論文：草魚不同部位肌肉營養(yǎng)成分、肌纖維特性以及脂肪代謝相關基因的表達

草魚不同部位肌肉營養(yǎng)成分、肌纖維特性以及脂肪代謝相關基因的表達

陳 潔,李大鵬,張志敏,湯 蓉,李 莉,張 曦,肖 琛,孫怡晴,Onxayvieng Kommaly

(華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室，武漢 430070)

為了探討草魚(Ctenopharyngodonidella)不同部位肌肉品質(zhì)的差異，本研究選取體質(zhì)量為(1 026.10±145.55)g的草魚，檢測了背部、腹上部、腹底部和尾部肌肉的營養(yǎng)成分、肌纖維組織結(jié)構(gòu)特性以及脂肪代謝相關基因的表達。結(jié)果表明，草魚腹底部肌肉的粗脂肪含量顯著高于背部、腹上部和尾部肌肉，而水分含量則顯著降低；背部肌肉粗蛋白含量顯著高于腹上部、腹底部和尾部肌肉。腹上部肌肉的肌纖維直徑顯著高于背部、腹底部和尾部肌肉，但其肌纖維密度則顯著降低，而最高的肌纖維密度出現(xiàn)在腹底部肌肉；草魚背部和尾部肌肉肌纖維密度無顯著差異。草魚腹底部肌肉的脂蛋白脂肪酶基因mRNA表達量顯著高于草魚背部、腹上部和尾部肌肉。脂肪酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶α的mRNA表達量在草魚背部、腹上部、腹底部和尾部肌肉之間無顯著差異。研究表明，草魚不同部位的肌肉營養(yǎng)特性存在顯著性差異，肌肉脂肪含量與肌纖維直徑呈負相關，與脂蛋白脂肪酶基因的表達量呈正相關。

草魚(Ctenopharyngodonidella)；營養(yǎng)成分；肌纖維；脂肪代謝

Nutritional compositions, muscular fiber properties, and the expression oflipid metabolic related genes in different parts of muscle inCtenopharyngodonidella

隨著社會文明的發(fā)展，人們對水產(chǎn)品質(zhì)量安全和魚肉品質(zhì)的關注度越來越高。魚類肌肉品質(zhì)評價內(nèi)容包含營養(yǎng)成分、感官特征、質(zhì)構(gòu)特性等方面[1]，通常從魚肉的安全性、對人體的健康性和食用的滿意度這三個方面來衡量[2]。肌肉營養(yǎng)成分與肌肉品質(zhì)密切相關，魚類肌肉中脂肪和蛋白質(zhì)含量會影響肌肉的感官特征[3]。肌纖維特性被認為是肌肉品質(zhì)的主要決定因素，肌纖維的橫截直徑和面積、肌纖維密度都會影響魚肉品質(zhì)[4,5]。

草魚(Ctenopharyngodonidella)是我國淡水養(yǎng)殖規(guī)模最大和養(yǎng)殖區(qū)域最廣的魚類品種，其2015年養(yǎng)殖產(chǎn)量占據(jù)全國淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的18.54%[6]。肌肉組織是魚類的主要食用部分。以往研究表明，草魚背部和腹部肌肉中的水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量[7]、肌纖維直徑和肌纖維密度[8]都存在一定的差異。通過對草魚機體脂肪分布進行磁共振成像后發(fā)現(xiàn)，草魚肌肉中的脂肪主要蓄積在腹底部[9]，而魚類脂肪的堆積和代謝，往往依賴于包括脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)和乙酰輔酶A羧化酶α(Acetyl-CoA carboxylase α，ACCα)等在內(nèi)的關鍵調(diào)控酶[10]類作用的發(fā)揮。LPL是甘油三酯降解為游離脂肪酸和甘油反應中的限速酶。ACCα是催化脂肪酸合成代謝第一步反應的限速酶，對脂質(zhì)代謝起著至關重要的作用[11]。此外，F(xiàn)AS也是表征和調(diào)控體脂水平的重要基因[12,13]。以往研究表明，武昌魚(Megalobramaamblycephala)和齊口裂腹魚(SchizothoraxprenantiTchang)肌肉中LPL和FAS基因的顯著性上調(diào)，導致了機體肌肉脂肪含量的增加[14,15]。

為了進一步了解草魚不同部位肌肉品質(zhì)的差異以及脂肪代謝相關調(diào)控基因在不同部位肌肉內(nèi)的表達，對草魚背部、腹上部、腹底部和尾部的肌肉品質(zhì)進行了研究，檢測了肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分、肌纖維特性以及LPL、FAS和ACCα的mRNA表達水平，旨在為今后在草魚高效養(yǎng)殖和品質(zhì)改良等方面提供基礎研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗魚

實驗用草魚購自湖北省武漢市白沙洲農(nóng)貿(mào)大市場，體長(40.95±1.63)cm，全長(48.58±1.73)cm，體質(zhì)量(1 026.10±145.55)g，體質(zhì)健康。試驗前，實驗草魚被暫養(yǎng)在華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖試驗系統(tǒng)養(yǎng)殖缸內(nèi)。暫養(yǎng)期間水溫控制在15～16 ℃，pH為7.5±0.3，溶氧保持在7 mg/L以上。從中隨機選取9尾草魚進行實驗研究。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌肉樣品的采集

采用MS-222(250 mg/L)麻醉實驗魚，測量魚的體長、全長和體質(zhì)量。按照肌肉紋理，采集每尾草魚背部、腹上部、腹底部和尾部肌肉，每個部位肌肉的具體采樣方案如圖1所示。背部肌肉采集背鰭前端前數(shù)第二條肌肉紋理、側(cè)線上方0.5 cm處的肌肉；腹上部肌肉采集背鰭前端前數(shù)第二條肌肉紋理、側(cè)線下方1 cm的肌肉；腹底部肌肉采集腹鰭前端前數(shù)第二條肌肉紋理處的肌肉；尾部肌肉采集尾柄部的肌肉。每部位肌肉用于營養(yǎng)成分分析、肌纖維組織學觀察和脂肪代謝相關基因mRNA水平檢測。

圖1 草魚肌肉樣品采集部位Fig.1 Scheme of muscle sampling in C.idella

1.2.2 肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的測定

水分含量采用 105 ℃常壓干燥法，參考GB 5009.3-2010；粗脂肪采用索氏抽提法測定，參考GB/T 5009.6-2003；灰分采用馬弗爐灼燒法測定，參考GB 5009.4-2010；粗蛋白采用凱氏定氮法測定，參考GB 5009.5-2010。

1.2.3 肌纖維組織學觀察

采集不同部位肌肉，切塊(大小約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm)，放入肌肉固定保存液(冰醋酸∶甲醛∶飽和苦味酸=1∶5∶15)中，采用組織學石蠟切片技術和蘇木素-伊紅染色，使用Nikon Eclipse 80i顯微鏡觀察肌纖維組織結(jié)構(gòu)，用Image-pro plus軟件對肌纖維直徑和密度進行測量。使用肌纖維直徑和密度兩個指標衡量不同部位肌肉的肌纖維特性。

1.2.4 脂肪代謝相關基因mRNA水平檢測

總RNA提取及cDNA合成：使用Trizol進行肌肉組織總RNA提取，通過電泳檢測提取的RNA質(zhì)量，并用核酸分析儀測定其純度。采用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書方法進行cDNA合成。

基因的引物設計：根據(jù)GenBank中已有的LPL、FAS和ACCα，用 Primer 5.0軟件設計特異性引物。定量PCR以β-actin為內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

實時熒光定量PCR：反應體系包括SYBRPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)12.5 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水9.5 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

草魚LPL、ACCα和FAS相對表達水平采用2-ΔΔCt法計算。所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，用Graphpad PrismV5.0和Origin作圖。運用皮爾森相關性分析法檢驗不同部位肌肉粗脂肪含量與肌纖維直徑以及基因表達水平之間的相關性。采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan’s法多重比較分析。當P<0.05時，差異顯著；當P<0.01時，差異極顯著，當P<0.001時，差異極其顯著。

表1 脂肪代謝相關基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1 草魚不同部位肌肉的營養(yǎng)成分

草魚不同部位的營養(yǎng)成分存在顯著差異。腹底部肌肉的粗脂肪含量顯著高于背部、腹上部和尾部肌肉(P<0.01)，而腹底部肌肉的水分含量極顯著低于其他部位肌肉(P<0.01)。背部粗蛋白含量顯著高于腹上部、腹底部和尾部肌肉(P<0.05)，草魚不同部位肌肉的灰分含量無顯著性差異(表2)。

表2 草魚不同部位肌肉的營養(yǎng)成分含量

注：表中同行數(shù)據(jù)右上角不同上標字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 草魚不同部位肌肉的組織學結(jié)構(gòu)

由圖2和表3可知，草魚腹上部肌肉的肌纖維直徑要顯著大于草魚背部、腹底部和尾部肌肉(P<0.05)，背部、腹底部和尾部肌纖維直徑之間無顯著差異。腹底部肌肉的肌纖維密度顯著高于背部、腹上部和尾部肌肉(P<0.05)，而最低的肌纖維密度則出現(xiàn)在腹上部(P<0.05)，草魚背部和尾部肌肉之間的肌纖維密度無顯著差異。

圖2 草魚不同部位肌肉的組織學結(jié)構(gòu)(橫切，×200)Fig.2 Histological structure of the different parts of muscle in C.idella (Transection，×200)A：背部肌肉；B：腹上部肌肉；C：腹底部肌肉；D：尾部肌肉 表3 草魚不同部位肌肉的肌纖維直徑和密度 Tab.3 Muscular fiber diameter and density in the different parts of muscle in C.idella

測量項目背部腹上部腹底部尾部肌纖維直徑/μm19838±5362b27244±7355a18116±4620b21610±3537b密度/(根·單位面積-1)3932±256a2092±135b4755±223c3318±345a

2.3 草魚不同部位肌肉脂肪代謝相關基因的表達

腹底部肌肉的LPL基因mRNA相對表達量顯著高于草魚背部、腹上部和尾部肌肉 (P<0.01)，F(xiàn)AS和ACCα的mRNA相對表達量在草魚背部、腹上部、腹底部和尾部肌肉中無顯著差異(圖3)。

圖3 草魚不同部位肌肉中LPL、FAS和ACCα基因的mRNA相對表達量Fig.3 The mRNA expression level of LPL, FAS, and ACCα in the different parts muscle of C.idella草魚腹上部肌肉中的表達豐度設定為1，不同英文字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 肌肉粗脂肪含量與肌纖維直徑和脂肪代謝基因表達量之間的相關性分析

如圖4和圖5所示，肌肉粗脂肪含量與肌纖維直徑呈負相關(P<0.01)，草魚肌肉的粗脂肪含量與LPL mRNA相對表達量之間呈正相關(P<0.001)。草魚肌肉的脂肪含量與FAS和ACCα mRNA相對表達量之間無顯著相關。

圖4 草魚不同部位肌肉粗脂肪含量與肌纖維直徑的相關性分析Fig.4 Correlation analysis between crude lipid content and muscular fiber diameter in the different parts of muscle in C.idella

圖5 草魚不同部位肌肉粗脂肪含量與LPL mRNA相對表達量的相關性分析Fig.5 Correlation analysis between Crude lipid content and LPL relation mRNA levels in the different parts of muscle in C.idella

3 討論

魚肉以其高蛋白、低脂肪、富含EPA和DHA以及人體多種必需氨基酸受到廣大消費者的歡迎。草魚作為我國重要淡水養(yǎng)殖魚類，是國民飲食中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源。本研究發(fā)現(xiàn)，草魚不同部位肌肉的營養(yǎng)成分存在顯著性差異，草魚背部肌肉粗蛋白含量最高，腹底部肌肉中脂肪含量最高。以往研究也發(fā)現(xiàn)鰈(Hippoglossushippoglossus)、齊口裂腹魚背部粗蛋白含量顯著性高于腹部肌肉[15,16]。此外，草魚、羅非魚(Oreochromisniloticus)和大黃魚(Pseudosciaenacrocea)等魚類的腹部肌肉脂肪含量也高于背部肌肉[10]。這與我們的研究結(jié)果一致。這說明，同一種魚類的不同部位肌肉營養(yǎng)成分也存在顯著性的差異[16]。

肌肉纖維是骨骼肌的主要組成成分，魚體骨骼肌約占活體重量的30%～80%[17]。在魚類生長過程中，肌肉生長是肌纖維增生和增粗的結(jié)果[4]，受內(nèi)在基因調(diào)控和外界環(huán)境的共同影響[18-22]。肌纖維特性包括不同肌纖維類型的數(shù)量和比例、肌纖維密度和直徑、肌纖維橫截面積。魚類肌纖維特性和結(jié)締組織的含量，都與魚類肌肉品質(zhì)密切相關，肌纖維的直徑和密度與肌肉質(zhì)構(gòu)特性(如硬度、彈性、咀嚼性等)有關[23]。在草魚的研究中發(fā)現(xiàn)肌纖維直徑減小，肌纖維數(shù)目增多[24,25]。在很多高等動物的研究中，肌肉脂肪含量與肌纖維密度和直徑有一定的相關性[26,27]。本研究中發(fā)現(xiàn)草魚腹底部肌肉的粗脂肪含量蓄積最多，同時草魚腹底部肌肉的肌纖維直徑最小，且肌肉中粗脂肪含量與肌纖維直徑成負相關關系。對高等動物的研究也發(fā)現(xiàn)了肌肉脂肪含量與肌纖維直徑呈負相關的規(guī)律[28]。這說明魚類肌肉脂肪含量與肌纖維直徑存在一定的負相關關系。

魚類肌肉品質(zhì)的高低往往與其脂肪含量的多少有密切的關系[3]。研究脂肪代謝相關基因在魚體不同部位肌肉中的表達差異情況，可以從基因水平上探究調(diào)控草魚肌肉脂肪沉積的機制。魚類組織中積累的脂肪來自攝入的外源脂肪和體內(nèi)自身合成的內(nèi)源脂肪，超過機體各組織需求的外源性脂肪在肝臟中轉(zhuǎn)變?yōu)槿８视停⑴c特定的載脂蛋白包裝成極低密度脂蛋白(VLDL)，VLDL從肝臟進入血液，再運至肌肉和脂肪組織，激活組織中的FAS，LPL將VLDL中的脂肪酸水解形成游離脂肪酸，再由脂肪細胞吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)槿８视蛢Υ嬗诩毎?，游離脂肪酸同時也可以用于氧化供能。內(nèi)源性脂肪的合成是一系列的酶促反應，在脂肪酸合成過程中，乙酰輔酶A在ACCα催化下形成丙二酸單酰輔酶A，乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A在FAS的作用下形成脂肪酸[29]。在本研究中草魚腹底部肌肉的LPL基因的表達量顯著高于草魚背部、腹上部和尾部肌肉，而FAS和ACCα的表達量在草魚背部、腹上部、腹底部和尾部肌肉中無顯著差異。同時，草魚肌肉的粗脂肪含量與LPL mRNA相對表達量之間呈正相關性。在金頭鯛(Sparusaurata)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究中發(fā)現(xiàn)，魚體肌肉粗脂肪含量增加時，LPLmRNA的表達量也顯著性的上調(diào)[30,31]，這與本研究結(jié)果一致，說明草魚腹底部LPL mRNA的表達與腹底部脂肪的積累存在一定的相關性。

綜上所述，草魚不同部位肌肉的常規(guī)營養(yǎng)成分存在顯著性差異，與肌纖維直徑以及脂肪代謝基因LPL mRNA的表達存在相關性。草魚肌肉脂肪含量與LPL mRNA相對表達量呈正相關，與肌纖維直徑呈負相關關系。

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