Tcm –rH在小鼠心、腦、肝、脾、肺攝取低，腎濃聚高，15分鐘達(dá)到（64.72±5.04）% ID，血清除迅速；兔股動(dòng)脈、靜脈血栓1小時(shí)可清晰顯影，T/B分別為224和195。該室譚成、萬衛(wèi)星等人（2000）在核技術(shù)第5期上報(bào)道了重組水蛭素與血栓前體關(guān)系的研究。氯胺 – T法碘標(biāo)水蛭素，采用固相飽和法，固相競(jìng)爭(zhēng)法分析水蛭素與凝血酶 – 纖維蛋白原復(fù)合物的親和力及定量結(jié)合關(guān)系，并分析水蛭素 – 凝血酶 – 纖維蛋白原復(fù)合物形成三元復(fù)合物，它們的分子配比為14:14:1(水蛭素 : 凝血酶 : 纖翴蛋白原)。生理Ca∽(2+)濃度是它們的最佳結(jié)合環(huán)境，水蛭素與凝血酶 – 纖翴蛋白原復(fù)合物結(jié)合的親合常數(shù)K-a為9.72 x 10∽6L/mol;其結(jié)合反應(yīng)可在30 – 45分鐘達(dá)到平衡；提示重組水蛭素有作為新型血栓顯像劑的可能。張榮軍、萬衛(wèi)星等人（2000）在核技術(shù)第11期上報(bào)道了新型血栓顯像劑99Tcm –重組水蛭素的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明用間接法制備的99Tcm –重組水蛭素具有更高的放化純和穩(wěn)定性，更適合于血栓模型的顯像研究。兔血栓模型顯像結(jié)果表明99Tcm –重組水蛭素可在血栓部位濃聚；注入后1小時(shí)即可使血栓清晰顯像，因此，可望成為一種新型血栓顯像劑。

  第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科田建偉、趙連友等人（2001）在第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)第21期上報(bào)道了重組水蛭素局部治療兔髂總動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)后內(nèi)膜增殖和管腔狹窄。他們?yōu)榱颂接懼亟M水蛭素經(jīng)多孔球囊導(dǎo)管局部治療對(duì)兔髂總動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)后內(nèi)膜增殖和管腔狹窄的影響，用24只純種日本大耳白兔隨機(jī)分成對(duì)照組（n = 12）和重組水蛭素局部治療組（n = 12），采用兔髂總動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)后內(nèi)膜增殖和管腔狹窄模型，治療組經(jīng)多孔球囊導(dǎo)管于球囊擴(kuò)張局部在2個(gè)大氣壓下給于重組水蛭素（13.8ⅹ106抗凝血酶單位?g-1 ）1 mg?Kg-1，對(duì)照組給于生理鹽水，術(shù)后2WK和4 WK復(fù)查血管造影，術(shù)后4WK取髂總動(dòng)脈標(biāo)本行HE染色、Masson三色染色、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α- actin)免疫組織化學(xué)染色和增殖細(xì)胞核抗原免疫組織化學(xué)染色, 并進(jìn)行了計(jì)算機(jī)畫像分析。結(jié)果：治療組術(shù)后2 WK和4WK平均髂總動(dòng)脈直徑均較對(duì)照組顯著擴(kuò)大[2WK（86±5）% us(56±10)%, P<0.01; 4WK(77±13)% us(56±10)%, P<0.01], 術(shù)后2 WK和4WK平均髂總動(dòng)脈面積亦顯著增加，術(shù)后4WK治療組球囊擴(kuò)張血管管腔面積較對(duì)照組顯著增加[（37±5）% us（84±5）%，P<0.01]，其管壁面積顯著減少[（63±5）% us（38±10）%，P<0.01]，其中主要是內(nèi)臟面積減少[（7±1）% us（38±10）%，P<0.01]，術(shù)后4WK治療組球囊擴(kuò)張血管管壁α–actin和 PCNA免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞均較對(duì)照組明顯減少。結(jié)論：重組水蛭素經(jīng)多孔球囊導(dǎo)管局部治療可顯著減輕兔髂總動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)后新生內(nèi)膜增殖和管腔狹窄。

中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥教研室劉煜、譚樹華等人（2002）在中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)第3期上報(bào)道了重組水蛭素Ⅲ的抗凝與抗血栓作用研究，為了研究自行研制的重組水蛭素Ⅲ在大腸桿菌中的分泌表達(dá)產(chǎn)物的抗凝與抗血栓作用。他們采用大鼠下腔靜脈血栓模型和大鼠體外AV循環(huán)模型進(jìn)行水蛭素Ⅲ（HV3）的抗凝與抗血栓作用研究。結(jié)果給予重組水蛭素25，50μg/kg 兩個(gè)劑量的大鼠下腔靜脈血栓重量分別為21.30±7.35 mg和10.40±16.20 mg，生理鹽水對(duì)照組為59.50±4.95 mg；重組水蛭素50，25μg/kg的血栓濕重為15.3±3.6 mg和21.5±5.3 mg，生理鹽水對(duì)照組為48.6±4.9 mg。結(jié)論：重組水蛭素Ⅲ可顯著地減少靜脈血栓重量，也能顯著地降低體外AV循環(huán)的血栓濕重。

第四軍醫(yī)大學(xué)呂莉和大連醫(yī)科大學(xué)李欣燕等（2002）在中草藥第6期上報(bào)道了重組水蛭素抗凝活性的實(shí)驗(yàn)研究。研究重組水蛭素的抗凝活性，以便為水蛭素新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采用家兔靜脈注射重組水蛭素前及后心臟采血，應(yīng)用血凝儀測(cè)定凝血酶時(shí)間（TT）、凝血酶原時(shí)間（PT）和活化的部分凝血活酶時(shí)間（APTT），并考察其抗凝活性的量效和時(shí)效關(guān)系。結(jié)果重組水蛭素能明顯延長(zhǎng)TT和APTT，且呈劑量依賴性，但在所試劑量范圍內(nèi)對(duì)PT無明顯影響；其延長(zhǎng)TT和APTT的作用隨時(shí)間而下降，作用持續(xù)時(shí)間60分鐘。結(jié)論：重組水蛭素具有明顯的抗凝作用，明顯強(qiáng)于現(xiàn)有抗凝藥肝素，且其作用強(qiáng)度與同劑量的德國(guó)產(chǎn)重組轉(zhuǎn)基因水蛭素相同。第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院呂莉、王艷春、韓國(guó)柱等（2002）在中國(guó)藥學(xué)雜志第9期上報(bào)道了重組水蛭素抗栓及抗彌散性血管內(nèi)凝血作用的實(shí)驗(yàn)研究。重組水蛭素產(chǎn)品中僅變異體I、Ⅱ、Ⅲ具有抗凝活性，簡(jiǎn)稱rHV1、 rHV2、 rHV3，，國(guó)內(nèi)有關(guān)單位采用甲基營(yíng)養(yǎng)型漢遜酵母真核表達(dá)系統(tǒng)研究出的重組水蛭素（rH）與天然水蛭素HV1不同之處，除rH-63位酪氨酸脫硫基外，還有N末端為N-Ile-Thr2型，這為國(guó)內(nèi)外首創(chuàng)，此文研究了此種rH的抗動(dòng)、靜脈血栓及家兔急性彌散性血管內(nèi)凝血作用，旨在為重組水蛭素新藥開發(fā)提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究資料。結(jié)果表明rH具有強(qiáng)大的動(dòng)脈、靜脈和抗DIC作用，并呈明顯的劑量依賴性關(guān)系，其抗靜脈血栓有效劑量為12.5 – 100 μg-kgˉ1,遠(yuǎn)低于抗動(dòng)脈血栓的有效劑量（0.25–2.0 μg-kgˉ1）,于與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道相似，rH抗DIC的有效劑量很低（15.625 - 125μg-kgˉ1）, 當(dāng)劑量?jī)H為125μg-kgˉ1時(shí)，試驗(yàn)過程中各項(xiàng)觀察指標(biāo)均與NS組相同，即完全對(duì)抗DIC，rH 抗靜脈血栓作用強(qiáng)度約為肝素的4倍，其抗動(dòng)脈血栓作用強(qiáng)度約為賴氨匹林的50倍，其抗DIC作用強(qiáng)度約為肝素的2倍以上，國(guó)產(chǎn)rH的抗動(dòng)、靜脈血栓及抗DIC作用強(qiáng)度與德國(guó)同類權(quán)威產(chǎn)品Refludan一致。發(fā)現(xiàn)靜脈注射rH后效應(yīng)，出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，峰值時(shí)分別為15分鐘和2小時(shí)。未出現(xiàn)血藥濃度的雙峰現(xiàn)象，提示效應(yīng)的雙峰現(xiàn)象與藥動(dòng)學(xué)過程無關(guān)，很可能是特殊的藥效動(dòng)力學(xué)因素所致。本品抗動(dòng)脈血栓效應(yīng)時(shí)程為單峰，似可用血管外給藥需要經(jīng)受吸收過程予以解釋。此文描述的方法能夠成功地誘發(fā)家兔急性DIC，此法簡(jiǎn)便，造模成功率高。

（三）　 重組水蛭素的臨床試驗(yàn)

  Bichler, J. 等人 (1988) 在Arzneim – Forsch 第38卷第5期上報(bào)道了在16名健康志愿者身上做的重組水蛭素臨床研究。他們用0.1 – 0.4mg/Kg皮下注射一次或用0.3 –0.5 mg/Kg皮下注射多次后，采用生色底物或ELISA方法測(cè)定血漿或尿中重組水蛭素的濃度，其血漿濃度可用開放的一房室模型來表示。藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的平均值為：消除半衰期為127分鐘，總消除為206 ml/分鐘，吸收速度常數(shù)為0.86/小時(shí)，腎臟消除為66 ml/分鐘，這些參數(shù)隨著劑量的變化而稍有改變。在24小時(shí)內(nèi)，進(jìn)入人體的重組水蛭素有32%自尿中回收，血液凝固時(shí)間與重組水蛭素的血漿濃度有關(guān)。凝血激酶時(shí)間(APTT)是最適宜的檢驗(yàn)指標(biāo)。每8小時(shí)注射一次，共注射八次，結(jié)果在3秒鐘時(shí)間內(nèi)有效地延長(zhǎng)了APTT。重復(fù)注射，在前一次注射的重組水蛭素未完全排泄前又注射一次，但在血漿內(nèi)未見重組水蛭素積累。人體對(duì)注射的劑量是可以耐受的，血相、出血時(shí)間和血液化學(xué)成分均不受影響。一般無特異抗體發(fā)現(xiàn)，只有一名受試者在6周后皮試有陽性反應(yīng)。

Klocking，H. B. 等人 (1988) 在Folia Haematol.（溶血）(Leipzig) 第115期上報(bào)道了對(duì)重組水蛭素做的全面毒性研究。無論是急性、亞急性毒性實(shí)驗(yàn)，都沒有異常反應(yīng)，對(duì)體重、血相、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)都沒有影響，尿樣分析、免疫學(xué)檢查也都正常，半致死劑量為L(zhǎng)D50 > 250mg/Kg。

Markwardt, F. 等人（1991）在止血雜志（Haemostasis）第21卷第21期上報(bào)道了用重組水蛭素做的臨床藥理研究，他們給健康的志愿者進(jìn)行單次靜脈注射，單次皮下注射或重復(fù)皮下注射。結(jié)果表明凝血酶時(shí)間和部分凝血酶原時(shí)間取決于血漿中重組水蛭素的濃度，血小板計(jì)數(shù)、纖維蛋白原水平和纖維蛋白分解系統(tǒng)保持不變，出血時(shí)間未延長(zhǎng)。靜脈注射時(shí)，重組水蛭素迅速分布到細(xì)胞外部空間并排出，半衰期為1 – 2小時(shí)，與靜脈注射劑量有關(guān)。皮下給藥時(shí)，重組水蛭素在血中的濃度在60 – 120分鐘內(nèi)達(dá)到最高值。大部分活性重組水蛭素以未改變的形式自尿中排出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與天然水蛭素的結(jié)果相近。

在我國(guó)國(guó)外醫(yī)藥雜志1994年第3期上報(bào)道了新型凝血酶抑制劑水蛭肽（Hirulog）對(duì)冠脈疾病的抗凝效果。這是一種選擇性凝血酶抑制劑，取名水蛭肽（Hirulog）它是不同于肝素的新型抗凝藥物，是仿照水蛭素（Hirudin）結(jié)構(gòu)合成的含氨基酸的多肽，能有效地選擇性地抑制那些結(jié)合于血塊的凝血酶，而不因?yàn)檠“灞患せ疃А?5例作心導(dǎo)管檢查的冠脈疾病患者，在心導(dǎo)管術(shù)中隨機(jī)給予小劑量的水蛭肽（靜脈注射0.05 mg/Kg，繼續(xù)以滴注每小時(shí)0.2 mg/Kg）、大劑量（靜脈注射0.15 mg/Kg，繼續(xù)以滴注每小時(shí)0.6mg/Kg）或肝素（靜脈注射500U）。給藥期間定時(shí)連續(xù)測(cè)定活化部分凝血激酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、激活凝血時(shí)間（ACT）和纖維蛋白肽A(FPA)。該刊1995年第1期上報(bào)道了水蛭肽（Hirulog）對(duì)不穩(wěn)定性型心絞痛的治療價(jià)值。文中指出人工合成的水蛭肽是一種直接的凝血酶抑制劑。20例男性不穩(wěn)定性型心絞痛患者經(jīng)靜脈滴注水蛭肽（每小時(shí)0.2mg/Kg），連續(xù)5日；在治療中保持活化的部分凝血激酶時(shí)間（APTT）大約延長(zhǎng)200%。在連續(xù)靜脈滴注水蛭肽5日期間，APTT由治療前的26、84、0秒延長(zhǎng)至61、610、2秒；凝血酶原時(shí)間（PT）由治療前的12.1±1.3秒延長(zhǎng)至16.1±2.0秒；纖維蛋白肽A(FPA)水平由治療前的48±15.1 μg/ml降至27.4±9.5μg/ml。該刊1996年第3期上報(bào)道了水蛭肽（Hirulog）治療不穩(wěn)定型心絞痛。文中指出粥樣硬化斑塊破裂，血小板激活和冠脈血栓形成在不穩(wěn)定型心絞痛發(fā)病原理中有重要作用?？寡“逅幇⑺酒チ帧⒖鼓幐嗡匾驯涣腥氩环€(wěn)定型心絞痛的常規(guī)治療藥。但是肝素不能抑制結(jié)合于血塊的凝血酶，使用時(shí)必須反復(fù)調(diào)整劑量，監(jiān)測(cè)抗凝效果，可能引起大出血。水蛭肽則是一種高度特異性的游離和結(jié)合于血塊的凝血酶抑制劑的直接抑制劑。410例不穩(wěn)定型心絞痛患者，每日口服阿司匹林325 mg，隨機(jī)恒速靜脈滴注水蛭肽，劑量分別為每小時(shí)0.02 mg（160例）、0.95 mg（81例）、0.50 mg（88例）和1.0 mg（181例），共計(jì)72小時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)72小時(shí)和出院時(shí)水蛭肽劑量組明顯好于阿司匹林劑量組。該刊1996年同一期上還報(bào)道了水蛭肽和肝素對(duì)冠脈成形術(shù)患者安全性的比較。文中指出冠脈成形術(shù)中應(yīng)用的新抗凝藥和抗血小板藥幾乎都使出血并發(fā)癥增加。水蛭肽是凝血酶的直接抑制劑，在理論上同肝素相比有許多優(yōu)點(diǎn)。4312例不穩(wěn)定型心絞痛或梗塞后心絞痛作經(jīng)皮穿刺冠脈內(nèi)成形術(shù)（PTCA）, 隨機(jī)給予水蛭肽或肝素，以比較兩者安全性。水蛭肽劑量是靜脈注射1.0 mg/Kg，繼續(xù)以滴注每小時(shí)2.5 mg/Kg，共4小時(shí)，再以每小時(shí)0.2 mg/Kg滴注14 –20小時(shí)。肝素劑量是靜脈注射175 U /Kg，繼續(xù)以每小時(shí)15 U /Kg滴注，共計(jì)18 – 24小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水蛭肽組出血和其它副作用發(fā)生率低于肝素組；嘔血人數(shù)分別為0.8%和1.9%（危險(xiǎn)比0.41，90%）。該刊1996年第6期上報(bào)道了凝血酶抑制劑重組水蛭素CGP39393用于髖部置換術(shù)后深部靜脈血栓的預(yù)防。文中指出深部靜脈血栓（DVT）是較大矯形手術(shù)后嚴(yán)重而常見的并發(fā)癥。近期的資料顯示盡管用肝素預(yù)防，全俄的膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的DVT發(fā)生率為20 – 45%。水蛭素是一種天然的，特異性的幾乎不可逆的人凝血酶抑制劑。本試驗(yàn)采用的CGP39393是一種通過DNA重組技術(shù)在酵母菌上表達(dá)的重組水蛭素。837例隨機(jī)分成為4組：即CGP39393 10、15、20 mg以及混合肝素500 U共4組。CGP39393各組均為每日2次皮下注射，肝素組為每日3次皮下注射；前者首次給藥是在麻醉手術(shù)前進(jìn)行的，后者則在手術(shù)開始前2小時(shí)給藥，治療期間均為8 – 11天。結(jié)果顯示手術(shù)后預(yù)防期內(nèi)CGP39393 10、15、20 mg劑量各組靜脈血栓的發(fā)生明顯低于混合肝素組。該刊1998年第5期上鐘倩報(bào)道了地西盧定預(yù)防髖部置換術(shù)后深部靜脈血栓形成。文中指出據(jù)歐洲研究者報(bào)道Novartis公司的凝血酶抑制劑地西盧定（Dsirudin, 商品名Revasc）對(duì)進(jìn)行髖部置換手術(shù)病人的深部靜脈血栓(DVT)預(yù)防作用優(yōu)于依諾肝素鈉。在這一研究中，2051例來自10個(gè)歐洲國(guó)家進(jìn)行全髖部置換手術(shù)的可評(píng)估病人隨機(jī)接受本品皮下注射15 mg，一日兩次（1028例）或依諾肝素鈉皮下注射40mg，一日一次（1023例），共治療8 – 12天。病人在手術(shù)前30分鐘接受首劑本品，而首劑依諾肝素鈉在手術(shù)前夜給藥。治療過程中785例依諾肝素鈉接受者和802例本品接受者可進(jìn)行首次治療分析評(píng)估。分析結(jié)果：依諾肝素鈉組較本品發(fā)生大的血栓栓塞。該刊1998年同一期上鐘倩還報(bào)道了重組人抗凝血酶Ⅲ影響肝素的抗凝血作用。文中指出Genzmpe Transgenics公司和Genzpoe General 公司的重組人抗凝血酶Ⅲ可影響用于進(jìn)行冠脈旁路移植術(shù)(CABG)病人的肝素抗凝血作用。在美國(guó)圣地亞哥召開的美國(guó)血液學(xué)協(xié)會(huì)年度會(huì)議上，這兩家公司的研究者陳述了一項(xiàng)D期臨床研究結(jié)果。他們認(rèn)為這是已成功完成的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的重組人治療蛋白的第一個(gè)研究。此研究中的30例病人在首次進(jìn)行冠脈旁路移植手術(shù)前接受了肝素和單次劑量的本品10 – 200 U /Kg。本品能增進(jìn)病人對(duì)肝素的敏感性，并增強(qiáng)其抗凝血作用，這在CABG過程中可以保護(hù)關(guān)鍵的血液組分，從而減少微血管出血。本品的安全性在此研究中得到了證實(shí)。該刊1999年第4期上劉萍報(bào)道了抗凝藥Lepirudin。文中指出此藥的藥效分類為纖維蛋白酶抑制劑，其作用不依賴于抗凝血酶Ⅲ，主要通過抑制凝血酶觸發(fā)的凝血因子V. m常見的活化以及凝血酶引起的血小板的活化而發(fā)揮作用。本品還能使血纖維蛋白酶失活，靜脈注射給藥預(yù)防血栓形成的藥效可持續(xù)60分鐘，用藥后作用的持續(xù)時(shí)間與劑量有關(guān)。此藥商品名Refludan ；化學(xué)名 1—F 蘇氨酸—63—脫硫水蛭素；上市開發(fā)商：德國(guó)Hechst-Marion Roussel 公司, 1997年在德國(guó)上市，1998年在英國(guó)和美國(guó)上市。此外，中國(guó)藥學(xué)雜志2002年第10期上羅鵑報(bào)道了美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）于2000年12月批準(zhǔn)了Medicines 公司的抗凝新藥比伐盧定（Bivalirudin, Angjomax x TM）NDAN  在美國(guó)上市，該藥系注射用的20肽水蛭素衍生物（片段），相對(duì)分子量2180。是直接的，特異的，可逆性的凝血酶抑制劑。

從以上研究的結(jié)果可以看出，重組水蛭素是頗有應(yīng)用前景的活血化瘀藥物，其適應(yīng)癥至少包括以下幾個(gè)方面：1. 治療外科手術(shù)后的靜脈血栓，促進(jìn)顯微外科手術(shù)傷口的瘀合；2.治療DI; 3.預(yù)防動(dòng)脈血栓，尤其是在心臟手術(shù)后防止冠脈旁路的血栓形成；4. 預(yù)防動(dòng)、靜脈血管內(nèi)溶解血栓后或者血管再造后形成血栓；5.改善體外血液循環(huán)，尤其是在血液透析操作中。