基于胺響應(yīng)的花青素水凝膠監(jiān)測魚/蝦新鮮度的方法

富含蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品會(huì)由于溫度、光照、濕度的變化和微生物的生長發(fā)生腐敗，而輕微的腐敗變質(zhì)難以被察覺。水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)過程會(huì)產(chǎn)生氨和揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì)，導(dǎo)致pH值變化。花青素對pH值變化高度敏感，且隨著pH值的改變能呈現(xiàn)出多種顏色變化，為開發(fā)基于顏色變化的質(zhì)量指示方法奠定了重要基礎(chǔ)。

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院的董盛葉、石星波*和長沙礦冶院檢測技術(shù)有限責(zé)任公司的符招弟*等人 制備了一種對生物胺響應(yīng)的花青素功能水凝膠，可用于快速、便攜、可視、無損監(jiān)測魚蝦新鮮度，以瓊脂糖為載體，以紫甘薯花青素（PSPA）為比色前體物，制成功能性水凝膠。選用三甲胺（TMA）作為食品腐敗的指示物，驗(yàn)證PSPA水凝膠的質(zhì)量指示功能。PSPA水凝膠的顏色通過智能手機(jī)采集，并使用Image J軟件進(jìn)行RGB分析得到數(shù)字化信息，以期為便攜式現(xiàn)場即時(shí)檢測食品新鮮度提供新的路徑。

1 基于PSPA水凝膠監(jiān)測新鮮度方法的建立

無損監(jiān)測魚/蝦新鮮度的方法是基于PSPA結(jié)構(gòu)會(huì)隨著pH值的改變，發(fā)生由黃酮陽離子（紅色）→甲醇假堿基（淡粉色）→醌基（藍(lán)紫色）→查耳酮（黃綠色）等系列顏色轉(zhuǎn)變而建立的（圖1A）。以瓊脂糖為載體，加入PSPA后冷卻固化制備成功能水凝膠。魚/蝦腐敗產(chǎn)生的TVB-N與水凝膠中的水作用形成堿性環(huán)境，使PSPA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導(dǎo)致水凝膠發(fā)生肉眼可分辨的顏色變化，智能手機(jī)定時(shí)采集水凝膠的顏色并通過Image J進(jìn)行RGB分析，得到顏色變化的數(shù)字化信息（圖1B）。建立G/R值與揮發(fā)性胺濃度之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)即時(shí)、無損監(jiān)測魚/蝦新鮮度。

2 不同pH值的PSPA顏色和光譜變化

對PSPA在不同pH值緩沖溶液中的顏色變化進(jìn)行測試，以確定其作為天然pH值指示劑的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。如圖2所示，pH 1.0～5.0時(shí)，PSPA溶液呈紅色，吸光度隨pH值的增加而降低（pH 2.0～5.0），此時(shí)PSPA主要是以黃酮陽離子的形式存在。pH 6.0～8.0時(shí)，轉(zhuǎn)化為無色的甲醇假堿形式，溶液呈紫色且顏色逐漸變淺，紫外吸收峰發(fā)生紅移且強(qiáng)度降低。pH 9.0～12.0時(shí)，PSPA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為無色的甲醇假堿形式，從而使溶液顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)綠色。隨著pH值進(jìn)一步升高（pH 13.0～14.0），花青素被降解，結(jié)構(gòu)遭到破壞，此時(shí)溶液呈現(xiàn)黃綠色/黃色，在524～612 nm波長范圍內(nèi)不再出現(xiàn)明顯的紫外吸收峰。

3 基于功能水凝膠檢測生物胺的可行性驗(yàn)證

如圖3所示，加入TMA后PSPA溶液的顏色由玫紅色變?yōu)榫G色，且最大紫外吸收峰發(fā)生較大程度的紅移（約70 nm）；當(dāng)PSPA被添加到瓊脂糖水凝膠中（圖3B中曲線b），PSPA水凝膠的顏色依然保持玫紅色，與TMA蒸氣反應(yīng)后呈現(xiàn)綠色，紫外吸收峰紅移了約72 nm。這一結(jié)果表明，加入瓊脂糖的PSPA依然具有與堿性氣體發(fā)生反應(yīng)的能力，可以應(yīng)用于監(jiān)測魚/蝦新鮮度。

4 PSPA水凝膠制備條件的優(yōu)化

如圖4所示，為了保證所制備的PSPA水凝膠具有最佳的胺類響應(yīng)功能，對水凝膠中PSPA添加量、瓊脂糖添加量、水凝膠厚度進(jìn)行優(yōu)化。圖4A中，與TMA蒸氣反應(yīng)后的PSPA水凝膠的顏色數(shù)字化信息G/R值表明：PSPA添加量為12 mg/mL時(shí)有最佳的顏色響應(yīng)，且隨著PSPA質(zhì)量濃度的增大，功能水凝膠不再表現(xiàn)出大的顏色差異。瓊脂糖的濃度直接影響水凝膠整體結(jié)構(gòu)的致密性，進(jìn)而影響胺蒸氣的滲入，圖4B表明瓊脂糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%有較好的比色效果，且在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.3%的水凝膠稀軟無法定型。水凝膠厚度是影響G/R準(zhǔn)確性的關(guān)鍵所在，太薄的膠體拍照時(shí)容易散光且檢測的線性范圍縮小；膠體太厚致使上層水凝膠被反應(yīng)，而下層依然保持反應(yīng)前的本色，使采集信號時(shí)出現(xiàn)誤差，圖4C表明水凝膠厚度為3.0 mm時(shí)能夠被TMA完全反應(yīng)，且具有最佳的G/R值。因此，獲得了制備PSPA水凝膠的最佳條件（PSPA質(zhì)量濃度12 mg/mL；瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%；水凝膠厚度3 mm）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5 PSPA水凝膠檢測TMA的靈敏度

為了研究PSPA水凝膠的靈敏度，將PSPA水凝膠蓋扣在裝有一系列不同濃度TMA的離心管上方，以模擬監(jiān)測食物腐敗過程。圖5A表明，隨著TMA蒸氣濃度從0～194.22×10-9 mol/L范圍內(nèi)逐漸增加，與TMA反應(yīng)后的PSPA水凝膠的最大紫外-可見吸收光譜發(fā)生紅移的程度逐漸增大，最大紅移程度可達(dá)到70 nm。相應(yīng)的PSPA水凝膠的顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色再轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色。當(dāng)TMA蒸氣超過97.01×10-9 mol/L時(shí)，水凝膠的顏色不再發(fā)生明顯變化（圖5B插圖）。圖5B中PSPA水凝膠對于TMA蒸氣的響應(yīng)信號被定義為與TAM反應(yīng)后灰度值之比G/R。G/R值與TMA濃度在8.78×10-9～19.386×10-9 mol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（圖5B插圖），回歸方程為Y=0.023 6CTMA＋0.640 35（R2=0.992 1），檢出限為0.84×10-9 mol/L。以上結(jié)果表明該便攜式水凝膠能夠有效定量檢測TMA濃度，為監(jiān)測實(shí)際樣品的新鮮度提供良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

此外，PSPA水凝膠分別被保存在4 ℃和25 ℃的密封環(huán)境中保存28 d以考察其穩(wěn)定性。如表1所示，與新鮮制備的PSPA水凝膠相比，該條件下保存的水凝膠經(jīng)過TMA蒸氣處理的顏色響應(yīng)沒有改變，表明PSPA水凝膠的胺響應(yīng)能力至少可以穩(wěn)定有效地保持一個(gè)月。PSPA水凝膠較強(qiáng)的穩(wěn)定性，為開發(fā)商業(yè)化水產(chǎn)品新鮮度指示標(biāo)簽提供基礎(chǔ)。

6 PSPA水凝膠對不同揮發(fā)性胺的響應(yīng)

魚蝦腐敗過程會(huì)產(chǎn)生多種不同種類的生物胺，因此還需要進(jìn)一步考察PSPA水凝膠對其他揮發(fā)性胺的響應(yīng)。選取TMA、DMA、TPA、HTA、TRA、β-PA、ELA 7 種代表性的生物胺為檢測對象，評價(jià)結(jié)果如圖6所示。插圖的顏色變化和G/R信號表明PSPA水凝膠對不同種類的生物胺均有不同程度的響應(yīng)。表明制備的功能水凝膠可以應(yīng)用于實(shí)際樣品新鮮度的監(jiān)測。

7 PSPA水凝膠監(jiān)測魚/蝦新鮮度

以鳙魚和大明蝦為實(shí)際樣品，觀察PSPA水凝膠在不同貯藏溫度下監(jiān)測樣品新鮮度的實(shí)際應(yīng)用性。如圖7所示，PSPA水凝膠放置在裝有樣品的透明塑料盒中且與樣品不接觸。PSPA水凝膠的顏色變化與所監(jiān)測樣品的貯藏溫度和時(shí)間相關(guān)。如圖8A、B所示，PSPA水凝膠與20 g魚/蝦樣品分別被放置在37、25、4 ℃條件下持續(xù)數(shù)小時(shí)或數(shù)天，水凝膠呈現(xiàn)出紅色、淡紫色、藍(lán)綠色、黃綠色等系列顏色變化，相比于鳙魚（圖8A），PSPA水凝膠對于大明蝦（圖8B）的監(jiān)測所呈現(xiàn)出來的顏色變化更加豐富，這可能是由于樣品之間的差異性所致。與此同時(shí)，可以清晰地觀察到，4 ℃條件下PSPA水凝膠對于魚/蝦樣品的監(jiān)測所展示出的顏色轉(zhuǎn)變更加豐富，說明該功能水凝膠更加適用于冷藏樣品的監(jiān)測。不同溫度下監(jiān)測鳙魚新鮮度的PSPA水凝膠的G/R值變化曲線（圖8C～E）表明，37 ℃貯藏6 h、25 ℃貯藏12 h、4 ℃貯藏3 d后G/R值急劇增加，水凝膠相對應(yīng)的顏色轉(zhuǎn)變趨勢在圖8A可以被觀察到。監(jiān)測大明蝦的G/R值（圖8F～H）表明，37 ℃貯藏3 h、25 ℃貯藏6 h、4 ℃貯藏2 d后G/R值急劇增加，這種加劇的趨勢可以在圖8B中體現(xiàn)。與此同時(shí)，對照實(shí)驗(yàn)（0 g樣品，黑色曲線）在持續(xù)監(jiān)測過程中的響應(yīng)信號幾乎不發(fā)生變化。以上結(jié)果表明，PSPA水凝膠能夠很好地應(yīng)用于不同溫度下貯藏魚/蝦樣品新鮮度的監(jiān)測，且對4 ℃貯存樣品的監(jiān)測呈現(xiàn)的顏色變化更加豐富多元，為冷藏水產(chǎn)品的鮮度監(jiān)測開辟了新的路徑。

8 與傳統(tǒng)檢測魚/蝦新鮮度的方法對比

為了驗(yàn)證PSPA水凝膠監(jiān)測魚/蝦樣品新鮮度的方法的準(zhǔn)確性，采用GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中自動(dòng)凱氏定氮儀法對20 g樣品在37 ℃連續(xù)10 h產(chǎn)生的TVB-N含量進(jìn)行測定，并將結(jié)果與PSPA水凝膠監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行對比。如圖9A、C所示，魚（蝦）樣品的TVB-N含量在貯藏前4 h（5 h）均低于15 mg/100 g，說明此時(shí)樣品新鮮可食用。魚肉樣品貯藏7 h后TVB-N含量達(dá)到21.09 mg/100 g，蝦在37 ℃貯藏5 h后TVB-N含量20.13 mg/100g，超過了GB 2733—2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》中所限定的推薦食用閾值（20 mg/100 g），說明此溫度下貯藏超過7 h的鳙魚和5 h的大明蝦不推薦食用。從圖9B、D可以看出，使用基于PSPA水凝膠的RGB法檢測魚（蝦）新鮮度的G/R值與傳統(tǒng)TVB-N法的結(jié)果線性擬合得到Pearson系數(shù)為0.998 4（0.996 6），說明本實(shí)驗(yàn)提出方法與TVB-N法檢測結(jié)果存在明顯相關(guān)性，且可以替代TVB-N法監(jiān)測樣品新鮮度。同時(shí)，根據(jù)圖9B線性方程y=0.027 9x＋0.503 0，計(jì)算得到TVB-N含量為20 mg/100 g時(shí)，G/R值為1.061，該值可以用于判定鳙魚樣品不可被食用。同樣的，根據(jù)圖9D中y=0.012 24x＋0.622 4計(jì)算得到，當(dāng)G/R值為0.867 2，大明蝦樣品也不可再食用。以上結(jié)果說明，基于PSPA水凝膠的RGB法能夠在不破壞樣品的條件下有效監(jiān)測魚/蝦樣品新鮮度，并識(shí)別樣品可否食用，同時(shí)不需要大型精密儀器，具有簡單、便攜、無損的應(yīng)用優(yōu)勢。

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)開發(fā)了一種基于生物胺響應(yīng)的PSPA水凝膠，并結(jié)合RGB顏色分析方法監(jiān)測魚/蝦新鮮度。該功能性水凝膠能很好地響應(yīng)食品腐敗指示物（TMA）和魚、蝦樣品的新鮮度，其對TMA的檢出限為0.84×10-9 mol/L。與傳統(tǒng)檢測魚、蝦新鮮度的TVB-N法相比，其Pearson系數(shù)分別達(dá)到0.998 4、0.996 6，驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性。此外，PSPA水凝膠適用于監(jiān)測不同溫度下貯藏魚、蝦的新鮮度，且對4 ℃樣品的監(jiān)測表現(xiàn)出更加豐富的顏色轉(zhuǎn)變。功能水凝膠、便攜式手機(jī)和RGB分析法的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了可視化、數(shù)字化監(jiān)測魚、蝦新鮮度。該方法成本低、檢測速度快、便攜，能滿足現(xiàn)場即時(shí)檢測的需求，其以監(jiān)測揮發(fā)性胺類化合物為特點(diǎn)，普適性強(qiáng)，具有廣闊的商業(yè)應(yīng)用前景。