論文：氣體過飽和對草魚和鰱受精卵、仔魚和幼魚的影響

氣體過飽和對草魚和鰱受精卵、仔魚和幼魚的影響

吳 凡，杜開開，柳 凌，魏 念，倪朝輝，李云峰

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中上游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，武漢 430223)

大壩在汛期開閘泄洪，空氣在高壓的作用下溶入到高速排出的洪水中，導(dǎo)致大壩下游水體出現(xiàn)溶解氣體過飽和的現(xiàn)象[1]，形成的氣體過飽和水隨著河道流動到下游從而影響水中的水生生物正常的生命活動[2]。氣泡病是水生生物常見的疾病，主要由魚類暴露于氣體過飽和水體中導(dǎo)致，嚴(yán)重時影響魚體正常的生命活動。20世紀(jì)60年代，哥倫比亞河大壩泄洪導(dǎo)致水體出現(xiàn)氣體過飽和的現(xiàn)象引起了廣泛關(guān)注。此后，科研人員針對氣體過飽和對水生生物(主要是鮭科魚類)的影響進(jìn)行了大量研究[3]，并試圖通過優(yōu)化大壩結(jié)構(gòu)以及泄水操作以降低水壩泄水時水體中溶解性氣體的飽和度。根據(jù)現(xiàn)行美國環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，水環(huán)境中溶解氣體飽和度應(yīng)低于110%，但大壩泄水時往往無法滿足這一條件[4]。

水體中氣體過飽和現(xiàn)象是一直存在的環(huán)境質(zhì)量問題，雖然國內(nèi)外對大壩泄洪時下游河流中氣體過飽和的形成和釋放機(jī)制進(jìn)行了一些研究[5,6]，但形成的氣體過飽和水體對水生生物影響的研究仍相對缺乏。國外研究人員觀測到大壩泄洪時下游水體的溶解氣體含量會急劇升高，魚體內(nèi)的溶解氣體含量也在升高，導(dǎo)致魚類死亡率升高[7,8]。Antcliffe等[9]研究發(fā)現(xiàn)暴露于氣體過飽和水體的虹鱒幼魚會出現(xiàn)行動遲緩和死亡前不規(guī)則游動的現(xiàn)象。Earl等[10]研究發(fā)現(xiàn)水體里氣體飽和度的變化對魚類的影響存在差異。隨著國家對西部地區(qū)發(fā)展建設(shè)的重視，長江上游到金沙江流域建立和規(guī)劃了近20座高體大壩，汛期泄洪導(dǎo)致下游水體中氣體過飽和的現(xiàn)象日益嚴(yán)重。已有研究表明在三峽大壩和向家壩在泄洪期間下游水體的溶解氣體會出現(xiàn)過飽和的現(xiàn)象[11,12]。袁嫄等[13]通過長薄鰍在氣體過飽和水體里的再暴露實驗發(fā)現(xiàn)低飽和度對魚類的影響較小。董杰英等[14]分析了草魚(Ctenopharyngodonidella)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙(Hypophthalmichthysnobilis)這三種經(jīng)濟(jì)魚類在氣體過飽和水中的敏感性差異。雖然國內(nèi)外都開展了一些溶解氣體過飽和水對魚類生長發(fā)育的影響研究，但對這些魚類早期發(fā)育階段的影響研究相對較少。本文通過研究氣體過飽和水體對草魚、鰱早期發(fā)育的三個階段(受精卵、仔魚和幼魚)的耐受性，分析不同飽和度的氣體過飽和水體對它們不同的發(fā)育時期的影響，從而為長江流域水生生物的環(huán)境保護(hù)以及解決高壩泄洪產(chǎn)生的氣體過飽和水體對魚類的影響提供研究基礎(chǔ)，并為建立氣體過飽和標(biāo)準(zhǔn)體系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗魚來源

實驗用草魚(受精卵、仔魚、幼魚)，鰱(受精卵、仔魚、幼魚)均取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所荊州窯灣實驗場。草魚卵為受精后7 h，孵化水溫在(25.0±0.5)℃；草魚仔魚為出膜后4 d；草魚幼魚體長為(5.82±0.40)cm，體重為(4.06±0.81)g。鰱卵為受精后9 h，孵化水溫在(25.0±0.5)℃；鰱仔魚為出膜后3 d；鰱幼魚為體長(2.21±0.24)cm，體重(0.17±0.08) g。

1.2 氣體過飽和發(fā)生和實驗裝置

本研究的設(shè)備由作者及所在學(xué)科組設(shè)計和制作。設(shè)備包括氣體過飽和發(fā)生裝置和氣體過飽和實驗裝置兩部分組成。

氣體過飽和發(fā)生裝置由水泵、蓄水池、壓力罐、空氣壓縮機(jī)、管道等部件組成(專利號ZL 2017 2 0786771.7)(圖1)。可以模擬高壩泄水時所生成的高飽和度的氣體過飽和水，再通過和自然水體的融合來調(diào)配出試驗所需要的飽和度為100%、110%、120%、130%、140%的氣體過飽和水體。

圖1 氣體過飽和水發(fā)生裝置Fig.1 Schematic representation of the generator of gas-supersaturated water

氣體過飽和實驗裝置由控溫系統(tǒng)和實驗桶(半徑0.4 m，長1.2 m)兩部分組成。該裝置能確保試驗期間實驗桶內(nèi)的水溫晝夜溫差不超過±0.5℃，水體中氣體飽和度偏差不超過±1%/4 h。溶解氧濃度使用美國哈希公司生產(chǎn)的HQ30D測定儀檢測，其量程為0～200%，其精度為±1%。氣體飽和度由丹麥Oxyguard公司生產(chǎn)的Handy Polaris TGP(Total Dissolved Gas Pressure)測定儀檢測，其量程為0～200%，精度為±1%。

1.3 不同階段草魚和鰱在氣體過飽和水中的暴露實驗

1.3.1 草魚和鰱受精卵暴露實驗

挑選發(fā)育至原腸中晚期的草魚、鰱受精卵分別放進(jìn)自制可透水的金屬桶(直徑15.0 cm×高16.5 cm，小孔直徑0.1 cm)，每桶放實驗魚卵各20粒，然后將金屬桶放入氣體飽和度100%、110%、120%、130%、140%的實驗桶中。金屬桶位于水面下5.0 cm處。每個飽和度設(shè)3組平行，對照組的實驗魚受精卵放入裝有井水的實驗桶內(nèi)。實驗過程中每隔4 h測量并記錄實驗桶內(nèi)的水溫和氣體飽和度，控制草魚和鰱受精卵最適孵化溫度在(24.5±0.5)℃，并調(diào)節(jié)實驗桶內(nèi)氣體飽和度以滿足實驗條件。記錄桶內(nèi)實驗魚受精卵的死亡情況，并通過解剖鏡觀察實驗魚受精卵的狀態(tài)以及發(fā)育情況。當(dāng)對照組完全出膜時，停止實驗，記錄各組卵未出膜數(shù)，統(tǒng)計孵化率。

1.3.2 草魚和鰱仔魚暴露實驗

將草魚和鰱仔魚各30尾分別放進(jìn)自制可透水的塑料網(wǎng)盒(長6.0 cm×寬4.0 cm×高8.0 cm，網(wǎng)目40)，然后將塑料網(wǎng)盒放入氣體飽和度100%、110%、120%、130%、140%的實驗桶中，對照組的實驗魚放入裝有井水的實驗桶內(nèi)。塑料網(wǎng)盒位于水面下5.0 cm處，每個實驗組設(shè)置3組平行。實驗過程中每4 h測量并記錄實驗桶內(nèi)的水溫和氣體飽和度，控制草魚和鰱仔魚最適生存溫度在(24.0±1.0) ℃，同時調(diào)節(jié)實驗桶內(nèi)氣體飽和度以滿足實驗條件。實驗過程中記錄桶內(nèi)實驗魚仔魚的死亡數(shù)量，并通過解剖鏡觀察剛死亡的實驗魚仔魚受氣體過飽和水影響的表觀特征。

1.3.3 草魚和鰱幼魚暴露實驗

將草魚幼魚15尾、鰱幼魚20尾分別放進(jìn)金屬桶(直徑16.5 cm ×高18.0 cm，小孔直徑0.4 cm)內(nèi)，然后將金屬桶放入氣體飽和度100%、110%、120%、130%、140%的實驗桶中，對照組的實驗魚幼魚放入裝有井水的實驗桶內(nèi)。金屬桶位于水面下5.0 cm處，每個實驗組設(shè)置3組平行。實驗過程中每4 h測量并記錄實驗桶內(nèi)的水溫和氣體飽和度，控制草魚和鰱幼魚最適生存溫度在(24.0±1.0) ℃，同時調(diào)節(jié)實驗桶內(nèi)氣體飽和度以滿足實驗條件。實驗過程中記錄桶內(nèi)實驗魚幼魚的死亡數(shù)量，并通過解剖鏡觀察剛死亡的實驗魚幼魚魚體受氣體過飽和水體的影響特征。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用EXCEL2016計算實驗魚在不同飽和度的死亡率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并將計算結(jié)果導(dǎo)入GraphPad Prism 8中作圖，以氣體飽和度的值作為自變量，建立氣體過飽和水體對實驗魚的飽和度-反應(yīng)(死亡率)和時間-反應(yīng)(死亡率)關(guān)系。本實驗通過半致死時間LT50來表明不同飽和度的氣體過飽和水體對草魚仔魚和幼魚的影響，LT50越小，說明對實驗魚的致死效應(yīng)越強(qiáng)，魚類存活時間越短。將死亡率換成概率單位，同時對暴露時間進(jìn)行對數(shù)處理，用Excel 2016計算暴露時間和反應(yīng)(死亡概率)之間的線性關(guān)系式，其回歸模型為y=Ax+B，其中A、B均為常數(shù)，當(dāng)死亡概率達(dá)到0.5時得到的暴露時間即為半致死時間LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣體過飽和水體對草魚、鰱受精卵孵化的影響

通過不同飽和度的氣體過飽和水體對草魚、鰱這兩種魚類受精卵孵化的影響，結(jié)果顯示不同飽和度的氣體過飽和度水體對實驗魚的受精卵孵化均未有明顯影響，受精卵的出膜率均達(dá)到100%。通過顯微鏡每4 h觀察不同飽和度的過飽和水體的受精卵的發(fā)育情況，每個時間點觀察實驗魚受精卵發(fā)育情況并未受到氣體過飽和水體的影響，而且各飽和度下受精卵出膜的時間與對照并無明顯的差異，各飽和度下均有個別受精卵表面附著一些氣泡，但未影響實驗魚受精卵的發(fā)育情況，且實驗魚受精卵內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有氣泡。

2.2 氣體過飽和水體對草魚、鰱仔魚的影響

草魚和鰱的仔魚在氣體過飽和度為100%、110%、120%、130%、140%水體的暴露實驗結(jié)果如圖2所示。圖2A草魚仔魚的結(jié)果表明，各飽和度下，草魚仔魚在0～24 h的死亡率均增長較快，24 h后死亡率增長較為緩慢，56 h后死亡率增長趨于平緩。其中飽和度140%的氣體過飽和水體下實驗魚的死亡率增長明顯較其他各實驗組快，且飽和度100%、110%、120%和130%的氣體過飽和水體下實驗魚的死亡率隨時間變化的趨勢基本一致，其中飽和度140%的實驗魚最終死亡率最高達(dá)56.67%。圖2B鰱仔魚的結(jié)果表明，各飽和度下，鰱仔魚在96 h后死亡率均較低，其中氣體過飽和度為130%的實驗魚在88 h時死亡率達(dá)到最大的23%，而飽和度為100%的實驗魚基本沒有影響。實驗結(jié)果表明，各實驗組中草魚仔魚的死亡率均高于鰱仔魚。通過觀察，氣體過飽和水體下草魚和鰱仔魚主要表現(xiàn)為腹部腫脹有氣泡導(dǎo)致其游動異常，最終腹部朝上浮于水面。用解剖鏡觀察死亡實驗魚主要是腹腔和其他部位腫脹充氣(圖3)。

圖2 草魚(A)和鰱(B)仔魚在氣體過飽和水體里暴露時間和死亡率關(guān)系Fig.2 Relationship between exposure time and mortality of larvae of C.idella(A) and H.molitrix(B) in gas-supersaturated water

圖3 氣體過飽和對草魚(A)和鰱(B)仔魚表觀特征的影響(黑色箭頭標(biāo)示氣泡位置)Fig.3 Effects of gas supersaturation on the apparent characteristics of larvae of C.idella(A) andH.molitrix(B)(black arrows indicate the position of bubbles)

2.3 氣體過飽和水體對草魚、鰱幼魚的影響

草魚和鰱的幼魚在氣體過飽和度為100%、110%、120%、130%、140%水體的暴露實驗結(jié)果如圖4所示。圖4A草魚幼魚的實驗結(jié)果表明，各氣體飽和度下，草魚幼魚的死亡率有明顯的變化趨勢。其中氣體飽和度140%的實驗魚在0～24 h死亡率急劇增長，32 h前后死亡率達(dá)到100%；氣體飽和度130%的實驗魚在0～24 h死亡率急劇增長，24 h后死亡率增長變緩慢，56 h時死亡率達(dá)到最大值100%；氣體飽和度120%的實驗魚在40～48 h之間死亡率急劇增長，48 h后死亡率較慢增長直至96 h；氣體飽和度110%的實驗魚在64 h左右開始死亡，72 h后死亡率增長較快，直至96 h死亡率達(dá)60%；氣體飽和度100%的水體對實驗魚基本沒有什么影響，直至96 h三個平行組均只有一尾實驗魚死亡。圖4B鰱的實驗結(jié)果表明，各飽和度水體下，鰱幼魚死亡率在實驗過程中均緩慢增長，其中氣體飽和度140%的實驗魚死亡率增長較其他實驗組快，96 h死亡率達(dá)到最大值35%；氣體飽和度100%的實驗魚受到影響較小；其他飽和度的實驗魚死亡率均較低。實驗結(jié)果表明，氣體過飽和水體中，草魚幼魚的死亡率高于鰱幼魚。氣體過飽和水體對草魚和鰱幼魚的表觀影響主要是頭部、腹部腫脹充氣，鰭條充血有氣泡，腹腔腫脹有氣泡，腸道充氣，血管有氣泡形成血栓(圖5)。

圖4 草魚(A)和鰱(B)幼魚在氣體過飽和水體里暴露時間和死亡率關(guān)系Fig.4 Relationship between exposure time and mortality of juveniles of C.idella(A) and H.molitrix(B) in gas-supersaturated water

圖5 氣體過飽和對草魚(A)和鰱(B)幼魚表觀特征的影響(黑色箭頭標(biāo)示氣泡位置)Fig.5 Effects of gas supersaturation on the apparent characteristics of juveniles of C.idella(A)and H.molitrix(B)(black arrows indicate the position of bubbles)a：頭部；b：腸道；c：血管；d：胸腔

2.4 不同氣體過飽和度下草魚幼魚的半致死時間

鰱仔幼魚和氣體飽和度100%的草魚幼魚在實驗過程中死亡率均未到達(dá)50%，因此未計算其半致死時間。通過計算得出在不同氣體飽和度的水體中草魚幼魚的半致死時間，結(jié)果如表1所示。氣體飽和度110%、120%、130%和140%下，草魚幼魚的平均半致死時間分別為96.38、56.17、20.21和11.24 h，結(jié)果表明半致死時間隨飽和度的增加而減少，說明氣體飽和度越高對草魚幼魚的致死效果越強(qiáng)，實驗魚的存活時間越短。

表1 不同氣體飽和度下草魚幼魚的半致死時間Tab.1 LT50 for C.idella juveniles at different level of gas supersaturations

3 討論

水體里充足的氧氣是魚類受精卵孵化的重要條件，本實驗結(jié)果表明氣體過飽和水對草魚和鰱的受精卵的胚胎發(fā)育和孵化均未造成影響。Marsh等[15]和其他氣體過飽和的研究中均未發(fā)現(xiàn)對魚類受精卵的孵化有任何影響，Arntzen等[16]也發(fā)現(xiàn)大馬哈魚受精卵對氣體過飽和水體有較強(qiáng)的耐受力。然而有研究表明氣體過飽和水體會促進(jìn)魚類受精卵的孵化[17,18]，或者增加魚類受精卵死亡率[19]。楊川順[17]在研究中指出氣體過飽和水體里的受精卵周圍會附著氣泡，這些氣泡導(dǎo)致魚卵與水體里的氧氣隔絕，從而形成低氧的環(huán)境。適當(dāng)?shù)脱鹾康乃w能促進(jìn)魚類受精卵的發(fā)育和孵化[18,20]，而嚴(yán)重低氧會導(dǎo)致受精卵死亡[21,22]。本實驗過程中，草魚和鰱受精卵基本沒有氣泡附著，而且實驗組和對照組的實驗魚受精卵的胚胎發(fā)育和出膜時間沒有明顯差異，因此實驗魚受精卵的孵化未受到明顯影響。Gale等[23]發(fā)現(xiàn)將大馬哈魚的受精卵暴露于高氣體飽和度的水體中，魚卵的重量和直徑未受到影響，而且魚卵的死亡率和氣體過飽和水體之間未觀察到有明顯關(guān)系。通過本實驗和上述相關(guān)文獻(xiàn)表明，氣體過飽和水體對魚類受精卵的孵化可能沒有直接影響，但不排除由于水體氣泡過多導(dǎo)致受精卵周圍環(huán)境的變化從而影響到受精卵的孵化。

草魚、鰱的仔魚和幼魚的暴露實驗結(jié)果表明，氣體過飽和水體下，仔魚的耐受力較幼魚高。Bohl[24]將不同生長時期的虹鱒暴露于氣體過飽和水體中，研究表明氣體過飽和水體下魚類的耐受力隨著年齡的增長而下降，這與本實驗的結(jié)論一致。機(jī)體在生命活動中需要不斷地消耗能量，因此機(jī)體需要不斷地從外界吸取氧，并將二氧化碳及時排出體內(nèi)，這種吸收和排出氣體的過程稱為呼吸。魚類的呼吸器官主要是鰓，但仔魚在鰓器官未發(fā)育完全前，主要是借鰭褶及卵黃囊上的微血管網(wǎng)進(jìn)行呼吸[25]。這些器官對氧氣過飽和的敏感性不及鰓器官，氣泡主要是通過吞食進(jìn)入魚體內(nèi)在腹腔積累。而幼魚心血管發(fā)育基本成型，氣體通過呼吸作用進(jìn)入機(jī)體血管，通過積累形成血栓阻礙血液流通，從而影響魚體正常的生命活動，因此氣體過飽和對實驗魚幼魚機(jī)體的損傷程度高于仔魚。

圖2和圖4結(jié)果表明不同氣體過飽和度水體下，飽和度越高實驗魚的耐受性越低，但實驗魚的仔魚在各飽和度的耐受性差異不是很明顯。通過對草魚幼魚半致死時間的計算結(jié)果可以看出，飽和度越高的水體對實驗魚的致死效應(yīng)越強(qiáng)。氣體飽和度越高水體里氣泡含量越多。過多的氣體附著在體表和鰓絲上通過氣體交換進(jìn)入血管，在血管內(nèi)積累形成血栓，從而阻礙血液循環(huán)導(dǎo)致魚類死亡。水體氣泡含量越高，幼魚將氣泡當(dāng)作餌料吞食的機(jī)率越大，在腸道內(nèi)積累的也越多。腸道內(nèi)未能及時排出機(jī)體外的氣泡，通過腸道壁滲透到腹腔。腹腔內(nèi)氣體堆積導(dǎo)致魚體失去平衡腹部向上浮于水面，進(jìn)一步加劇實驗魚的死亡。Weitkamp等[26,27]發(fā)現(xiàn)幼魚的腸道內(nèi)或口腔中的氣泡會導(dǎo)致實驗魚腹部向上浮于水面，并且出現(xiàn)游動異常不規(guī)律的現(xiàn)象。董曉煜等[28]發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)溶解氣體的升高會抑制血紅蛋白的表達(dá)，溶解氣體越高血紅蛋白的表達(dá)量越低。本實驗中隨著水體氣體過飽和度的升高，可能導(dǎo)致實驗魚的血紅蛋白表達(dá)量降低，從而使血液里的氧氣未能及時消耗同時二氧化碳未及時排出，致使這些氣體在血管內(nèi)積累加劇形成血栓，最終導(dǎo)致魚類死亡。Alderdice等[29]和Jensen等[30]研究報道高飽和度的氣體過飽和水體的魚死亡時間較快，而低飽和度的魚死亡時間則較慢。黃翔等[31]研究也表明魚類死亡率隨著氣體過飽和度的上升而增加。上述研究表明，氣體過飽和度越高，魚體血管中血栓的形成越快，死亡速度則越快。

實驗研究結(jié)果表明，氣體過飽和水體下，鰱的耐受性較草魚強(qiáng)。其可能原因是，鰱是濾食性魚類，主要靠味覺進(jìn)行攝食，而草魚是草食性魚類，主要靠視覺進(jìn)行攝食[32]，因此草魚可能更易于將水體里的微小氣泡誤當(dāng)作食物吞入體內(nèi)，導(dǎo)致腸道內(nèi)氣泡堆積。相同體長下鰱腸長遠(yuǎn)大于草魚[33]，鰱腸道對氣體的承載力可能要強(qiáng)于草魚，在草魚腸道內(nèi)堆積的氣體更易于擴(kuò)散至腹腔內(nèi)，從而導(dǎo)致魚體失去平衡，腹部朝上浮于水面。草魚腸道內(nèi)的絨毛發(fā)達(dá)，吸收能力強(qiáng)，而鰱腸道內(nèi)絨毛粗短且粘液細(xì)胞小，吸收能力較弱[33]，因此草魚可能更易于將腸道內(nèi)的氣體吸收進(jìn)入血液，導(dǎo)致過量氣體在血管中堆積形成氣栓從而加速魚類死亡。

氣體過飽和水體對不同魚類的致死效應(yīng)存在差異。將不同飽和度下，草魚與長江其他幾種魚的半致死時間進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示。

表2 各氣體飽和度下不同魚類的半致死時間Tab.2 LT50 for different species at different level of gas supersaturations

結(jié)果表明草魚相較于其他幾種魚對氣體過飽和有較強(qiáng)的耐受性，并且高飽和度的水體對魚類有較強(qiáng)致死效應(yīng)。本學(xué)科組野外觀測發(fā)現(xiàn)在泄洪期間三峽大壩下游氣體飽和度可達(dá)110%～140%，本研究結(jié)果表明長期暴露于此環(huán)境下會導(dǎo)致魚類死亡。而隨著金沙江和長江上游流域更多高體大壩的建成，水體中氣體過飽和問題會更加嚴(yán)重。因此，亟待更多的相關(guān)研究，并以這些研究結(jié)果為基礎(chǔ)制定相關(guān)法規(guī)政策以減輕甚至消除水體中氣體過飽和對魚類繁殖以及生長發(fā)育的影響。