論文：草魚D-loop多態(tài)性與幼苗生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

草魚D-loop多態(tài)性與幼苗生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

傅建軍1,2, 張 猛1, 沈玉幫1, 陳 勇3, 李家樂1

(1.上海海洋大學(xué)，省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214081；3.通威股份有限公司水產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，成都 610093)

為了探索草魚(Ctenopharyngodonidella)線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)多態(tài)性對生長性狀的影響，鑒于mtDNA的母性遺傳特征，本研究基于2011年繁殖用的20尾母本的D-loop序列信息，與通過親子鑒定獲得的853尾40日齡子代的體長、體質(zhì)量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，草魚6種D-loop單倍型對生長性狀表型差異具有極顯著影響(P<0.01)；其中，單倍型為Hap16的子代的體長最大，并顯著大于單倍型為Hap4的子代的體長(P<0.05)；單倍型為Hap18和Hap16的子代的體質(zhì)量較大，依次大于其他單倍型子代的體質(zhì)量，并顯著大于單倍型為Hap4的子代的體質(zhì)量(P<0.05)。此外，草魚D-loop序列各變異位點(diǎn)基因型對生長性狀的影響水平不同；其中，Site01、Site06和Site07等3個位點(diǎn)對體長的差異存在顯著影響(P<0.05)，Site06和Site07等2個位點(diǎn)對體質(zhì)量的差異存在顯著影響(P<0.05)。研究表明，草魚D-loop序列變異對子代生長性狀具有顯著影響，推測在草魚生長性狀改良的選育進(jìn)程中，可以利用mtDNA多態(tài)性信息進(jìn)行輔助選擇。

草魚(Ctenopharyngodonidella)；D-loop序列；多態(tài)性；生長性狀；關(guān)聯(lián)性

草魚(Ctenopharyngodonidella)是我國重要的大宗淡水魚養(yǎng)殖品種之一，其養(yǎng)殖產(chǎn)量在世界淡水漁業(yè)中排名前列[1]。目前，選育生長優(yōu)勢的草魚新品種，是滿足日益增長的市場需求及實(shí)現(xiàn)其可持續(xù)利用的有效途徑之一。然而，草魚親本個體大、成熟年限長，其常規(guī)選育進(jìn)展較慢。通過篩選和利用與草魚生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，可以有效提高選擇效率、縮短育種年限，對加快草魚生長性狀的改良進(jìn)程具有重要意義[2]。

目前，研究人員主要從核基因組水平篩選與表型性狀存在關(guān)聯(lián)性分子標(biāo)記，如SSR (Simple sequence repeats)標(biāo)記[2]，及草魚谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶[3]、醛縮酶A[4]、檸檬合酶[5]、PRL[6]和MSTN-1[7]等功能基因中篩選到一些與生長性狀相關(guān)的SNP (Single nucleotide polymorphism)位點(diǎn)，這可為草魚分子輔助育種提供輔助標(biāo)記。作為重要的細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)，線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)對維持動物正常生命活動有重要意義。在魚類研究中，Danzmann等[8]和Ferguson等[9]研究表明mtDNA變異對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)生長性狀存在顯著影響。就草魚而言，基于mtDNA序列變異對草魚群體遺傳變異研究已有較多開展[10-12]，而基于mtDNA變異與表型性狀間的關(guān)聯(lián)分析還未見報(bào)道。該研究基于草魚育種材料，利用已發(fā)表文獻(xiàn)中母本mtDNA的D-loop序列多態(tài)性信息[12]與子代生長性狀[13]進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，探討草魚mtDNA變異與生長表型的關(guān)聯(lián)性，以期豐富草魚生長性狀遺傳改良的潛在輔助標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2011年5月，在江蘇吳江國家級四大家魚原種場(蘇州市吳江水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司)開展草魚繁育工作。繁殖用親本來源于珠江水系的肇慶群體[12]，并剪鰭固定于無水乙醇，4 ℃保存，用于后續(xù)DNA提取。

實(shí)驗(yàn)中，對50尾親本(25尾雌魚、25尾雄魚)采取人工激素結(jié)合水流刺激進(jìn)行催產(chǎn)，在約20 m3圓形水泥池中進(jìn)行。人工授精過程，用干燥潔凈注射器收集雄魚精液，并于4～8 ℃冰盒避光暫存；然后對催產(chǎn)成熟雌魚逐個擠卵，根據(jù)雌魚卵量，隨機(jī)與2～4尾雄魚精液混合，每個交配單元用500 mL卵子與2 mL精液混合，于同一孵化桶(約1 m3容積)內(nèi)孵化，經(jīng)過2 d連續(xù)的流水孵化(22～24 ℃)。水花魚苗通過土池(2 000～2 500 m2，池中心水深1 m左右)培育，飼養(yǎng)密度為150尾/m2，下塘前通過施有機(jī)肥培育開口餌料，下塘3 d后潑灑豆?jié){，并保持池水肥度，下塘7 d后開始投喂人工顆粒料。

2011年7月，隨機(jī)收集864尾40日齡夏花草魚苗，測量體長和體質(zhì)量數(shù)據(jù)；測量工具分別為游標(biāo)卡尺(精確到0.002 cm)和電子天平(精確到0.01 g)。同時，剪尾部組織固定于無水乙醇，4 ℃保存，用于后續(xù)DNA提取。

1.2 DNA提取及親子鑒定

對收集的草魚鰭條組織使用改良的高鹽法[14]提取基因組DNA，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，經(jīng)NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測純度和濃度，并稀釋至50 ng/μL，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

實(shí)驗(yàn)魚的系譜關(guān)系通過基于12個微衛(wèi)星標(biāo)記的親子鑒定技術(shù)構(gòu)建[15]。對人工繁殖的親本和子代個體進(jìn)行基因型分析，基于似然法采用Cervus 3.0軟件[16]確定親子關(guān)系，分析中采用95%的置信度，并排除多于3個位點(diǎn)錯配的親子關(guān)系。

1.3 親子數(shù)據(jù)整理與關(guān)聯(lián)分析

該研究母本D-loop多態(tài)性信息來源于傅建軍等[12]的文獻(xiàn)，母本D-loop區(qū)(898 bp)的單倍型和變異位點(diǎn)信息采用DnaSP 5.0軟件[17]統(tǒng)計(jì)；為了減少不同養(yǎng)殖池塘的影響，數(shù)據(jù)來源為Fu等[13]報(bào)道的同一池塘(Pond 01)的 853尾獲得準(zhǔn)確系譜關(guān)系的40日齡草魚的體長和體質(zhì)量數(shù)據(jù)，鑒定后代來自20尾母本(5尾參加繁殖的母本未獲得后代)。

利用SPSS 16.0軟件[18]對各單倍型及變異位點(diǎn)基因型與對應(yīng)子代的生長性狀進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，多重比較的顯著性檢驗(yàn)采用Duncan法(新復(fù)極差法)。并利用一般線性摸型(General linear model，GLM)分析，其數(shù)學(xué)模型為：

Yij=μ+Mi+eij

式中，Yij為第i單倍型(或變異位點(diǎn)基因型)內(nèi)第j個體的某性狀觀察值，μ為某性狀總體平均值，Mi為第i單倍型(或變異位點(diǎn)基因型)的效應(yīng)值，eij為個體隨機(jī)殘差項(xiàng)。

2 結(jié)果

2.1 D-loop單倍型與生長性狀的關(guān)聯(lián)性

方差分析如表1所示，不同單倍型子代生長性狀差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。不同單倍型子代生長性狀的描述性統(tǒng)計(jì)及多重比較結(jié)果如表2所示，研究發(fā)現(xiàn)6個單倍型對應(yīng)子代生長性狀具有顯著差異(P<0.05)，被劃分為2個一致性子集。其中，單倍型為Hap16的子代的體長最大，并顯著大于單倍型為Hap4的子代的體長(P<0.05)；單倍型為Hap18和Hap16的子代的體質(zhì)量較大，依次大于其他單倍型子代的體質(zhì)量，且顯著大于單倍型為Hap4的子代的體質(zhì)量(P<0.05)。

表1 草魚不同D-loop單倍型子代生長性狀的方差分析結(jié)果Tab.1 Variance analysis of offspring growth traits based on different D-loop haplotypes in C.idella

表2 草魚不同D-loop單倍型子代生長性狀的描述性統(tǒng)計(jì)及多重比較Tab.2 Descriptive statistics and multiplex comparisons of offspring growth traits based on different D-loop haplotypes in C.idella

注： 各性狀同列多重比較，具有不同字母表示差異不顯著(P<0.05)。

2.2 D-loop變異位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)性

各變異位點(diǎn)基因型對應(yīng)子代生長性狀描述性統(tǒng)計(jì)與均值比較結(jié)果如表3所示，研究發(fā)現(xiàn)對體長有顯著影響的變異位點(diǎn)有Site01(P<0.05)、Site06(P<0.01)和Site07(P<0.01)；對體質(zhì)量有顯著影響的變異位點(diǎn)有Site06和Site07(P<0.05)。

表3 草魚D-loop序列各變異位點(diǎn)基因型對應(yīng)子代生長性狀描述性統(tǒng)計(jì)和比較Tab.3 Descriptive statistics and comparisons of offspring growth traits based on different genotypes for each variable site of D-loop sequences in C.idella

3 討論

mtDNA是重要的細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)，具有轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能，能合成與自身結(jié)構(gòu)有關(guān)的一部分蛋白質(zhì)。研究表明，mtDNA序列變異可能對動物經(jīng)濟(jì)性狀造成不同程度影響。在家畜相關(guān)研究中，Sutarno等[19]研究發(fā)現(xiàn)牛(Bovine)mtDNA的D-loop區(qū)多態(tài)性與繁殖性能有顯著關(guān)聯(lián)；Jeon等[20]研究發(fā)現(xiàn)牛mtDNA 的COI、II、III基因變異與其重量性狀差異存在顯著相關(guān)；Biase等[21]研究發(fā)現(xiàn)牛mtDNA的tRNA基因變異與體質(zhì)量及育種估值顯著相關(guān)；Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)牛mtDNA的ND5基因變異與早期生長性狀差異有顯著相關(guān)。在水產(chǎn)動物研究中，Danzmann等[8]和Ferguson等[9]研究發(fā)現(xiàn)虹鱒mtDNA變異對其生長性狀存在顯著影響；此外，F(xiàn)isher等[23]研究發(fā)現(xiàn)貽貝屬(Mytilus)mtDNA異質(zhì)性與性別存在相關(guān)。

mtDNA作為母性遺傳物質(zhì)，該研究用母本mtDNA的序列替代對應(yīng)子代的mtDNA信息，對于父本mtDNA不做考慮。研究發(fā)現(xiàn)草魚不同D-loop單倍型及其變異位點(diǎn)基因型與子代生長性狀差異存在顯著的關(guān)聯(lián)性。導(dǎo)致這種相關(guān)性的原因推測有以下2種可能：其一，線粒體作為能量代謝重要細(xì)胞器，其mtDNA變異可能引起能量代謝水平的差異，進(jìn)而影響個體的生長表現(xiàn)；其二，mtDNA呈母系遺傳，mtDNA多態(tài)性信息可能以母性遺傳效應(yīng)形式對后代生長表現(xiàn)造成影響。就該研究的實(shí)驗(yàn)材料而言，在Fu等[13]對40日齡草魚生長性狀的遺傳參數(shù)估計(jì)中，發(fā)現(xiàn)母性效應(yīng)對子代生長性狀并不顯著?？紤]到該研究親本(20尾母本)及個別單倍型子代數(shù)量(Hap16子代僅有4尾)相對較少，部分研究結(jié)果還有待擴(kuò)充數(shù)量進(jìn)一步驗(yàn)證；盡管如此，即便剔除子代數(shù)目較少的單倍型(Hap16)相應(yīng)的數(shù)據(jù)，還能發(fā)現(xiàn)其他單倍型之間存在顯著差異。因此，可以推測草魚D-loop序列變異對子代早期生長性狀存在影響，而mtDNA的功能基因多態(tài)性與生長表型的關(guān)聯(lián)研究也值得期待。此外，相對于對所有個體的mtDNA測序或基因型檢測，基于mtDNA的母系遺傳特征，通過以母本mtDNA序列信息作為后代mtDNA序列信息的參考，有助于減少實(shí)驗(yàn)成本?？梢?，在草魚生長性狀的遺傳改良和育種進(jìn)程中，可嘗試借助母本mtDNA多態(tài)性預(yù)測后代的生長表現(xiàn)，并為交配設(shè)計(jì)和選擇提供輔助依據(jù)。

[1] FAO.The State of World Fisheries and Aquaculture 2012[M].Rome:FAO，2012: 36-40.

[2]王解香,白俊杰,于凌云.草魚EST-SSRs標(biāo)記的篩選及其與生長性狀相關(guān)分析[J].淡水漁業(yè),2012,42(1):3-8.

[3]劉小獻(xiàn),白俊杰,徐 磊,等.草魚GSTR基因外顯子1、外顯子2的SNPs篩選及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,30(6):753-758.

[4]李璽洋,白俊杰,于凌云,等.草魚醛縮酶A3-UTR突變與生長性狀相關(guān)研究[J].淡水漁業(yè),2012,42(5):13-16.

[5]樊佳佳,劉小獻(xiàn),白俊杰,等.草魚檸檬酸合酶基因SNP篩選及與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,33(3):84-89.

[6]傅建軍,張 猛,沈玉幫,等.草魚PRL基因多態(tài)性與幼魚生長性狀和肌肉成分的關(guān)聯(lián)分析[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2016,23(3):491-499.

[7]張 猛,陳 勇,沈玉幫,等.草魚MSTN-1基因多態(tài)性與早期生長性狀和肌肉成分關(guān)聯(lián)分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2016,40(4):618-625.

[8] Danzmann R G，F(xiàn)erguson M M.Heterogeneity in the body size of Ontario cultured rainbow trout with different mitochondrial DNA haplotypes[J].Aquaculture，1995，137(1-4): 231-244.

[9] Ferguson M M，Danzmann R G.Inter-strain differences in the association between mitochondrial DNA haplotype and growth in cultured Ontario rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)[J].Aquaculture，1999，178(3-4): 245-252.

[10] 晏 勇,張興忠,龍 華.草魚線粒體DNA限制性內(nèi)切酶分析[J].淡水漁業(yè),1994,24(3):30-31.

[11]李樹華,陳大慶,段辛斌,等.基于線粒體DNA標(biāo)記的長江中游草魚親本增殖放流的遺傳效果評估[J].淡水漁業(yè),2014,44(3):45-50.

[12]傅建軍,王榮泉,沈玉幫,等.我國草魚野生群體D-Loop序列遺傳變異分析[J].水生生物學(xué)報(bào),2015,39(2):349-357.

[13] Fu J，Shen Y，Xu X，et al.Genetic parameter estimates and genotype by environment interaction analyses for early growth traits in grass carp (Ctenopharyngodonidella)[J].Aquacult Int，2015，23(6): 1427-1441.

[14] Rivero E R，Neves A C，Silva-Valenzuela M G，et al.Simple salting-out method for DNA extraction from formalin-fixed，paraffin-embedded tissues[J].Pathol Res Pract，2006，202(7): 523-529.

[15] Fu J，Shen Y，Xu X，et al.Multiplex microsatellite PCR sets for parentage assignment of grass carp (Ctenopharyngodonidella).Aquaculture International，2013，21(6): 1195-1207.

[16] Kalinowski S T，Taper M L，Marshall T C.Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment[J].Mol Ecol，2007，16(5): 1099-1106.

[17] Rozas J，Sánchez-Delbarrio J C，Messeguer X，et al.DnaSP，DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[J].Bioinformatics，2003，19(18): 2496-2497.

[18] Cleophas T J，Zwinderman A H.SPSS for Starters[M].Springer Netherlands，2010: 15-18.

[19] Sutarno，Cummins J M，Greeff J，et al.Mitochondrial DNA polymorphisms and fertility in beef cattle[J].Theriogenology，2002，57(6): 1603-1610.

[20] Jeon G J，Chung H Y，Choi J G，et al.Relationship between genetic variants of mitochondrial DNA and growth traits in Hanwoo cattle[J].Asian Australas J Anim Sci，2005，18(3): 301-307.

[21] Biase F H，Meirelles F V，Gunski R，et al.Mitochondrial DNA single nucleotide polymorphism associated with weight estimated breeding values in Nelore cattle (Bosindicus)[J].Genet Mol Biol，2008，30(4): 1058-1063.

[22] Zhang B，Chen H，Hua L，et al.Novel SNPs of the mtDNA ND5 gene and their associations with several growth traits in the Nanyang cattle breed[J].Biochem Genet，2008，46(5-6): 362-368.

[23] Fisher C，Skibinski D O F.Sex-biased mitochondrial DNA heteroplasmy in the marine musselMytilus[J].Proc R Soc London，1990，242(1305): 149-156.