論文：青魚鰭條組織細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性

青魚鰭條組織細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性

張雪萍1,2，曾令兵2，陳倩1，周勇2,3，張琳琳1

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070；

2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223；

3.湖州師范學(xué)院浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室，浙江湖州313000)

摘要：采用組織塊移植培養(yǎng)技術(shù)，對來源于青魚(Mylopharyngodon piceus)的鰭條組織細(xì)胞進行原代培養(yǎng)，建立了青魚鰭條組織細(xì)胞系，定名為BC-Fin。青魚鰭條組織細(xì)胞為成纖維樣細(xì)胞，已穩(wěn)定傳代培養(yǎng)50多代，其最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，最佳培養(yǎng)基為L-15，最適血清濃度為15%，在最適培養(yǎng)條件下，青魚鰭條組織細(xì)胞的群體倍增時間為60.6 h。青魚鰭條組織細(xì)胞液氮冷凍保藏6個月后，經(jīng)臺盼藍染色，約(90.09±4.65)%的細(xì)胞具有細(xì)胞活性，復(fù)蘇后的細(xì)胞生長旺盛。細(xì)胞染色體分析顯示，第16代青魚鰭條組織細(xì)胞的染色體數(shù)目為正常二倍體(2n=48)，第41代細(xì)胞染色體眾數(shù)為46。通過對離體培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中的16S rRNA基因進行特異性擴增，獲得長度為320 bp的核酸片段，核酸序列比對分析結(jié)果表明，其與青魚16S rRNA基因序列的一致性達98%，表明該細(xì)胞來源于青魚。病毒敏感性試驗結(jié)果顯示，在感染草魚呼腸孤病毒(GCRV)后BC-Fin細(xì)胞系可產(chǎn)生典型細(xì)胞病變效應(yīng)，病毒滴度為10(5.33±0.21) TCID(50)/mL，且PCR檢測可檢測出細(xì)胞培養(yǎng)的草魚呼腸孤病毒，表明BC-Fin細(xì)胞系對草魚呼腸孤病毒較敏感。

關(guān)鍵詞：青魚(Mylopharyngodon piceus)；鰭條組織；細(xì)胞系；生物學(xué)特性；病毒敏感性

青魚(Mylopharyngodonpiceus)，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)青魚屬(Mylopharyngodon)。由于味道鮮美，營養(yǎng)價值高，備受養(yǎng)殖者和消費者青睞。隨著青魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害問題日趨嚴(yán)重，其中，青魚出血病在湖北、江蘇、浙江及上海等地危害嚴(yán)重[1]。翟子玉[2]等對青魚出血病作了較為系統(tǒng)的研究，并且分離出導(dǎo)致出血病的病毒，制備了組織滅活疫苗，開展了青魚出血病免疫預(yù)防試驗。但是，長期以來，來源于青魚的細(xì)胞資源缺乏，制約了青魚出血病等病毒性疾病診斷與防治技術(shù)研究的開展。本研究建立了青魚鰭條的細(xì)胞系，對其生物學(xué)特性與病毒敏感性進行了較為系統(tǒng)的研究，不僅豐富了魚類細(xì)胞資源，而且為今后開展病毒病流行病學(xué)特征、致病機理、診斷技術(shù)以及防控技術(shù)研究提供了重要的實驗材料。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試驗魚與病毒株

健康青魚，體重約50 g，來自于長江水產(chǎn)研究所窯灣基地。實驗前在實驗室暫養(yǎng)2周。草魚呼腸孤病毒JX-0901株由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所吳淑勤研究員惠贈。

1.1.2試劑與耗材

L-15、R-1640、MEM、M199 培養(yǎng)液、兩性霉素B、青霉素/鏈霉素、磷酸緩沖液(DPBS)、胰蛋白酶-EDTA (Typsin- EDTA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、二甲基亞砜(DMSO)、秋水仙素， 以上均購自sigma公司；胎牛血清(FBS)為杭州四季青生物工程材料公司產(chǎn)品；生長因子bFGF和EGF購自普飛生物；相關(guān)分子試劑均購自TaKaRa。 25 cm2和75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，15 mL和 50 mL離心管，規(guī)格為1、2、5 和10 mL的移液管，1.8 mL的凍存管均為自Corning公司產(chǎn)品；程序降溫盒購自Nalgene公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備

Ⅱ級生物安全柜(ESCO)；倒置顯微鏡(Nikon)；正置顯微鏡(OLYMPUS)，照相 CCD(OLYMPUS)；低速冷凍離心機(Sigma)；恒溫培養(yǎng)箱 (Sanyo)；制冰機(Gelin)；液氮罐(MVE)。

1.2方法

1.2.1原代培養(yǎng)

將健康青魚浸于20 mg/L的高錳酸鉀溶液中消毒30 min，再用70%酒精擦拭魚體體表，置魚體于II級生物安全柜內(nèi)，取其鰭條組織。參照薛慶善[3]和Freshney[4]的原代培養(yǎng)法，采用組織塊移植法進行原代細(xì)胞培養(yǎng)。將鰭條剪成約1 cm3的組織塊，先用含高濃度雙抗的DPBS 緩沖液(500 U/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B)清洗3次，再用含高濃度雙抗的培養(yǎng)液L-15(500 U/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B)清洗1次，然后將組織塊移植到規(guī)格為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(Corning,USA)，均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底面，倒置平放，貼壁2 h 后加1.5 mL含30%胎牛血清的L-15 培養(yǎng)液(含200 U/mL青霉素、200 μg/mL鏈霉素、5.0 μg/mL兩性霉素B，25 ng/mL EGF 和25 ng/mL bFGF)，置于25 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日加同樣的培養(yǎng)液至3 mL。隨后逐日觀察生長狀況，每3日更換一半培養(yǎng)液。倒置生物顯微鏡記錄細(xì)胞生長情況。

1.2.2傳代培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞從組織塊中遷出單層達培養(yǎng)瓶底面積70%時，參照肖藝等[5]的方法進行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。用PBS 清洗細(xì)胞，用胰蛋白酶(1×)消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時，用含10%FBS的L-15中和胰蛋白酶，終止消化并吹打分散細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min(Sigma,3K15)，細(xì)胞沉淀用含有20%的DFBS新鮮培養(yǎng)液5 mL懸浮，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中25 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)。待傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長成單層，再采用上述相同方法進行分瓶擴大培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

青魚鰭條細(xì)胞的凍存：細(xì)胞冷凍保存液由終濃度分別為10%二甲基亞砜(DMSO)、20%血清(FBS)、70% L-15 培養(yǎng)液組成[6]。操作前，預(yù)先制備含20%二甲基亞砜(DMSO)、40%胎牛血清、40% L-15培養(yǎng)液的冷凍保存液，置于冰上預(yù)冷待用；將用于細(xì)胞冷凍保存的程序降溫盒(盛有異丙醇)于4 ℃冰箱過夜預(yù)冷備用；細(xì)胞凍存管置冰上預(yù)冷。用胰酶(1×)消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時，迅速用含 10% 血清的培養(yǎng)液終止消化，離心收集細(xì)胞(1 000 r/min，5 min)，棄上清液，用不含血清的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞(與預(yù)先配制的細(xì)胞冷凍保存液等體積混合)，緩慢加入冰上預(yù)冷的冷凍保存液中，用移液管緩慢混勻，再分裝于冰上預(yù)冷的細(xì)胞凍存管中，每凍存管1.0～1.5 mL，最佳密度為1×106/mL，將細(xì)胞凍存管置于預(yù)冷的程序降溫盒中，置-80 ℃冰箱過夜后再移入液氮灌中長期凍存。

青魚鰭條細(xì)胞的復(fù)蘇：液氮保存180 d后取出冷凍保存的BC-Fin細(xì)胞，37 ℃水浴迅速融化，將細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶，添加 4～5 mL 含10%FBS的L-15培養(yǎng)液，于 25 ℃培養(yǎng)過夜，次日吸出所有培養(yǎng)液以除去DMSO，再添加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。從液氮中取出的細(xì)胞在37 ℃水浴融化后，取少許細(xì)胞用臺盼藍染色，顯微鏡下觀測細(xì)胞活性。

1.2.4最佳培養(yǎng)基

選擇4種培養(yǎng)液L-15、MEM、M199、R-1640，每種培養(yǎng)液配制成終濃度含15% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液。調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL接種到12孔板，每孔1 mL，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔2 d取2孔平行樣，用胰酶(1×)消化后計數(shù)，連續(xù)取樣6次，共計12 d，繪制其在不同培養(yǎng)液下的生長曲線。

1.2.5最適血清濃度

選擇L-15培養(yǎng)液，分別配制終濃度為5%、10%、15%、20%FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)液。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種到12孔板，每孔1 mL，正常培養(yǎng)。每隔2 d取2孔平行樣，用胰酶(1×)消化后計數(shù)，連續(xù)取樣6次并計數(shù)，共計12 d，繪制其在不同血清濃度下的生長曲線。

1.2.6最適培養(yǎng)溫度

配制終濃度含15% FBS的L-15細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)置15、20、25、30 ℃四個溫度梯度，調(diào)整細(xì)胞密度依舊為5×104/mL，接種于12孔板，每孔1 mL，每個溫度下培養(yǎng)一個12孔板的細(xì)胞，每2 d取2孔平行樣，用胰酶(1×)消化后計數(shù)，連續(xù)取樣6次，共計12 d，繪制其在不同溫度下的生長曲線。

1.2.7 細(xì)胞群體倍增時間

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，進行傳代，所用的培養(yǎng)液是終濃度含15% FBS的L-15，以1×105/孔 的細(xì)胞濃度接種于6孔板，置于25 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔12 h取3孔平行樣，用胰酶(1×)消化后計數(shù)，連續(xù)取12次，共計6 d。根據(jù)公式T=t×lg2/lg(Nt/N0)計算青魚鰭條細(xì)胞的群體倍增時間；以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞濃度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.8細(xì)胞染色體分析

取16代、41代的青魚鰭條細(xì)胞，傳代24 h后，棄原有培養(yǎng)液，接質(zhì)量終濃度為1.0 μg/mL的秋水仙素，繼續(xù)在原培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)13～15 h，用胰酶(1×)消化細(xì)胞、收集并離心，用DPBS清洗細(xì)胞，用冰醋酸和甲醇的混合液(體積比3∶1)預(yù)處理細(xì)胞，參照Wang等[6]的方法經(jīng)過低滲、固定、制片、晾干、吉姆薩染色，制備染色體薄片，隨機抽取100個樣品，100倍油鏡下觀察染色體，統(tǒng)計其數(shù)目。

1.2.916S rRNA 分析

參照Wang等[6]的方法，從培養(yǎng)的青魚鰭條細(xì)胞中提取總DNA。設(shè)計青魚線粒體中16S rRNA 基因的特異性引物，其序列為： 16S-F (5′-ACCGAACCTGGTGATAGC-3′) 和 16S-R (5′-TTTC-TTCCATGTGGGCAT-3′)。 PCR擴增反應(yīng)總體系25 μL，2.5 μL PCR 緩沖液(10×)，2.0 μL dNTPs，2.0 μL MaCl2，2條引物各0.4 μL，0.2 μL Taq-DNA酶，1.0 μL DNA 模板，16.5 μL 水，混合后進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)條件為： 首先94 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，30次循環(huán)；再72 ℃保溫10 min；最后 4 ℃保溫。將PCR擴增產(chǎn)物克隆到pMD-19T載體轉(zhuǎn)化到DH5α中，檢測到的陽性克隆進行擴增產(chǎn)物測序與比對分析。

1.2.10病毒敏感性

傳代培養(yǎng)的青魚鰭條細(xì)胞形成匯合單層后，棄培養(yǎng)液，加入1.0 mL GCRV細(xì)胞毒，病毒的感染復(fù)數(shù)MOI(multiplicity of infection)為1，加入終濃度為10 μg/mL polybrene，25 ℃吸附1.5 h，期間每間隔15-20 min輕微晃動培養(yǎng)瓶1次以便均勻吸附。吸附結(jié)束后，棄多余病毒液，添加5 mL含2%FBS 的L-15培養(yǎng)液，25 ℃培養(yǎng)，同時設(shè)置陰性空白對照。光學(xué)顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。采用微量培養(yǎng)板(Corning)培養(yǎng)法測定病毒滴度，按照Reed-Muench法計算病毒滴度。待病毒感染的青魚鰭條組織細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE) 達70%時，進行PCR檢測。棄掉原有細(xì)胞培養(yǎng)液，用DPBS清洗3次，-80 ℃與室溫反復(fù)凍融三次后，3 000 r/min，4 ℃離心30 min，收集沉淀，RNAzol 法提取病毒基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計與合成草魚呼腸孤病毒JX-0901株特異性引物P1:5′-TCTCTACCATCCGTTGGTTGTCC-3′和P2:5′-ATCGTTGTTGAGCTGAGCCTCTT-3′，進行PCR擴增，預(yù)期擴增產(chǎn)物大小為461 bp。

2結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)

青魚鰭條組織塊接種到25 cm2細(xì)胞瓶后1～2 d可良好貼壁，3-4 d有些許細(xì)胞從組織塊周圍遷出，6 d左右可形成生長暈(圖1)， 9 d時遷出的細(xì)胞已形成單層(圖2)，15 d后單層細(xì)胞約占瓶底面積70%。

圖1　原代培養(yǎng)第6天的BC-Fin細(xì)胞

圖2　原代培養(yǎng)第9天的BC-Fin細(xì)胞

2.2傳代培養(yǎng)

細(xì)胞首次傳代，約8～12 h可貼壁生長，但較多細(xì)胞無法貼壁，形成單層細(xì)胞需要5 d左右。連續(xù)傳代8次后，傳代細(xì)胞12 h后90%可貼壁生長，貼壁數(shù)目明顯增加，且3 d可形成單層細(xì)胞。目前青魚鰭條細(xì)胞已傳代50多次，細(xì)胞形態(tài)和生長穩(wěn)定(圖3)。

圖3　傳代培養(yǎng)的第40代BC-Fin細(xì)胞

2.3細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

青魚鰭條細(xì)胞在液氮中凍存6個月后復(fù)蘇，用臺盼藍染色計數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計細(xì)胞成活率高達(90.09±4.65)%。復(fù)蘇后的細(xì)胞經(jīng)觀察，形態(tài)上無明顯差別，貼壁較快，生長狀態(tài)良好，因此青魚鰭條細(xì)胞可長期保存。

2.4最佳培養(yǎng)基

青魚鰭條細(xì)胞在MEM、M199、R-1640、L-15四種培養(yǎng)液中均有生長，L-15更適合BC-Fin細(xì)胞生長。如圖4所示，R-1640 在培養(yǎng)早期細(xì)胞生長較為迅速，但從4 d開始生長緩慢，6 d后細(xì)胞量開始下降；MEM和M199培養(yǎng)基中細(xì)胞生長較為緩慢，細(xì)胞數(shù)峰值僅為1.5×105/mL左右，且8 d后細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)下降；L-15 培養(yǎng)液有著明顯的優(yōu)勢，細(xì)胞增殖迅速，生長趨勢明顯，細(xì)胞量可達到2.4×105/mL，是四種培養(yǎng)液里面峰值最高的一組，8-12 d細(xì)胞數(shù)量雖未再增加，但無明顯下降。

2.5最適血清濃度

15%的血清濃度最適于BC-Fin生長。分別添加5%、10%、15%、20%FBS于L-15培養(yǎng)液，置于25 ℃培養(yǎng)箱下，細(xì)胞生長有明顯不同(圖5)，經(jīng)統(tǒng)計分析得出血清濃度為5%和10%下的細(xì)胞生長較慢，且血清濃度為5%培養(yǎng)下細(xì)胞數(shù)在12 d時已少于接種數(shù)目，10%FBS的細(xì)胞數(shù)量在12 d時數(shù)量增加較少；在含15% 和20% FBS的L-15培養(yǎng)液中，細(xì)胞數(shù)量增長較快，在第8 d時達到峰值約為2.7×105/mL；但考慮到細(xì)胞單層及在保持細(xì)胞形態(tài)方面，15%的血清濃度優(yōu)越于20%。

圖4　BC-Fin 細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中的生長比較

圖5　BC-Fin 細(xì)胞在不同血清濃度中的生長比較

2.6最適培養(yǎng)溫度

使用含15% FBS的L-15培養(yǎng)液，如圖6所示，25 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。 分別在15、20、25、30 ℃四個溫度梯度下培養(yǎng)，細(xì)胞計數(shù)顯示15 ℃ 和20 ℃不利于細(xì)胞的生長，在此溫度下，細(xì)胞的數(shù)目沒有明顯變化，在12 d時細(xì)胞數(shù)量已出現(xiàn)下降；在25 ℃ ，細(xì)胞貼壁較快，生長迅速，對數(shù)生長期較長，在第8 d時達到峰值4.5×105/mL，是四個溫度下細(xì)胞數(shù)量的最高值；在30 ℃，細(xì)胞迅速生長，且最早達到峰值，但是峰值較小，達到峰值后細(xì)胞出現(xiàn)老化，細(xì)胞數(shù)量有所下降，細(xì)胞不能穩(wěn)定生長。

圖6　BC-Fin 細(xì)胞在不同溫度中的生長比較

2.7細(xì)胞群體倍增

第16代青魚鰭條細(xì)胞的生長曲線如圖7所示。細(xì)胞培養(yǎng)的1-5 d為青魚鰭條細(xì)胞的對數(shù)生長期，5-7 d細(xì)胞單層穩(wěn)定，細(xì)胞增殖速度明顯緩慢。根據(jù)公式T=t×lg2/lg(Nt/N0)計算細(xì)胞的群體倍增時間，其中Nt為t時間的細(xì)胞數(shù)， N0為接種細(xì)胞數(shù)。計算結(jié)果顯示，第16代鰭條細(xì)胞的群體倍增時間為60.6 h。

圖7　第16代BC-Fin細(xì)胞的生長曲線

2.8細(xì)胞染色體分析

BC-Fin細(xì)胞染色體統(tǒng)計結(jié)果顯示，第16代青魚鰭條細(xì)胞的染色體數(shù)目為2n=48(圖8)，與已經(jīng)報道的青魚染色體數(shù)目2n=48相符[7]。第41代青魚鰭條細(xì)胞染色體數(shù)目分布在32～56之間，染色體眾數(shù)為46 (圖9)，表明第41代的BC-Fin 細(xì)胞染色體數(shù)目已發(fā)生變化。

2.916S rRNA 分析

采用青魚16S rRNA基因特異性引物進行PCR擴增，獲得了一段長度為320 bp擴增產(chǎn)物(圖10)，與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)對該片段測序與序列比對分析，結(jié)果顯示其序列與來自青魚的16S rRNA 基因(GQ406278.1)序列同源性為98%，證明此細(xì)胞來源于青魚。

圖8　第16代BC-Fin 細(xì)胞染色體

圖9　第41代BC-Fin 細(xì)胞染色體數(shù)目分布

圖10　BC-Fin細(xì)胞16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物

2.10病毒敏感性

用GCRV-JX0901感染青魚鰭條細(xì)胞，感染后第3天，細(xì)胞開始收縮變圓、折光度增加，細(xì)胞單層收縮。感染后第6天，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞脫落，單層呈破漁網(wǎng)狀，出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)(圖11A)，而對照組正常(圖11B)。采用微量培養(yǎng)板培養(yǎng)法測定病毒滴度為105.33±0.21TCID50/mL。細(xì)胞培養(yǎng)病毒的分子檢測結(jié)果顯示，RT-PCR擴增出的片段為461 bp ，與預(yù)期結(jié)果相一致，且條帶單一(圖12)。表明BC-Fin細(xì)胞對GCRV-JX0901敏感，GCRV-JX0901病毒可在BC-Fin細(xì)胞上增殖。

圖11　GCRV-JX0901感染BC-Fin細(xì)胞

圖12　GCRV-JX0901 RT-PCR檢測結(jié)果

3討論

原代細(xì)胞培養(yǎng)方法主要有組織塊移植法、酶消化法、機械分散法、絡(luò)合劑分散法等[8]。常用的是組織塊移植法和胰酶消化法，比較這兩種原代細(xì)胞培養(yǎng)法的優(yōu)缺點，組織塊法更適用于難以消化的組織，考慮到鰭條組織質(zhì)地堅硬，選擇組織塊法對青魚鰭條細(xì)胞進行原代培養(yǎng)。采用酶消化法對青魚鰭條細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)，一般以1∶2的比例分瓶傳代。傳代培養(yǎng)時選擇生長末期或平臺期的細(xì)胞為宜。細(xì)胞是否可以長期凍存和成功復(fù)蘇，對于建立穩(wěn)定的細(xì)胞系至關(guān)重要。本實驗中，采用液氮保存法，經(jīng)過程序降溫盒在-80 ℃梯度式降溫后放入液氮中，有效避免了細(xì)胞在降溫過程中冰晶形成造成的傷害[3,8]。細(xì)胞復(fù)蘇后，生長狀態(tài)良好，形態(tài)與凍存之前無差別，經(jīng)臺盼藍染色后計數(shù)，細(xì)胞復(fù)蘇的成活率達約(90.09±4.65)%。證明此細(xì)胞可長期保存于液氮中。值得注意的是，經(jīng)過復(fù)蘇的細(xì)胞在細(xì)胞貼壁后要盡早更換培養(yǎng)液，以便較早去除培養(yǎng)基中的DMSO，實驗過程中發(fā)現(xiàn)較早更換培養(yǎng)液的細(xì)胞狀態(tài)好于較晚更換培養(yǎng)液的細(xì)胞。

BC-Fin細(xì)胞系生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，含15%的胎牛血清的L-15培養(yǎng)液于25 ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，BC-Fin生長最好，細(xì)胞群體倍增時間為60.6 h。L-15培養(yǎng)液采用磷酸鹽緩沖體系，氨基酸組成進一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖，使用于無二氧化碳下培養(yǎng)細(xì)胞，且此培養(yǎng)液用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)[3,9]。胎牛血清中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可以促進細(xì)胞貼壁和生長，保護細(xì)胞免受重金屬離子、蛋白酶等物質(zhì)的損害[3]；但當(dāng)血清濃度過高時會產(chǎn)生較多的代謝產(chǎn)物，甚至?xí)种萍?xì)胞增長，因此選擇適合的血清濃度至關(guān)重要。BC-Fin細(xì)胞系的胎牛血清濃度為15%時，細(xì)胞表現(xiàn)出最佳生長性能。青魚鰭條細(xì)胞最適溫度為25 ℃，與青魚的養(yǎng)殖溫度22～28 ℃基本一致。生長因子主要通過與酪氨酸激酶性受體結(jié)合，刺激細(xì)胞增殖[11]，bFGF 因子是一種陽離子多肽，具有刺激成纖維細(xì)胞分裂能力的作用[10]。在培養(yǎng)半滑舌鰨細(xì)胞時使用EGF和bFGF,亦發(fā)現(xiàn)這些生長因子具有促進魚類細(xì)胞增殖的作用[11]。本試驗中在進行青魚鰭條組織細(xì)胞原代培養(yǎng)時，于培養(yǎng)基中添加適量EGF和bFGF，可明顯促進組織塊中細(xì)胞遷出形成生長暈以及細(xì)胞增殖。

16S已被廣泛用于鑒定細(xì)胞來源。本實驗中通過PCR擴增技術(shù)，獲得了青魚線粒體中的16S rRNA基因片段，從分子水平上可確定此細(xì)胞系來源于青魚。細(xì)胞染色體分析是鑒定細(xì)胞系的重要依據(jù)。通過對第16代BC-Fin細(xì)胞系進行染色體分析發(fā)現(xiàn)，BC-Fin細(xì)胞系二倍體染色體數(shù)目為2n=48，與基于正常染色體數(shù)目一致，但第41代細(xì)胞的染色體數(shù)目分布在32～56區(qū)間，眾數(shù)為46。染色體數(shù)目的變化可能是由于細(xì)胞為了適應(yīng)體外環(huán)境，在長期的傳代培養(yǎng)中染色體發(fā)生了缺失、畸變、斷裂或重組等。染色體的變異也會導(dǎo)致一些功能的喪失，因此基于細(xì)胞的體外研究應(yīng)盡量選擇早期傳代細(xì)胞。

細(xì)胞系是分離培養(yǎng)病毒病原的重要基礎(chǔ)材料。青魚來源細(xì)胞系的缺乏，制約有關(guān)青魚出血病等病毒病的研究進展。本研究采用草魚呼腸孤病毒GCRV-JX0901毒株感染青魚鰭條細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯病變效應(yīng)，證明此細(xì)胞系對GCRV敏感。這與養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中觀察到的草魚出血病呼腸孤病毒可以感染養(yǎng)殖青魚的結(jié)果一致[12]。草魚對GCRV高度敏感，GCRV感染草魚可導(dǎo)致草魚大量死亡。同時，草魚呼腸孤病毒亦能感染養(yǎng)殖青魚，導(dǎo)致青魚出血病的發(fā)生，但死亡率低于草魚出血病，我們推測，草魚呼腸孤病毒感染青魚可能有不同的感染和致病機理。

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