楊 敏，周夢靈，郗宏焱，劉詩宇，文 鑫

(海南大學海洋學院，海南省水產種業(yè)工程研究中心，海洋生物國家級實驗教學示范中心，南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南省熱帶水生生物技術重點實驗室，海南 ?？?570228)

生物的體色是生物長期進化以適應環(huán)境的重要手段，對生物的生存具有重要的意義，魚的體色是區(qū)別它們的重要表型特征之一。目前已知的石斑魚種類繁多，豐富的體色差異使其可作為研究魚體色生態(tài)適應性的良好材料。虎龍雜交斑是以經(jīng)2代群體選育的棕點石斑魚雌體為母本、鞍帶石斑魚雄體為父本，雜交獲得的F1代，具有育苗成活率高、生長速度快等優(yōu)勢。虎龍雜交斑在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了較為豐富的體色類型，具體表現(xiàn)為白化、黃化等體色變化差異。本文以4種體色的虎龍雜交斑為研究對象，對其肝臟、前腎、脾臟組織中的丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽S轉移酶(GSHST)活力、甘油三酯(TG)含量進行檢測，比較其中與免疫相關基因的表達，以探究它們的生理狀態(tài)。同時，采用蛋白質免疫印記試驗分析4種體色虎龍雜交斑肝臟組織中MAPK 的激活水平。在此基礎上，進一步檢測其下游轉錄因子，以揭示MAPK信號轉導通路調控不同體色虎龍雜交斑生理狀態(tài)的潛在機制，初步探討不同體色虎龍雜交斑生理狀態(tài)的差異，為其健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.實驗材料

本實驗所用的虎龍雜交斑由海南省三亞市晨海水產有限公司提供。實驗選擇了相同養(yǎng)殖條件下的4 種不同體色，分別是正常體色(黑色，N)、白色(W)、黃色(Y)和黃黑間色(Sc)，如圖1 所示，每種顏色各9 尾個體，平均長度為(32±5)厘米，平均體重為(520.3±20.5)克。用MS-222對實驗魚進行麻醉后解剖采樣，取肝臟(L)、前腎(P)、脾臟組織(SP)樣品保存于-80℃的條件下，用于后續(xù)的酶活檢測、蛋白印跡分析、實時熒光定量分析等。

圖1 4種體色的虎龍雜交斑

2.酶活檢測

取4種體色虎龍雜交斑的肝臟、前腎、脾臟組織，準確稱取樣品重量，按重量(克)∶體積(毫升)＝1∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水作為勻漿介質，在冰水浴條件下進行機械勻漿，以2 500 轉/分離心10 分鐘，取上清液用以蛋白質濃度和酶活檢測。谷胱甘肽S 轉移酶(GSH-ST)活性、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)含量檢測采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行測定。

3.蛋白質印跡法(免疫印跡實驗)

利用全蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)提取4 種體色虎龍雜交斑的肝臟組織總蛋白，與上清液以4∶1 比例混合，100℃變性10 分鐘，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將PVDF 膜與TBST 和5%脫脂牛奶在室溫下孵育2 小時，阻斷非特異性結合。PVDF膜在4℃以下一抗孵育過夜。用TBST 洗膜液洗滌PVDF 膜，并進行二抗孵育，然后進行增強化學發(fā)光(ECL)和放射自顯影。使用Amersham 成像儀600 系統(tǒng)(GE 醫(yī)療保健生物科學公司)對免疫印跡進行化學發(fā)光檢測。

4.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

使用Trizol(Invitronen，15596-025)從4 種體色虎龍雜交斑的肝臟、前腎、脾臟組織中提取總RNA，實驗采用了變性瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計NanoDrop2000 對RNA 樣品的質量進行了檢測。每個樣本共1 微克RNA 用于RNA 樣本的制備。以其中的mRNA為模板，使用HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，R123-01)，進行逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR，rtpcr)獲得cDNA，保存于-80℃條件下，用于后續(xù)的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。選取與虎龍雜交斑免疫相關的基因以及MAPK 通路下游轉錄因子(C-Myc、c-fos、p53、jun-D、igf、ednrb)，通過熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測相對表達量，用于反映虎龍雜交斑在分子水平上的生理狀態(tài)差異，檢測指標來源于先前的研究基礎。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)使用2×Q3 SYBR qPCR Master Mix(Universal)(上海吐露港生物科技有限公司)進行，以β-actin 作為對照管家基因，每個實驗重復進行3 次，最終反應體積為20 微升。用閾值周期值(Ct)法測定基因的表達水平，利用β-actin測定各基因的相對表達水平。使用Primer 5.0 設計的qRT-PCR引物信息如表1所示。

表1 引物信息

5.統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用單因素試驗統(tǒng)計分析和LSD法進行分析。顯著性水平設置為P＜0.05，試驗結果以“平均值±標準差”表示。

二、結果與分析

1.酶活性檢測

(1)甘油三酯(TG)活性。比較不同組間的顯著性變化差異，結果顯示TG 在黃色組肝臟中的含量高，活性顯著高于其他剩余體色組，其他剩余體色組之間TG 活性沒有顯著性差異。TG 在4 個不同體色組前腎中的活性顯示，正常體色和白色體色組顯著高于黃黑間色和黃色組，其中正常體色組和白色體色組之間無顯著性差異，黃黑間色組和黃色組之間沒有顯著性差異。在4個不同體色組脾臟組織中的活性顯示，正常體色組顯著高于其他體色變異組。

(2)丙二醛(MDA)活性。對于4個不同體色組的肝臟組織中的活性，比較不同組間的顯著性變化差異，結果顯示丙二醛(MDA)在黃色組中的含量高，活性顯著高于其他剩余體色組，黃黑間色組顯著低于黃色體色組但顯著高于正常體色和白色體色組，正常體色和白色體色組之間沒有顯著性差異。MDA 在4 個不同體色組的前腎中的活性顯示，黃黑間色體色組顯著高于白色體色和黃色體色組。MDA 在4 個不同體色組的脾臟中的活性顯示，黃色體色組顯著高于其他剩余體色組，正常體色組顯著低于其他變異體色組，MDA活性在白色與黃黑間色體色組之間沒有顯著性差異。

(3)谷胱甘肽S 轉移酶(GSH-ST)活性。對于4個不同體色組的肝臟組織中的活性，比較不同組間的顯著性變化差異顯示，GSH-ST 在黃色體色組中的活性顯著高于正常體色組、白色體色組、黃黑間色體色組，白色體色組的活性顯著低于其他體色組，其中正常體色和黃黑間色體色組之間GSH-ST 活性沒有顯著性差異。正常體色組前腎中的GSH-ST 活性顯著高于白色體色組、黃黑間色體色組、黃色體色組，黃黑間色體色組顯著高于黃色體色組。GSH-ST 在正常體色組脾臟中的活性顯著低于其他變異體色組。

2.參與MAPK通路的蛋白質表達水平

通過蛋白質免疫印記試驗，在4個不同體色組的肝組織中均檢測到MAPK 通路在蛋白質水平上的表達。在變異體色組個體中檢測到的p38MAPK 和ERK1/2、磷酸化水平均顯著高于正常體色組。白色體色和黃色體色組的JNK1 的磷酸化水平顯著高于正常體色組，表明該通路的激活水平與體色變化存在一定的聯(lián)系。

3.參與免疫調控基因的表達比較

實時熒光定量PCR 對參與免疫調控的基因在4 個不同體色組的3 個組織中的相對表達量檢測結果顯示，在肝臟組織中，c-fos、jun-D、p53、ednrb 4 種基因在黃色體色組中的表達量最高；C-Myc、igf 在黃黑間色體色組中的表達量最高；c-fos、C-Myc、jun-D、p53、ednrb、igf 6 種基因在白色體色組中的表達量最低。在前腎組織中，c-fos、C-Myc、jun-D、ednrb、igf在黃色體色組中表達量最高；p53在白色體色組中表達量顯著升高。在脾臟組織中，c-fos在白色體色組中的表達量顯著升高，在黃黑間色和黃色體色組中無顯著性差異；C-Myc在黃色體色組中的相對表達量顯著升高，在白色和黃黑間色體色組中無顯著性差異。jun-D 在白色體色組中的表達量無顯著升高，在黃黑間色和黃色體色組中的表達量顯著性降低。p53 在黃黑間色體色組中的表達量稍有降低。ednrb、igf 兩種基因在白色體色組中的相對表達量顯著升高，但在黃黑間色和白色體色組中無顯著性差異。

綜上，黃色體色組虎龍雜交斑與正常體色組相比，肝臟中的GSH-ST、MDA、TG 含量相對較高，MAPK 通路的ERK1/2、JNK1 和p38MAPK 激活水平較高，下游轉錄因子表達量較高，在免疫組織中檢測到了顯著上調的igf、ednrb 基因。黃黑間色體色組和白色體色組與正常體色組相比部分免疫指標也呈現(xiàn)出了顯著的變化。因此，4種不同體色虎龍雜交斑的生理狀態(tài)存在一定的差異。這些差異的產生可能是由于不同體色的虎龍雜交斑抗氧化應激能力存在差異，在環(huán)境發(fā)生改變時，該差異在不同程度上影響了谷胱甘肽S轉移酶(GSH-ST)活力、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)含量、MAPK通路激活水平及其下游轉錄因子和相關免疫基因的表達量，這些免疫指標的變化參與到機體的調控中，最后表現(xiàn)在生理狀態(tài)的差異上。目前對于導致不同體色虎龍雜交斑出現(xiàn)不同生理狀態(tài)的機制還需進一步探究。