論文：紅鰭東方鲀性腺發(fā)育的組織學(xué)研究

         紅鰭東方鲀性腺發(fā)育的組織學(xué)研究

李偉緣，熊玉宇，王子維，張 琦，姜潔明，閆紅偉，劉 鷹,3，劉 奇，李美沅，王秀利

( 1.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237 )

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)屬硬骨魚綱鲀形目鲀科東方鲀屬[1]，俗稱河鲀，是東方鲀屬魚類中體型最大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的商業(yè)品種，肉質(zhì)細(xì)致、味道鮮美，素有“魚中之王”的美稱[2-3]。野生群體在中國(guó)、日本、韓國(guó)沿海均有分布[4]，在中國(guó)主要分布于黃海、渤海和東海[5]。我國(guó)紅鰭東方鲀養(yǎng)殖采用陸海接力的養(yǎng)殖模式[6-7]，苗種供應(yīng)完全依靠人工促熟與繁育，每年我國(guó)的養(yǎng)殖產(chǎn)量約4000 t[8]。人工養(yǎng)殖條件下，雄魚可以2～3齡性成熟，雌魚一般晚于雄魚，約3齡性成熟。紅鰭東方鲀?yōu)榇菩郛愺w魚類，在繁殖季節(jié)，性腺幾乎充滿整個(gè)體腔，其質(zhì)量可達(dá)體質(zhì)量的20%～30%，雌魚、雄魚的市場(chǎng)價(jià)值差異較大[9]，精巢的市場(chǎng)價(jià)格甚至高于魚肉制品的價(jià)格。

魚類生殖系統(tǒng)由性腺(精巢和卵巢)及生殖導(dǎo)管組成，是繁殖活動(dòng)進(jìn)行的基礎(chǔ)，對(duì)維持種群的延續(xù)至關(guān)重要。研究魚類性腺發(fā)育的方法包括形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)等方法。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于紅鰭東方鲀的研究主要集中在人工養(yǎng)殖技術(shù)、保鮮儲(chǔ)藏及生理生態(tài)方面[10-12]，對(duì)其繁殖生物學(xué)的研究還不全面[13-16]，對(duì)人工養(yǎng)殖條件下紅鰭東方鲀性腺發(fā)育過程與繁殖規(guī)律的研究在國(guó)內(nèi)外均未見系統(tǒng)報(bào)道。盡管對(duì)硬骨魚類性腺發(fā)育分期的研究較多[17-22]，但至今仍未有統(tǒng)一的分期標(biāo)準(zhǔn)。1965年，李有廣等[23]根據(jù)各時(shí)相卵母細(xì)胞的數(shù)量及其所占比例及各時(shí)相卵母細(xì)胞體積比例將卵巢發(fā)育過程分成6個(gè)階段；1993年，劉筠[24]提出,可以根據(jù)生理學(xué)、組織學(xué)和形態(tài)學(xué)特征對(duì)卵巢發(fā)育過程進(jìn)行劃分。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者除借鑒以上觀點(diǎn)外，結(jié)合目標(biāo)魚種的真實(shí)情況，將發(fā)育過程劃分為與卵母細(xì)胞時(shí)相對(duì)應(yīng)的6個(gè)時(shí)期，而在精巢發(fā)育階段劃分中，不同魚種略有差別[24]。藍(lán)軍南[25]將四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)的精巢發(fā)育及精子發(fā)生分為6個(gè)時(shí)期：精原細(xì)胞增殖期、精母細(xì)胞增長(zhǎng)期、精母細(xì)胞成熟期、精子開始出現(xiàn)期、精子完全成熟期和精子退化吸收期。李忠利等[19]也將錦江翹嘴鲌(Culteralburnus)精巢發(fā)育分為6個(gè)時(shí)期：精原細(xì)胞增殖前期、精原細(xì)胞增殖期、精母細(xì)胞生長(zhǎng)成熟期、精子開始出現(xiàn)期、精子成熟期和退化期；而Akayli等[26]將長(zhǎng)鰭金槍魚(Thunnusalalunga)精巢發(fā)育過程分為5個(gè)時(shí)期：未成熟期、發(fā)育期、成熟期、排放期和衰退期。近年來，伴隨著紅鰭東方鲀養(yǎng)殖產(chǎn)量的逐漸提高，針對(duì)不同的市場(chǎng)需求，如能在透徹了解其生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與性腺發(fā)育規(guī)律的基礎(chǔ)上，對(duì)其繁殖過程進(jìn)行人工調(diào)控，能節(jié)約生產(chǎn)成本，帶來顯著經(jīng)濟(jì)效益[27-28]，也可為其他東方鲀屬魚類繁殖生物學(xué)研究及工廠化養(yǎng)殖提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚2019年6月至2021年4月間采自大連某河鲀養(yǎng)殖基地。共采集試驗(yàn)魚212尾，其中80日齡樣本60尾、7月齡樣本50尾、18月齡樣本40尾、30月齡樣本20尾、33月齡樣本22尾、36月齡樣本10尾和48月齡樣本10尾。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)量特征測(cè)量

測(cè)定所采集的紅鰭東方鲀體質(zhì)量、全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、性腺質(zhì)量以及肝臟質(zhì)量。

1.2.2 性腺發(fā)育指數(shù)計(jì)算

與性腺發(fā)育相關(guān)的指數(shù)包括性腺指數(shù)(wGSI)、肝體指數(shù)(wHSI)和肥滿度(CF)，按下式計(jì)算：

wGSI=mG/m×100%

wHSI=mL/m×100%

CF=100m/L3

式中，mG為性腺質(zhì)量(g)，m為體質(zhì)量(g)，mL為肝質(zhì)量(g)，L為體長(zhǎng)(cm)。

1.2.3 組織切片制備及性腺分期

解剖試驗(yàn)魚，取精巢、卵巢，固定于4%多聚甲醛通用型組織固定液中,4 ℃冰箱保存24 h后，轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中保存?zhèn)溆谩＠米詣?dòng)脫水機(jī)(Diapath Donatello，意大利)脫水、二甲苯透明和石蠟包埋。使用切片機(jī)(Leica RM2016，中國(guó))切片，厚度為5～7 μm，采用蘇木精—伊紅染色，中性樹膠封片保存，于顯微鏡(Carl Zeiss，德國(guó))下觀察性腺發(fā)育狀況并拍照。性腺分期結(jié)合紅鰭東方鲀的性腺顏色、形態(tài)及組織切片情況進(jìn)行劃分。

1.2.4 基于分子標(biāo)記的性別鑒定

紅鰭東方鲀性別鑒定參考文獻(xiàn)[13]的方法，利用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp，中國(guó))提取魚鰭樣本中基因組DNA，1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的完整性。利用amhr2基因外顯子9的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)作為性別鑒定的分子標(biāo)記，PCR引物使用SDexonF(5′-CAGATGC ACACAAACCACCT-3′)和SDexonR(5′-TCCCAG TGTTGCGGTATGTA-3′)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后通過測(cè)序鑒定性別。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；相同性別間的指標(biāo)采用單因素方差分析數(shù)值的差異性，然后使用鄧肯多重比較檢驗(yàn)均值；雌、雄魚之間的差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 采集的紅鰭東方鲀樣本的體長(zhǎng)及體質(zhì)量

本試驗(yàn)采集的紅鰭東方鲀共涵蓋7個(gè)不同年齡組(表1)。孵化后80日齡～30月齡，魚體生長(zhǎng)迅速(P<0.05)；30～36月齡，增速緩慢(P>0.05)。不同年齡組體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)。雌、雄魚間平均體長(zhǎng)，除48月齡外，均無顯著差異(P>0.05)；在48月齡時(shí)，樣本組中雄魚平均體長(zhǎng)顯著大于雌魚(P<0.05)。雌、雄魚間平均體質(zhì)量，除30月齡外，均無顯著差異(P>0.05)；在30月齡時(shí)，所采集的樣本組中雌魚的平均體質(zhì)量顯著大于雄魚(P<0.05)(表1)。

表1 不同發(fā)育階段紅鰭東方鲀體長(zhǎng)、體質(zhì)量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.1 Body length and body weight of tiger puffer T. rubripes in different developmental stages (mean±SE)

2.2 性腺分布位置及形狀

紅鰭東方鲀?yōu)榇菩郛愺w，其性腺均成對(duì)出現(xiàn)，呈長(zhǎng)葉形(圖1)，左右成對(duì)排列。性腺位于魚體腔的腹中線，緊貼于腎臟腹面兩側(cè)的腹腔系膜上，性腺的形狀和位置與魚的體型有關(guān)。雌魚卵巢性成熟時(shí)呈黃色，血管密布；雄魚精巢左右分開，性成熟時(shí)呈灰白色；性腺由排泄孔與外界相通。

圖1 紅鰭東方鲀性腺組織示例Fig.1 Example of gonad of the tiger puffer T. rubripesa.卵巢；b.精巢.a.ovary;b.testis.

2.3 紅鰭東方鲀配子發(fā)生

2.3.1 卵子發(fā)生

在紅鰭東方鲀卵巢發(fā)育過程中，可以觀察到處于不同發(fā)育階段的卵細(xì)胞，即卵原細(xì)胞、初級(jí)卵母細(xì)胞、次級(jí)卵母細(xì)胞和成熟卵子。根據(jù)卵細(xì)胞的體積大小以及卵黃和濾泡發(fā)育等特征，可將卵細(xì)胞的發(fā)育分為Ⅵ個(gè)時(shí)相(圖2)。卵子發(fā)生過程中，卵巢內(nèi)含有不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞，且其一年內(nèi)只產(chǎn)卵一次，生殖季節(jié)集中，屬于部分同步型。

第Ⅰ時(shí)相：此階段，卵原細(xì)胞體積小，呈橢圓形，細(xì)胞核大。卵巢腔體四周出現(xiàn)初級(jí)卵母細(xì)胞，與卵原細(xì)胞相比，初級(jí)卵母細(xì)胞的體積較大，細(xì)胞質(zhì)占比增多，細(xì)胞核明顯。初級(jí)卵母細(xì)胞的出現(xiàn)是卵巢細(xì)胞分化的開始(圖2m)。

第Ⅱ時(shí)相：初級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)入小生長(zhǎng)期階段，細(xì)胞體積增大，呈卵圓形或多角形，細(xì)胞質(zhì)增加并呈強(qiáng)嗜堿性。細(xì)胞核體積變大，核膜內(nèi)壁分布多個(gè)核仁。濾泡細(xì)胞在卵母細(xì)胞外形成濾泡膜(圖2n)。

第Ⅲ時(shí)相：初級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)入大生長(zhǎng)期階段。在質(zhì)膜外側(cè)的濾泡膜，由單層轉(zhuǎn)化為雙層，在濾泡膜和卵細(xì)胞膜之間形成放射帶。隨著卵黃和脂肪的積累，卵母細(xì)胞體積明顯增大，在細(xì)胞質(zhì)外緣出現(xiàn)液泡，液泡不斷發(fā)育，數(shù)目增加，并逐漸向內(nèi)緣移位。卵黃沉積，在液泡間形成卵黃顆粒(圖2o)。

第Ⅳ時(shí)相：處于初級(jí)卵母細(xì)胞的發(fā)育晚期。細(xì)胞增大，核仁數(shù)量增多，卵黃積累，核外空間幾乎被卵黃充滿，細(xì)胞質(zhì)僅在核的周圍以及細(xì)胞膜邊緣存在。放射帶明顯增厚，濾泡膜和放射帶更加清晰(圖2p)。

第Ⅴ時(shí)相：卵細(xì)胞發(fā)育成熟。卵黃顆粒大多數(shù)呈橢圓形，散布于整個(gè)卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的邊緣仍有液泡。即將排卵，濾泡膜松馳，大部分與卵膜分離(圖2q)。

第Ⅵ時(shí)相：為未排出卵子，或逐漸退化并被重吸收的卵母細(xì)胞。細(xì)胞呈不規(guī)則狀，蜷曲于卵巢內(nèi)，細(xì)胞核消失，卵黃顆粒變?yōu)橐簯B(tài)，顏色昏暗，放射帶明顯增厚(圖2r)。

圖2 紅鰭東方鲀卵巢外觀形態(tài)、卵子發(fā)生過程及組織切片觀察Fig.2 Observation of the appearance,oogenesis and histological section of the ovaries of tiger puffer T. rubripesa～f是Ⅰ～Ⅵ期卵巢的外觀形態(tài)；g～l分別對(duì)應(yīng)Ⅰ～Ⅵ期卵巢的組織切片觀察結(jié)果；m～r分別對(duì)應(yīng)卵子發(fā)生的第Ⅰ～Ⅵ時(shí)相；O.卵巢；OG.卵原細(xì)胞；PO.初級(jí)卵母細(xì)胞；OC.卵巢腔；SP.產(chǎn)卵板；BV.血管；N.細(xì)胞核；NU.核仁；FT.濾泡膜；YG.卵黃顆粒；OD.油滴；CA.液泡；ZR.放射帶；EF.空濾泡.a—f show the appearance and morphology of the ovaries of stages Ⅰ—Ⅵ;.g—l correspond to the observation of histological sections of ovaries with stages Ⅰ—Ⅵ,respectively;m—r correspond to the phases Ⅰ—Ⅵ in oogenesis,respectively;O.ovary;OG.oogonium;PO.primary oocyte;OC.ovarian cavity;SP.oviposition plate;BV.blood vessel;N.nucleus;NU.nucleolus;FT.follicle theca;YG.yolk granules;OD.oil droplets;CA.cortical alveola;ZR.zona radiata;EF.empty follicle.

2.3.2 精子發(fā)生

紅鰭東方鲀精子發(fā)生(圖3)，包括精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和成熟精子。首先，為精原細(xì)胞增殖期，精原細(xì)胞數(shù)量增加(圖3m)；在后期開始分化的精原細(xì)胞變?yōu)槌跫?jí)精母細(xì)胞，初級(jí)精母細(xì)胞要比精原細(xì)胞小，染色比精原細(xì)胞深(圖3n)，初級(jí)精母細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)期，細(xì)胞變大；初級(jí)精母細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)積累，物質(zhì)積累完成后，轉(zhuǎn)化為次級(jí)精母細(xì)胞(圖3o)；次級(jí)精母細(xì)胞再經(jīng)過減數(shù)分裂形成精子細(xì)胞(圖3p)；精子細(xì)胞最終轉(zhuǎn)化為精子(圖3q～r)，即變態(tài)期，精子細(xì)胞的核、質(zhì)經(jīng)過分化和重組，產(chǎn)生成熟的精子。

2.4 紅鰭東方鲀卵巢形態(tài)特征和組織學(xué)分期

紅鰭東方鲀卵巢的外部形態(tài)特征以及內(nèi)部組織發(fā)育過程，會(huì)隨其年齡的增加、繁殖活動(dòng)的開始而產(chǎn)生相應(yīng)的變化。并且在卵巢發(fā)育過程中，通過組織切片技術(shù)，能夠觀察到處于不同發(fā)育階段的卵細(xì)胞。因此，以卵巢外部形態(tài)、顏色及性腺組織切片視野中占比大的卵母細(xì)胞類型為卵巢分期的劃分依據(jù)，可將紅鰭東方鲀的卵巢發(fā)育分為6個(gè)時(shí)期。

Ⅰ期：幼魚的卵巢，很小，緊貼腹腔系膜上，呈淡肉色，透明細(xì)線狀，外觀難辨雌雄(圖2a)。卵巢內(nèi)主要是卵原細(xì)胞，卵原細(xì)胞體積較小近似圓形或橢圓形，弱嗜堿性，出現(xiàn)卵巢腔以及產(chǎn)卵板，一生中只出現(xiàn)一次，持續(xù)時(shí)間短(圖2g)，如80日齡雌魚樣本組。

Ⅱ期：卵巢呈長(zhǎng)條形，淺肉紅色，已分化出雙葉狀結(jié)構(gòu)，肉眼可初步辨別雌、雄，變寬且長(zhǎng)度有所增加，表面被覆一層淡紅色膜，可見微細(xì)的血管(圖2b)。肉眼難以分辨卵粒，組織切片觀察，卵巢有明顯的卵巢腔，由卵巢表面向腔體內(nèi)部折疊形成產(chǎn)卵板，卵母細(xì)胞封閉在產(chǎn)卵板內(nèi)，緊密排列。卵巢中主要是處于生長(zhǎng)期的初級(jí)卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞形狀為不規(guī)則的圓形，外有分散的濾泡細(xì)胞連成的一層濾泡膜包被，內(nèi)部出現(xiàn)卵圓形的細(xì)胞核，核膜內(nèi)壁分布強(qiáng)嗜堿性核仁，卵巢中以第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，存在少量的第Ⅰ時(shí)相卵原細(xì)胞(圖2h)，如7、18月齡和部分30月齡雌魚樣本組。

Ⅲ期：卵巢呈肉色或淺紅色，表面密布血管，清晰可見。隨著發(fā)育，卵巢迅速生長(zhǎng)，體積明顯增大，變?yōu)檩^膨脹的囊狀，占據(jù)體腔大部分，透過卵巢壁肉眼可見均勻的卵粒，淡黃色顆粒飽滿，但不能分離(圖2c)。組織切片觀察，初級(jí)卵母細(xì)胞開始積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)入大生長(zhǎng)期，體積明顯增大，細(xì)胞基本呈圓形，大小不均，出現(xiàn)皮質(zhì)液泡和卵黃顆粒。位于核膜內(nèi)邊緣的核仁數(shù)量增多。油滴大小不一。晚期初級(jí)卵母細(xì)胞細(xì)胞膜與濾泡細(xì)胞之間出現(xiàn)放射帶，濾泡膜出現(xiàn)雙層結(jié)構(gòu)。卵巢內(nèi)第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞占大部分，存在少量的第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞(圖2i)，如部分30、33月齡雌魚樣本組。

Ⅳ期：卵巢接近成熟，體積繼續(xù)增大，中部膨脹，近乎充滿整個(gè)體腔。血管變粗，在卵巢膜上呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布，肉眼可見卵粒，卵粒互相黏連，為非游離狀態(tài)(圖2d)。卵母細(xì)胞體積顯著增大，基本完成了卵黃積累，沉積大量卵黃顆粒和油滴。卵巢內(nèi)大多數(shù)卵母細(xì)胞處于第Ⅳ時(shí)相，且存在第Ⅲ時(shí)相和第Ⅱ時(shí)相的一定數(shù)量卵母細(xì)胞(圖2g)，如部分33、36、48月齡雌魚樣本組。

Ⅴ期：魚腹表面可見隆起，卵巢體積達(dá)到最大，卵母細(xì)胞充分發(fā)育，卵子成熟，卵巢呈松軟狀，卵巢壁變薄，卵粒呈現(xiàn)離散狀態(tài)，透明。濾泡膜破裂，卵母細(xì)胞釋放到腹腔，輕壓魚腹，泄殖孔處有卵子流出(圖2e)。組織切片觀察，細(xì)胞質(zhì)中充滿卵黃球和大油滴。細(xì)胞核極化，由中央向動(dòng)物極偏移。濾泡細(xì)胞膜松弛，與卵母細(xì)胞膜分離。卵巢內(nèi)除了成熟的卵細(xì)胞外，還含有部分第Ⅳ時(shí)相、第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞(圖2k)，如部分48月齡雌魚樣本組。

Ⅵ期：卵巢退化，體積縮小，質(zhì)量減輕，表面密布血管，有充血現(xiàn)象，深紅色，松軟癟塌(圖2f)。留有未產(chǎn)出的成熟卵子和正在退化并被吸收的第Ⅲ、第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞，同時(shí)存在大量排卵后剩下的空濾泡。細(xì)胞形狀不規(guī)則，蜷曲于卵巢內(nèi)，其特征是核消失，卵黃液化，殘留的卵母細(xì)胞被溶解吸收。在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的過程中存在卵母細(xì)胞萎縮現(xiàn)象(圖2l)，如部分48月齡雌魚樣本組。

2.5 紅鰭東方鲀精巢形態(tài)特征和組織學(xué)分期

紅鰭東方鲀的精巢為小葉型精巢，結(jié)構(gòu)單位是精小葉，而精小葉由許多精小囊組成。在精巢內(nèi)，精原細(xì)胞首先發(fā)育成精母細(xì)胞，之后是精子細(xì)胞，最終成為成熟的精子，成熟精子只在小葉腔和輸出管內(nèi)存在。根據(jù)精巢的形態(tài)特征以及組織切片觀察結(jié)果，可將精巢發(fā)育過程分為6個(gè)時(shí)期。

Ⅰ期：僅見于幼魚早期發(fā)育精巢，性腺成對(duì)，可以看到左右兩葉，外觀為白色透明細(xì)線狀，緊貼腹腔內(nèi)壁的兩側(cè)(圖3a)。切片觀察可見，通常多個(gè)精原細(xì)胞包裹在一起，呈多角形或橢圓狀無規(guī)則分散，核大且染色較深(圖3g)，如80日齡雄魚樣本組。

Ⅱ期：此期的精巢呈細(xì)線狀，淡肉色，半透明狀態(tài)，表面可見少許淺色毛細(xì)血管，不明顯(圖3b)。切片觀察，精小葉長(zhǎng)條形，精小葉之間間隙明顯。開始形成精小囊，多個(gè)精小囊構(gòu)成一個(gè)精小葉。精原細(xì)胞分化，精小囊內(nèi)出現(xiàn)初級(jí)精母細(xì)胞。初級(jí)精母細(xì)胞體積比精原細(xì)胞小，染色比精原細(xì)胞深(圖3h)，如7月齡，部分18、30月齡雄魚樣本組。

Ⅲ期：雄魚精巢體積增大，呈棒狀，淺黃色(圖3c)。切片觀察，此期精小囊內(nèi)具有初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞和精原細(xì)胞，還可見少量的精子細(xì)胞。其中以初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞為主。次級(jí)精母細(xì)胞體積小于初級(jí)精母細(xì)胞，核的嗜堿性更強(qiáng)(圖3i)，如部分18、30、33月齡雄魚樣本組。

Ⅳ期：精巢進(jìn)一步發(fā)育，體積增大，占據(jù)體腔的大半，富有彈性。顏色偏白，略帶紅色，呈袋狀(圖3d)。切片觀察，精巢中主要包括次級(jí)精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子。這些精細(xì)胞包裹在精小囊中，同一個(gè)精小囊中生精細(xì)胞同步發(fā)育。精子細(xì)胞數(shù)量增多，部分精小囊破裂，成熟精子溢出到小葉腔中(圖3j)，如部分33月齡雄魚樣本組。

Ⅴ期：精巢體積最大，飽滿柔軟，內(nèi)部充滿精液，達(dá)到完全成熟，外觀呈乳白色，輕壓雄魚腹部精液很容易從泄殖孔流出(圖3e)。切片觀察，小葉腔中含大量的成熟精子。精小葉邊緣分布著少量精細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞(圖3k)。如部分33、36月齡雄魚樣本組。

Ⅵ期：排精一周左右的精巢，精巢較性成熟期體積和質(zhì)量大幅減小，松軟，血管不明顯，呈淺黃色(圖3f)。切片觀察精巢腔萎縮，內(nèi)部部分呈中空狀，僅剩結(jié)締組織、精原細(xì)胞和少量初級(jí)精母細(xì)胞，精小葉中尚存有未排出的精子(圖3l)，如48月齡雄魚樣本組。

2.6 紅鰭東方鲀性腺發(fā)育過程中相關(guān)指數(shù)的變化

紅鰭東方鲀性腺發(fā)育過程中性腺指數(shù)的變化見圖4。隨著紅鰭東方鲀性腺開始發(fā)育，精巢、卵巢增大，質(zhì)量增加，性腺指數(shù)從Ⅲ期開始升高，性腺在進(jìn)入發(fā)育期后發(fā)育加速，至成熟產(chǎn)卵期或排精期(Ⅴ期)時(shí)達(dá)到最大值。其中，雄魚精巢發(fā)育Ⅴ期的性腺指數(shù)為(18.79±0.69)%，雌魚卵巢發(fā)育Ⅴ期的性腺指數(shù)為(12.87±2.05)%，顯著高于其他時(shí)期的性腺指數(shù)(P<0.05)。

圖4 不同發(fā)育時(shí)期的性腺指數(shù)變化Fig.4 Changes in gonadosomatic index in different developmental stages數(shù)值均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同字母表示差異顯著(P<0.05)；*為雌、雄魚之間差異顯著(P <0.05)；下同.The values are all the mean±SE;means with different letters are significant differences (P<0.05).*,represent significant difference between female and male fish;et sequentia.

紅鰭東方鲀性腺發(fā)育過程中，肝臟指數(shù)為(13.22±0.56)%～(9.21±0.52)%。雄魚肝臟指數(shù)在Ⅱ期和Ⅲ期差異不顯著(P>0.05)，Ⅲ期為(12.44±1.10)%，此后顯著逐漸下降(P<0.05)，降至(9.21±0.52)%。雌魚肝臟指數(shù)在各個(gè)時(shí)期樣本之間差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

圖5 不同發(fā)育時(shí)期的肝臟指數(shù)變化Fig.5 Changes in hepatosomatic index in different developmental stages

隨著性腺的發(fā)育，紅鰭東方鲀肥滿度的變化為(3.12±0.04)%～(4.17±0.15)%(圖6)。雄魚肥滿度，與Ⅴ期相比，在Ⅵ期顯著降低(P<0.05)。雌魚肥滿度在各個(gè)時(shí)期樣本之間差異不顯著(P>0.05)。

圖6 不同發(fā)育時(shí)期的肥滿度變化Fig.6 Changes in condition factor in different developmental stages

3 討 論

3.1 紅鰭東方鲀繁殖類型及生殖細(xì)胞發(fā)育特征

硬骨魚類繁殖活動(dòng)的調(diào)控十分復(fù)雜，受下丘腦—垂體—性腺(HPG)軸影響，即生殖軸的互相協(xié)調(diào)作用才能完成[29]。還需生殖器官的活動(dòng)結(jié)合生殖細(xì)胞的變化來共同實(shí)現(xiàn)。

大部分硬骨魚類卵巢的變化均表現(xiàn)出周年規(guī)律。按卵子發(fā)生模式可分為3種類型：完全同步型、部分同步型和非同步型。(1)完全同步型，即該卵巢內(nèi)所有的卵母細(xì)胞都處于同一發(fā)育階段，一生只產(chǎn)卵一次，產(chǎn)后死亡，如大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[30]。(2)部分同步型，該卵巢內(nèi)至少有兩種不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞，在一年內(nèi)通常只產(chǎn)卵一次，生殖季節(jié)很短，如虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[31]。(3)非同步型，該卵巢內(nèi)含有各個(gè)發(fā)育階段的卵母細(xì)胞，一年內(nèi)產(chǎn)卵多次，生殖季節(jié)相當(dāng)長(zhǎng)，如青鳉(Oryziaslatipes)[32]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅鰭東方鲀卵巢中卵母細(xì)胞表現(xiàn)為部分同步發(fā)育，其特征是在不同發(fā)育階段的卵巢中卵子發(fā)生過程同時(shí)存在兩個(gè)以上的卵母細(xì)胞階段。并且雌魚在產(chǎn)卵期內(nèi)只產(chǎn)卵一次，因此紅鰭東方鲀應(yīng)該屬于一年產(chǎn)卵一次的部分同步型。在鲀科魚類中，暗紋東方鲀(T.obscurus)[33]也是這種產(chǎn)卵模式。

根據(jù)精子發(fā)生的模式，可將魚類精巢結(jié)構(gòu)分成2種類型：小葉型和小管型[34]。小葉型精巢由許多被結(jié)締組織分隔而成的精小葉構(gòu)成，精小葉包含許多精小囊，生精細(xì)胞在精小囊中發(fā)育，成熟后，精子被釋放到小葉腔中，成熟精子最終存在于小葉腔和輸精管。小葉型又可分為2種，即全囊成熟型和半囊成熟型。全囊成熟型指從精原細(xì)胞至精子細(xì)胞，同一階段的生精細(xì)胞存在于同一個(gè)精小囊中，含有精子細(xì)胞的精小囊破裂，精子釋放至小葉腔[35]。半囊成熟型是指精小囊中只含有精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞。初級(jí)精母細(xì)胞進(jìn)一步分化，精小囊破裂，次級(jí)精母細(xì)胞在腔中繼續(xù)發(fā)育至成熟精子，等待釋放，精子數(shù)量較少[36]。小管型精巢中精小管連通中央腔，不具有精小葉，精子被釋放到中央腔中，如孔雀花鳉(Poeciliareticulata)[37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅鰭東方鲀精巢結(jié)構(gòu)為小葉型，精巢由許多精小葉構(gòu)成，性成熟時(shí)小葉腔內(nèi)有許多成熟的精子細(xì)胞。絕大多數(shù)的硬骨魚類的精子成熟方式屬于小葉型中的全囊成熟型，如金魚(Carassiusauratus)[38]、許氏平鲉(Sebastodsschlegelii)[39]、鲇(Silurusasotus)[40]等，紅鰭東方鲀精子成熟方式與絕大多數(shù)硬骨魚類相同。

根據(jù)卵巢腔的有無以及卵巢與輸卵管的連接情況，可將魚類的卵巢分為2類：游離卵巢和封閉卵巢[32]。游離卵巢無卵巢腔、無輸卵管，卵子成熟后進(jìn)入體腔；封閉卵巢有輸卵管，卵巢被腹膜形成的卵巢囊包裹，卵巢壁向卵巢的內(nèi)部延伸出產(chǎn)卵板。紅鰭東方鲀卵巢屬于封閉型。

魚類精子和卵子的發(fā)生均需經(jīng)過增殖、生長(zhǎng)和成熟等幾個(gè)階段。卵母細(xì)胞的發(fā)育要經(jīng)過原生質(zhì)生長(zhǎng)、卵黃的發(fā)生積累等過程，而卵黃發(fā)生期的主要特征是卵母細(xì)胞胞質(zhì)中合成卵黃顆粒。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅鰭東方鲀卵母細(xì)胞在發(fā)育過程中首先在質(zhì)膜邊緣出現(xiàn)液泡，卵巢到發(fā)育后期開始出現(xiàn)卵黃顆粒，其后卵黃顆粒數(shù)量和體積迅速增加。此外，在紅鰭東方鲀性腺發(fā)育的過程中，并非所有細(xì)胞都會(huì)完成其整個(gè)發(fā)育過程，部分卵母細(xì)胞會(huì)發(fā)生萎縮，萎縮的卵子最終會(huì)被分解吸收。細(xì)胞萎縮的主要原因之一可能為在發(fā)育的過程中缺乏營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)[41]。

3.2 紅鰭東方鲀性腺分期及發(fā)育尺度的判別

截至目前，關(guān)于魚類性腺發(fā)育的組織學(xué)分期，國(guó)際上仍未統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。筆者參考李有廣等[23]提出的性腺劃分標(biāo)準(zhǔn)，并依據(jù)卵細(xì)胞的發(fā)育過程，將紅鰭東方鲀雌、雄性腺均分為6期。但其研究中，試驗(yàn)魚已達(dá)性成熟年齡，未見Ⅰ期性腺(卵原細(xì)胞期)。因此，筆者采集了紅鰭東方鲀的幼魚樣本，并在分期過程中將卵原細(xì)胞期作為第1個(gè)分期，此時(shí)卵巢內(nèi)絕大部分都是卵原細(xì)胞。

紅鰭東方鲀性腺的形態(tài)、大小、顏色特征與配子發(fā)生時(shí)所出現(xiàn)的組織與器官變化有關(guān)，Lowerre-Barbieri等[42-43]對(duì)硬骨魚類性腺發(fā)育的研究也有類似結(jié)果。除了性腺未成熟期與休止期只能通過組織學(xué)診斷來確定，紅鰭東方鲀性腺發(fā)育階段可以通過形態(tài)、大小和顏色加以區(qū)別。本試驗(yàn)結(jié)果表明，分子標(biāo)記的性別鑒定結(jié)果與性腺組織學(xué)觀察確定的性別一致，因此紅鰭東方鲀大多數(shù)發(fā)育階段可以僅依靠性腺的形態(tài)、大小和顏色特征來定義性別是可行且快速的。同時(shí)，紅鰭東方鲀的性腺發(fā)育過程還包含了其他特征，如性腺組織血管化、性腺大小、性腺指數(shù)變化，也可作為性腺分期及發(fā)育尺度的判別。

3.3 相關(guān)指數(shù)與性腺發(fā)育的關(guān)系

性腺指數(shù)的變化能夠直接反映出在生殖活動(dòng)過程中親魚性腺的快速生長(zhǎng)和發(fā)育。與花鱸(Lateolabraxmaculatus)[44]和美洲鰣(Alosasapidissima)[45]相似，人工養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀性腺指數(shù)在生殖期快速升高，Ⅴ期時(shí)達(dá)到峰值，產(chǎn)卵、排精后性腺指數(shù)與Ⅴ期相比均顯著降低(P<0.05)，且在非生殖期保持較低的水平，由此可見人工養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀性腺對(duì)環(huán)境因子的調(diào)控應(yīng)答良好。

肝臟指數(shù)是評(píng)價(jià)魚類性腺發(fā)育的重要數(shù)量指標(biāo)。它能夠直觀表現(xiàn)魚體內(nèi)儲(chǔ)存能量的多少，其變化反映出親魚的攝食情況和肝臟卵黃蛋白原合成的動(dòng)態(tài)變化[46]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅鰭東方鲀雄魚肝臟指數(shù)在發(fā)育前期差異不顯著(P>0.05)，在Ⅲ期后開始下降(P<0.05)。產(chǎn)生這種變化的原因可能是：在發(fā)育前期親魚大量攝食，能量?jī)?chǔ)備提高，當(dāng)接近性成熟期時(shí)紅鰭東方鲀攝食量減少，耗能持續(xù)，魚體儲(chǔ)能被消耗，肝臟指數(shù)在發(fā)育后期下降[47]。此外，暗紋東方鲀雌魚在性腺發(fā)育過程中存在性腺指數(shù)增大、肝臟指數(shù)減小的現(xiàn)象，即隨著性腺成熟度的提高，性腺體積和質(zhì)量逐漸增大，而肝臟卻減小[48]。紅鰭東方鲀魚雌性肝臟指數(shù)在各個(gè)時(shí)期樣本之間無顯著性差異(P>0.05)，未表現(xiàn)出與雄魚一致的變化趨勢(shì)，可能是由于各樣本營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)不同，存在個(gè)體差異所致。

肥滿度能夠直觀反映魚體的生長(zhǎng)狀況。而繁殖與生長(zhǎng)密不可分，魚類一般在性腺發(fā)育階段，肥滿度存在一定的上升趨勢(shì)，在繁殖之后肥滿度下降[45]。筆者對(duì)紅鰭東方鲀的性腺發(fā)育研究也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，但由于紅鰭東方鲀是一種體型較大的魚類，肥滿度在整個(gè)繁殖周期的變化并不明顯。

4 結(jié) 論

筆者首次描述了紅鰭東方鲀性腺發(fā)育規(guī)律，將卵子發(fā)生劃分為6個(gè)時(shí)相，精子發(fā)生分為5個(gè)階段。根據(jù)性腺的外部形態(tài)特征、大小及顏色等，可將紅鰭東方鲀卵巢及精巢發(fā)育過程分為6個(gè)時(shí)期，分別與性腺宏觀表型對(duì)應(yīng)。此外，性腺指數(shù)隨性腺的發(fā)育逐漸升高，產(chǎn)后下降，與性腺發(fā)育的變化規(guī)律保持一致。在精巢發(fā)育過程中，肝臟指數(shù)在Ⅳ期開始顯著下降；卵巢發(fā)育過程中，肝臟指數(shù)變化不大。上述研究成果將有助于提高對(duì)紅鰭東方鲀繁殖生物學(xué)的認(rèn)知,為后續(xù)育種和工廠化養(yǎng)殖，以及深入探索東方鲀屬魚類性腺發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供生物學(xué)依據(jù)。