鯽Kaiso基因cDNA的克隆和表達(dá)分析

鯽Kaiso基因cDNA的克隆和表達(dá)分析

陳海炎 黃萬旭 羅 琛

(浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058)

在爪蟾和斑馬魚中, Kaiso是一種在整個基因組范圍內(nèi)與甲基化CpG序列特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄抑制因子,在調(diào)控被甲基化基因表達(dá)的時間模式中起重要的作用。為深入研究DNA甲基化對我國重要養(yǎng)殖魚類生殖和發(fā)育的影響, 我們克隆了鯽Kaiso基因的cDNA序列, 并對其時空表達(dá)模式進(jìn)行了分析。該cDNA全長3145 bp, 5′-非翻譯區(qū)132 bp, 3′-非翻譯區(qū)1117 bp, 開放閱讀框1896 bp, 編碼631個氨基酸。鯽Kaiso蛋白與其他物種Kaiso蛋白的同源性分析表明, 與其他物種一樣, 其 N端和C端分別有高保守性的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域。整胚原位雜交結(jié)果顯示, Kaiso mRNA在早期胚胎發(fā)育的各個時期均廣泛表達(dá), 信號均一, 但從尾芽期開始出現(xiàn)組織特異性表達(dá)差異。對不同發(fā)育階段胚胎的實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果表明: 卵子中有高豐度的母源Kaiso mRNA存在; 在卵裂期至囊胚中期胚胎中Kaiso mRNA的豐度逐漸降低; 從囊胚中期至原腸早期都維持在最低水平狀態(tài); 原腸后期其表達(dá)水平又逐漸升高, 至尾芽期達(dá)到與未受精卵中相當(dāng)?shù)母咚胶笤谄鞴侔l(fā)生期的整體水平又稍有下降。Kaiso mRNA豐度在胚胎發(fā)育早期的這種變化過程提示在卵裂期檢測到的mRNA可能都是母源mRNA, 合子核Kaiso基因可能是在囊胚晚期后才開始轉(zhuǎn)錄。對成體不同組織的實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果表明Kaiso的表達(dá)存在明顯的組織特異性差異, 在鯽肌肉、視網(wǎng)膜、心臟和腦中表達(dá)水平較高, 而在腎、胰、肝等器官中表達(dá)水平很低。Kaiso表達(dá)的時間和組織特異性提示其作為甲基化基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子參與了胚胎和成體基因表達(dá)時空模式的調(diào)控。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究Kaiso和DNA甲基化修飾在鯽發(fā)育調(diào)控和遺傳育種中的作用提供了基礎(chǔ)資料。

鯽; Kaiso; 基因克隆; 表達(dá)時空模式

在脊椎動物中, DNA甲基化修飾與細(xì)胞的分化和發(fā)育[1,2], 基因的表達(dá)調(diào)節(jié)[3], 親本印記[4], 染色質(zhì)的穩(wěn)定和X染色體失活[5]都有關(guān), 并在沉默內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒, 免疫系統(tǒng)發(fā)育調(diào)節(jié)[6]和抑制同源重組[7]中發(fā)揮重要作用。通常認(rèn)為, DNA甲基化是通過與甲基化的CpG二核苷酸特異結(jié)合蛋白的結(jié)合使特定位點(diǎn)染色質(zhì)失活, 而抑制被甲基化基因的轉(zhuǎn)錄[8—10], 目前發(fā)現(xiàn)的這類蛋白主要有MeCP2、MBD1、MBD2、MBD4及Kaiso[11]。

Kaiso是BTB/POZ鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族的一員[12]。Kaiso最先是通過酵母雙雜交實(shí)驗, 用一種粘連蛋白p120-catenin作為誘餌將其篩選到的[13]。 Ruzov, et al.的研究證明了Kaiso是一種在整個基因組范圍內(nèi)與甲基化CpG序列特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄抑制因子[14]。在爪蟾(Xenopus laevis)和斑馬魚(Danio rerio)中, Kaiso蛋白功能的缺失, 可以導(dǎo)致一些合子基因在囊胚中期轉(zhuǎn)換之前提前表達(dá), 出現(xiàn)部分細(xì)胞凋亡, 胚孔關(guān)閉延遲, 腦室和背軸結(jié)構(gòu)發(fā)育嚴(yán)重畸形[14,15]。最近的研究證明魚類Kaiso蛋白是抑制甲基化的母源no tail基因拷貝表達(dá)所必需的[16], 在維持雙親特異性甲基化基因的不對稱表達(dá)中起重要作用。這些研究結(jié)果說明在魚類和兩棲類動物中, Kaiso在胚胎發(fā)育早期抑制被甲基化基因的表達(dá)和保障胚胎按正確的時空模式發(fā)育起重要的作用。

鯽(Carassius auratus)是我國廣泛養(yǎng)殖的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚類和觀賞魚類, 并具有多種不同倍性和生殖方式的亞種, 是研究魚類生殖控制和基因組進(jìn)化的獨(dú)特材料[17,18]。為開展DNA甲基化對重要養(yǎng)殖魚類生殖、生長發(fā)育的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制的研究,我們克隆了兩性生殖鯽的Kaiso全長cDNA序列,并通過整胚原位雜交和實(shí)時定量PCR方法對其表達(dá)的時空模式進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

本實(shí)驗所用鯽為兩性生殖的二倍體鯽 (Carassius auratus)。雌、雄鯽均于繁殖季節(jié)購自杭州市魚類養(yǎng)殖場。雌、雄親本在本實(shí)驗室水族箱中分別養(yǎng)殖。交配前10h將雌、雄鯽魚注射HCG(絨促性素, Human chorionic gonadotrophin, HCG; 寧波第二激素廠)進(jìn)行人工催產(chǎn)后放入同一水族箱中。激素劑量為雌魚每1 kg體重2000單位, 雄魚劑量減半。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵后擠取精子和卵子進(jìn)行人工授精。胚胎置于(22±1)℃的環(huán)境發(fā)育。選取不同時期胚胎進(jìn)行實(shí)驗。肌肉、大腦、心臟、腎臟、胰臟、視網(wǎng)膜、肝臟等各成體組織均直接取自活體鯽魚。

1.2 總RNA的抽提和cDNA第一鏈的獲得

使用總RNA抽提試劑盒RNAgents Total RNA Isolation System (Promega)提取鯽胚胎不同發(fā)育時期及各成體組織的總RNA。抽提后的總RNA溶于無核酸酶水中置于?80℃冰箱中備用。以提取的總RNA為模板, 使用ClonTech公司的SMARTer?RACE cDNA Amplification的試劑盒分別合成5′RACE和3′RACE相應(yīng)的cDNA文庫。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 鯽全長Kaiso mRNA的克隆

使用ClonTech公司的SMARTer? RACE cDNA Amplification試劑盒。該試劑盒通過提供特定接頭,無需進(jìn)行傳統(tǒng)的“去帽子”反應(yīng), 結(jié)合所設(shè)計的RACE特異性引物, 可以方便地對已知序列的5′端和3′端進(jìn)行擴(kuò)增。

通過比對已知的斑馬魚和爪蟾Kaiso基因序列,得到其相對保守的序列, 然后根據(jù)保守區(qū)域的序列設(shè)計并在上海生工合成了擴(kuò)增鯽5′末端的一對引物: GK-5′-GSP: 5′CTTGTTGCAGTAATGGCACGGA3′(位置見圖1)。依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行5′RACE擴(kuò)增, 擴(kuò)增得到的序列送去上海生工測序, 測序后的結(jié)果經(jīng)NCBI中的BLAST功能分析, 證明其為斑馬魚和爪蟾Kaiso的同源片段, 因此可確定此片段為鯽Kaiso mRNA 5′末端的序列。據(jù)5′RACE得到的序列, 設(shè)計并在上海生工合成了3′RACE特異性引物: GK-3′-GSP: 5′AGCAGTAACGGACCAACCAACG3′(位置見圖1)。依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增, 擴(kuò)增得到的序列送去上海生工測序。 序列分析確定其為斑馬魚和爪蟾Kaiso3′端的同源片段后, 對所得的Kaiso mRNA的5′和3′片段進(jìn)行拼接得到完整的金魚Kaiso mRNA序列(圖1)。

1.4 整胚原位雜交

根據(jù)1.3中所得到的鯽Kaiso mRNA序列, 設(shè)計并在上海生工合成了擴(kuò)增鯽Kaiso 原位雜交探針的引物: Kaiso (+): 5′GCCATCGATATGTCGAAACTA AAGCTAATATCTGC3′; Kaiso (-): 5′ACCGAATTCT CAGTACGTCTCTGGTATAACAAAC3′。將擴(kuò)出的序列克隆至pCS107 vector中, 用ClaI(Takara)酶切處理, 使重組質(zhì)粒線性化, 以它為模板, 用T7 RNA聚合酶(Roche)和含有地高辛標(biāo)記UTP的NTP(Promega)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到鯽Kaiso的反義RNA探針。整胚原位雜交的胚胎的固定和預(yù)處理、復(fù)水和探針的雜交、非特異性探針的洗脫、抗體的孵育以及顯色等步驟和方法均按文獻(xiàn)[19]所述進(jìn)行。

1.5 熒光實(shí)時定量PCR

圖1 克隆全長鯽Kaiso mRNA引物的位置示意圖(GSP: 特異性引物; UPM: 通用引物)Fig. 1 Primer positions for cloning the full length of Kaiso mRNA (GSP: Gene-Specific Primer; UPM: Universal Primer A Mix)

運(yùn)用熒光實(shí)時定量PCR的方法檢測鯽胚胎發(fā)育不同時期及成體各組織中的轉(zhuǎn)錄水平。據(jù)1.3中克隆到的鯽Kaiso mRNA序列, 設(shè)計并在上海生工合成了實(shí)時定量PCR引物:GKaiso-RT(+): 5′TCAGGC TTTGGGAGTGACATT3′和GKaiso-RT(-): 5′CTTTG GAAAGGCCCGGTAAT3′。據(jù)鯽β-actin基因cDNA序列(GenBank 序列號: AB039726)設(shè)計并在上海生工合成了作為內(nèi)參的實(shí)時定量引物: β-actin (+): 5′TCCCTTGCTCCTTCCACCA3′; β-actin (-): 5′GGAA GGGCCAGACTCATCGTA3′。用1.2中提取的總RNA為模板, 使用PrimeScript RT reagent Kit (Takara)合成mRNA第一條鏈, 具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行, 在此過程中使用無RNA酶的DNA酶消化可能存在于總RNA中的DNA干擾。實(shí)時定量PCR反應(yīng)的體系為: 0.2 μL 2 mmol/μL的引物、1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、2.5 μL 2×SYBR Premix ExTaq(Takara)、1.1 μL滅菌水。反應(yīng)條件為: 95℃, 10s; 95℃, 5s, 60℃, 20s, 40個循環(huán)。實(shí)時定量RT-PCR的反應(yīng)及信息收集均在LightCycler 480 System(Roche)上進(jìn)行。程序運(yùn)行完成后進(jìn)行溶解曲線分析以確定PCR產(chǎn)物是否專一,對每一樣品分析重復(fù)三次以保證結(jié)果的可靠性。并使用β-actin作內(nèi)參對照, 保證所有樣品中RNA的量一致。目標(biāo)基因的相對表達(dá)量按Livak和Schmittgen的方法計算[20]。據(jù)擴(kuò)增曲線得到的Ct值(熒光信號達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))計算出目標(biāo)基因Kaiso和對照基因β-actin Ct值的差異ΔCt; 然后以差異最大的樣本作為參照樣本, 計算出不同樣品相對于參照樣本基因的表達(dá)倍數(shù)2?ΔΔCt, 進(jìn)而制作出相對定量圖表。

2 結(jié)果

2.1 鯽Kaiso mRNA的克隆及序列分析

使用5′RACE和3′RACE技術(shù), 得到鯽Kaiso全長mRNA的序列。鯽Kaiso mRNA全長序列的長度為3145 bp, 其中5′非編碼區(qū)(5′-UTR)132 bp, 3′非編碼區(qū)(3′-UTR)1117 bp, 開放閱讀框(ORF)1896 bp, 編碼631個氨基酸。序列已提交至GenBank (序列號: HM045515.1)。

2.2 鯽Kaiso蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測及進(jìn)化關(guān)系分析

使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Find Conserved Domains 功能, 并據(jù)推測的鯽Kaiso蛋白氨基酸序列(圖2a), 將這一推測的氨基酸序列與斑馬魚、爪蟾、雞(Gallus gallus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的Kaiso蛋白氨基酸序列進(jìn)行相似性比較, 參照它們的蛋白結(jié)構(gòu), 預(yù)測得鯽Kaiso的蛋白結(jié)構(gòu)(圖2b)。鯽Kaiso蛋白也包括N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C端的三個鋅指結(jié)構(gòu)域(ZF1、ZF2、ZF3)(圖2b)。

圖2 推譯的鯽Kaiso蛋白質(zhì)氨基酸序列及結(jié)構(gòu)域示意圖Fig. 2 The putative amino acid sequence and the diagram of the putative conserved domains of Carassius auratus Kaiso protein

使用Jellyfish軟件和NCBI (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/)中的BLAST, 將推譯出的鯽Kaiso蛋白氨基酸序列與其他物種Kaiso蛋白氨基酸序列進(jìn)行了同源性分析。結(jié)果表明鯽與斑馬魚、爪蟾、雞、小鼠、人Kaiso蛋白氨基酸序列相似性分別為77%、41%、41%、42%、40.5% , 但它們N端BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C端前兩個鋅指結(jié)構(gòu)域(ZF1、ZF2)的相似性程度很高(表1)。據(jù)這幾個物種的氨基酸序列, 用MEGA5.05軟件Phylogeny程序中的Construct/Test Neighbor Joining Tree (s)方式構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3), 表明鯽首先與斑馬魚類聚, 再與爪蟾類聚, 再與雞類聚, 最后與小鼠、人類聚。

表1 鯽與其他幾種脊椎動物Kaiso蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域(BTB/POZ、ZF1、ZF2、ZF3)氨基酸序列的同源性比較Tab. 1 Percent identity of amino acid sequence of Kaiso conserved domains (BTB/POZ, ZF1, ZF2 and ZF3) between goldfish and several other vertebrates

2.3 鯽Kaiso在胚胎發(fā)育過程中的時空表達(dá)模式和表達(dá)水平差異

為研究Kaiso在鯽早期胚胎發(fā)育過程中的時空表達(dá)模式, 以體外轉(zhuǎn)錄并用地高辛標(biāo)記的Kaiso RNA 片段為探針, 對鯽不同發(fā)育時期的胚胎進(jìn)行了整胚原位雜交實(shí)驗。鯽不同時期胚胎原位雜交實(shí)驗表明: Kaiso在早期胚胎發(fā)育階段廣泛表達(dá), 信號均一, 但從尾芽期開始在胚胎前端的頭部區(qū)域信號比胚胎后端區(qū)域顯著增強(qiáng)(圖4)。用實(shí)時定量PCR方法對未受精卵, 及不同發(fā)育時期胚胎進(jìn)行Kaiso mRNA表達(dá)水平的相對定量分析結(jié)果顯示, 卵子中存在高豐度的母源Kaiso mRNA, 在卵裂期及囊胚中期胚胎細(xì)胞中Kaiso mRNA的豐度逐漸降低, 從囊胚中期至原腸早期都維持在最低水平狀態(tài), 原腸后期其表達(dá)水平又逐漸升高, 至尾芽期達(dá)到與未受精卵中相當(dāng)?shù)母咚? 在器官發(fā)生期的整體水平又稍有下降但維持在較高水平(圖5a)。

圖3 根據(jù)鯽、斑馬魚、爪蟾、雞、小鼠、人的Kaiso蛋白質(zhì)氨基酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Kaiso amino acid sequences

2.4 鯽Kaiso在不同成體組織的表達(dá)分析

圖4 鯽早期胚胎不同發(fā)育時期Kaiso的原位雜交圖Fig. 4 In situ hybridization of Carassius auratus embryos

對成體不同組織的實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果表明Kaiso在鯽肌肉、腦、心臟、腎臟、胰臟、視網(wǎng)膜、肝臟等成體組織中均有表達(dá), 但在鯽成體不同組織中的表達(dá)水平存在明顯差異。在肌肉、視網(wǎng)膜、心臟和腦中表達(dá)水平較高, 而在腎、胰、肝等器官中表達(dá)水平較低(圖5b)。

3 討論

3.1 鯽Kaiso蛋白的結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)氨基酸序列的保守性分析表明, 鯽Kaiso蛋白和其他已知的幾種脊椎動物Kaiso蛋白一樣, 在N端有保守的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域, C端有3個鋅指結(jié)構(gòu)域。對不同物種Kaiso蛋白的比較分析表明, 從哺乳類、鳥類、兩棲類到最低等的脊椎動物魚類, 其 N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C端的前兩個鋅指結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是高度保守的, C端最后一個鋅指結(jié)構(gòu)域則變異比較大(表1)。功能分析表明, Kaiso蛋白是通過其N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域自二聚化[13], 或與其他蛋白如ZNF131發(fā)生異二聚化[21]而行使阻抑轉(zhuǎn)錄的作用。Kaiso與DNA的結(jié)合則主要通過其C端的鋅指結(jié)構(gòu)域, 但其第三個變異較大的鋅指結(jié)構(gòu)域并不是與甲基化的DNA結(jié)合所必需的, 其前兩個鋅指結(jié)構(gòu)域就能充分介導(dǎo)與甲基化DNA的特異結(jié)合[15]。Kaiso N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C端前兩個鋅指結(jié)構(gòu)域的高度保守性提示Kaiso蛋白與甲基化DNA特異結(jié)合后, 形成同二聚或者異二聚轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體而抑制甲基化基因轉(zhuǎn)錄的特性對物種的生存至關(guān)重要。

3.2 鯽Kaiso表達(dá)的時空模式與發(fā)育調(diào)控的關(guān)系

在兩棲類和魚類中, Kaiso是一種與DNA上甲基化的CpG二核苷酸特異結(jié)合從而抑制被甲基化基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄抑制因子, 在抑制這些合子基因在胚胎囊胚中期轉(zhuǎn)換之前表達(dá)中起關(guān)鍵作用, 而其與非甲基化DNA結(jié)合的功能不是魚類和兩棲類胚胎早期發(fā)育所需要的[14,15]。我們的實(shí)驗結(jié)果表明鯽卵子中儲存有大量母源Kaiso mRNA, 從卵裂期到囊胚中期其豐度逐漸下降, 從囊胚中期至原腸期維持在最低水平, 從原腸后期又開始升高, 至尾芽期達(dá)到最高水平。Kaiso mRNA豐度的在胚胎發(fā)育早期的這種變化過程提示在卵裂期檢測到的mRNA可能都是母源mRNA, 合子核Kaiso基因可能是在囊胚晚期后才開始轉(zhuǎn)錄。

已有的研究證明在魚類胚胎的早期發(fā)育過程中存在基因組DNA的去甲基化和再甲基化的重編程過程[22,33]。這一過程導(dǎo)致胚胎基因組DNA的甲基化水平在卵裂早期高, 去甲基化后水平降低, 再甲基化后水平又升高的變化過程。Kaiso mRNA表達(dá)水平變化也與斑馬魚中基因組DNA去甲基化和再甲基化的重編程所導(dǎo)致的基因組甲基化水平的變化一致, 但與參與甲基化重編程的鯽甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt1的情況正好相反[24]。這一結(jié)果提示Kaiso在鯽的整個胚胎發(fā)育過程中可能具有廣泛的抑制甲基化基因表達(dá)的功能, 是調(diào)控這些基因按正確的時間模式表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子之一。

原位雜交結(jié)果顯示, 在鯽胚胎發(fā)育的過程中, Kaiso在胚胎早期發(fā)育的各個時期均廣泛表達(dá), 且信號均一, 但從尾芽期開始在頭部區(qū)域的表達(dá)顯著強(qiáng)于在后端區(qū)域的表達(dá)。這些結(jié)果說明在器官發(fā)生階段Kaiso的表達(dá)出現(xiàn)了組織特異性。成體不同組織中Kaiso的表達(dá)水平的實(shí)時定量PCR分析進(jìn)一步證明了這種Kaiso表達(dá)的組織特異性: 在細(xì)胞分裂增殖活動較弱的肌肉、視網(wǎng)膜、心臟和腦等組織中的表達(dá)水平較高, 而在細(xì)胞分裂增殖旺盛的腎、胰、肝等器官中表達(dá)水平較低。鯽Kaiso基因的這種組織特異性表達(dá)式樣提示其作為甲基化基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子, 通過調(diào)控這些基因按正確的空間模式表達(dá)而參與了不同組織和器官功能的調(diào)控。

圖5 鯽Kaiso基因的實(shí)時定量PCRFig. 5 Real-Time PCR detection of Carassius auratus Kaiso gene

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