運輸過程中水質和魚類生理指標的變化及運輸控制策略

運輸過程中水質和魚類生理指標的變化及運輸控制策略

張云龍　賀亞蒙　袁　娟　張子涵　丁淑荃　楊啟超　張志強鮑傳和　萬　全　沈志剛

(1. 安徽農業(yè)大學動物科技學院, 合肥 230036; 2. 肥東縣水產技術推廣站, 肥東 231600;3. 華中農業(yè)大學水產學院, 武漢 430070)

在水產養(yǎng)殖中, 活體運輸是魚類經常需要面臨的應激之一。魚類運輸具有重要的意義, 主要應用于食用魚銷售; 苗種轉運至成魚養(yǎng)殖設施;野生魚類人工馴養(yǎng)以及運輸至研究機構中等。出于不同的目的, 養(yǎng)殖魚類在生活史的不同階段均可能面臨應激脅迫, 然而, 應激會導致魚類氧化應激、細胞凋亡和免疫力下降, 進而導致病原感染和死亡。因此, 制定標準的魚類運輸操作規(guī)程以最小化應激反應對水產養(yǎng)殖業(yè)是至關重要的,可降低魚類運輸后的死亡率、提高經濟效益。相關的科學研究也是以此為主要目的而進行的。本文綜述了已有的相關資料, 旨在整合相關的文獻信息, 分析魚類運輸過程中生理指標及水質的變化,并為魚類運輸操作標準規(guī)程的制定提供理論依據(jù)。

1　運輸對水質的影響

魚類的運輸方式各不相同, 最主要的表現(xiàn)為運輸時使用的容器, 其主要取決于魚的種類、個體規(guī)格以及生態(tài)習性等。幼魚以及個體規(guī)格較小的魚類常用的運輸容器為塑料袋, 如黑點無須■(Puntius filamentosus)、翹嘴鲌(Culter alburnus)幼魚、斑點叉尾鲙(Ictalurus punctatus)幼魚等, 而一些規(guī)格較大的魚則使用盒、箱子或桶等較大的容器, 如大西洋鱈(Gadus morhua)、庫魯魯■(Potamotrygon cf. histrix)、刀鱭(Coilia nasus)、巴鰹(Euthynnus affinis)等, 甚至有使用網箱直接在海水中運輸規(guī)格特別大的魚類, 如藍鰭金槍魚(Thunnus thynnus)。由此可見, 運輸會將魚類限制在一個小環(huán)境水體中, 因而水質對運輸?shù)某苫盥省⑿室约棒~類福利起到了至關重要的作用。對黃尾■(Seriola lalandi)和大西洋鮭(Salmo salar)的研究中發(fā)現(xiàn), 運輸會造成魚類代謝速率明顯加快, 繼而引起耗氧率增加和代謝廢物排泄量的(CO2和氨氮)增加, CO2溶于水中又會導致水體pH降低。CO2作為一種代謝產物, 對魚類具有很大的生理副作用。CO2在血漿中富集會導致血漿酸化, 降低血液的攜氧能力和血紅蛋白對氧氣的親和力。運輸過程中水質的惡化很大程度上受到運輸密度、魚的規(guī)格以及運輸時間的影響。表 1中列出了一些魚類運輸過程對運輸容器中水質的影響狀況, 可見運輸對容器中水質具有顯著的影響, 常用評價指標有溶解氧、總氨氮及pH。

由于運輸過程中水質的惡化會影響運輸魚類的成活率, 如何維持運輸過程中的水質是急需解決的問題, 具有十分重要的應用價值。溶解氧是相對較為容易控制的水質指標之一, 開放容器中常用持續(xù)曝氣的方法維持水體溶解氧, 密閉容器(如氧氣袋)常用充純氧來維持。水體pH的降低則可通過添加緩沖劑來維持。而魚類運輸過程中水體氨氮和CO2則并不是那么容易控制的, 且氨氮對魚類具有較強的毒理作用, CO2對魚類也具有明顯的副作用。運輸過程中如果溶氧充足, 魚類會進行有氧代謝消耗機體儲存的糖原, 產生大量的CO2, 致使周圍水體和血漿酸化; 如果溶氧不足, 魚類則會進行無氧代謝, 產生大量的乳酸, 致使機體酸中毒。待機體儲存糖原耗盡后, 魚類則會代謝機體蛋白或氨基酸以維持能量供應, 這一過程則會產生氨。就此來說, CO2的大量釋放以及水體的酸化在短途運輸中會經常出現(xiàn), 而氨氮的大量排泄則常出現(xiàn)在長途運輸中。CO2會在魚類運輸開始后的24h內迅速上升, 隨著運輸時間的增加, CO2的排泄速率則明顯下降, 而氨排泄速率則明顯上升。由此可見, CO2排泄速率這一指標在魚類運輸中具有非常重要的意義, 然而這一指標在現(xiàn)有研究中的應用卻并不多。此外, 隨著運輸時間的增加, 氨排泄速率會明顯上升, 說明了長途運輸中容器內水質調控的難度更大。

2　運輸對魚類生理的影響

運輸會對魚類造成應激反應, 首先表現(xiàn)在生理指標的變化上, 造成魚體外與體內穩(wěn)態(tài)的變化。魚類對應激的生理反應可分為3個階段, 第一階段是神經系統(tǒng)接受外界應激信號并迅速分泌腎上腺素, 刺激魚類頭腎組織釋放皮質醇, 隨后皮質醇會調動體內儲備的能量以提供調節(jié)滲透壓所需的氧氣和能量, 因此血漿皮質醇水平也成為了評價魚類應激第一階段最重要的指標之一。第二階段主要涉及生理生化方面的代謝反應, 包括血漿和組織中代謝產物、血液學指標的變化以及應激蛋白(如熱休克蛋白)的激活等, 研究魚類應激第二階段最常用的指標則是血糖含量。第三階段主要涉及應激對魚類造成的生長、繁殖、抗病力、代謝能力以及存活的影響, 然而有關魚類運輸應激第三階段的研究卻相當缺乏。表 2總結了運輸應激對魚類血漿中生理指標的影響。從表中可看出, 現(xiàn)有的研究主要針對于淡水魚類的短途運輸(運輸時間＜8h), 而有關海水魚類以及長途運輸(運輸時間＞8h)的報道則相對較少, 而且評價指標也以血漿皮質醇和血糖含量為主、缺乏應激第三階段的研究。

表 1　魚類運輸后水體中溶氧、pH及總氨氮的增加倍數(shù)Tab. 1　Fold changes in dissolved oxygen, pH and total ammonia nitrogen after live fish transport

2.1　運輸應激第一階段

從表 2可看出, 血漿皮質醇是最經典、最常用的魚類應激評價指標之一, 由魚類頭腎組織分泌,受下丘腦-垂體-腎間軸調控。魚類在應激的初期階段會迅速分泌皮質類固醇和兒茶酚胺, 尤其是腎上腺素, 但腎上腺素增加的持續(xù)時間卻遠比皮質醇增加的時間短, 因此血漿皮質醇被廣泛用于魚類應激的評價中。皮質醇的釋放會對魚類造成多種不利的生理影響, 如降低免疫力、刺激蛋白分解及引起糖異生反應等(圖 1)。然而, 運輸應激會誘導魚類血漿皮質醇含量顯著增加, 如細鱗肥脂鯉(Piaractus mesopotamicus)、斑點叉尾鲙、大口黑鱸(Micropterus salmoides)[51]及翹嘴鲌等(表2)。血漿皮質醇對外界應激因子的反應是非常迅速的, 一般10min之內即可發(fā)現(xiàn)顯著的上升, 反應較慢的也在2—24h內迅速釋放, 而且一旦外界應激因子消失, 血漿皮質醇會在24h內恢復到基礎水平。魚體內皮質醇的消除主要在肝臟中進行, 皮質醇的消除速度可能與環(huán)境因子相關, 但應激、鹽度、性成熟度、營養(yǎng)狀況等因子會抑制魚體內皮質醇的消除。然而, 魚類處于運輸脅迫時, 其血漿皮質醇會迅速上升并持續(xù)相當長的時間(表 2), 甚至在整個運輸過程中均保持非常高的水平。從這個角度來看, 血漿皮質醇指標適用于魚類短途(＜8h)和長途(＞8h)運輸應激的評價。值得一提的是, 一些仔魚及小型觀賞魚的血液采集是非常困難的, 通常的解決辦法是通過合并血液樣本或者測定全魚皮質醇水平。此外, 魚類在運輸之前通常需要手工搬運, 這也會對魚類造成應激反應, 此時盡管還未開始運輸, 其血液皮質醇水平仍然不能作為正常的基礎水平。為了解決這些問題, 一些報道提供了許多措施, 主要可分為2大類, 一類是使用麻醉劑, 如間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(Tricaine methanesulphonate, MS-222)、植物精油、丁香提取物等; 另一類是使用非應激手段(Non invasive methods), 其目的在于去除或最小化取樣造成的應激脅迫, 如檢測魚類釋放到水體中的皮質醇及檢測糞便中的皮質醇等。然而, 魚體內皮質醇的排出主要通過鰓組織, 因而檢測糞便中的皮質醇含量的準確度并不夠?？傮w來看, 皮質醇作為評價魚類運輸應激指標適用于短途和長途運輸, 但其檢測方法仍需進行改善, 檢測魚類釋放至水體中的皮質醇是非常有效的非應激手段之一, 對采血不便的小型魚類同樣適用且可消除取樣引起的應激反應。

2.2　運輸應激第二階段

魚類在應激第一階段會釋放大量皮質醇, 誘導機體糖原分解和糖異生作用以應對應激脅迫(圖 1),血糖含量及糖原分解的增加被認為是應激的第二階段。肝臟和肌肉糖原含量作為應激評價指標的原理與血糖基本是一致的, 近年的報道也較多。在通常情況下, 運輸應激會導致魚類血糖含量上升、糖原含量降低(表 2), 其原因主要是魚類在應激狀態(tài)下會消耗更多的能量。魚類應激狀態(tài)下血糖含量也受到多種因素的影響, 包括種類、生長階段、營養(yǎng)狀況等, 如營養(yǎng)狀況會影響點帶石斑魚(Epinephelus coioides)寒冷脅迫下血糖的含量。皮質醇的釋放已被證實會刺激魚類血糖含量的上升, 但塞內加爾鰨(Solea senegalensis)在中密度擁擠脅迫下血糖含量顯著高于低密度組, 盡管其血漿皮質醇含量與低密度組無差異。這種增加顯然不是皮質醇誘導的, 可能是由于兒茶酚胺的釋放引起的(圖 1)。因此, 要確認魚類在運輸應激下血糖增加是否由皮質醇誘導, 研究魚類皮質醇的基礎水平是非常重要的。從表 2中可看出, 隨著運輸時間的延長, 魚類血糖含量呈現(xiàn)下降的趨勢, 說明魚體內貯存能量的耗盡。也就是說血糖作為魚類長途運輸應激評價指標的適用性并不如短途運輸, 而且長途運輸時血糖測定的間隔時間也應該更短, 有助于更直觀的評價魚類在應激時的生理應答。

乳酸是魚體肌肉無氧代謝產物, 魚類在應激條件下肌肉無氧代謝會顯著增加, 導致血漿乳酸濃度升高, 如圓口銅魚(Coreius guichenoti)、大黃魚(Larimichthys crocea)、長吻裸頰鯛(Lethrinus miniatus)等。魚類運輸后血漿乳酸濃度的升高說明了運輸后機體供氧的不足, 如何保證運輸期間充足的機體供氧是急需解決的關鍵問題之一。溫度對魚類應激條件下血漿乳酸含量可能起到某些特殊的作用, 溫度對魚類血漿乳酸含量的影響也是后續(xù)研究需要關注的方向之一。乳酸作為一種無氧代謝產物, 對機體是有危害的, 但對斑馬魚(Danio rerio)的研究發(fā)現(xiàn)乳酸在寒冷脅迫下可作為能量以維持機體生理穩(wěn)態(tài)。后續(xù)的研究可以關注乳酸在魚類運輸應激下是否具有類似的作用及其調節(jié)機制。

表 2　運輸后魚類血漿中皮質醇、葡萄糖及乳酸含量的增加倍數(shù)Tab. 2　Fold changes in plasma cortisol, glucose and lactate after transport

2.3　其他應激指標

由于外界環(huán)境的可變性, 魚類血漿的滲透壓也是可調節(jié)的, 但相對是較為穩(wěn)定的。淡水魚類的血漿滲透壓為230—280 mOsmol/kg, 海水魚類為300—350 mOsmol/kg, 兩者相差并不大。血漿滲透壓作為魚類運輸應激評價指標的報道并不多, 可見維多利亞野鯪(Labeo victorianus)、圓口銅魚、刀鱭及庫魯魯■等。但其是反映魚類自身內穩(wěn)態(tài)的重要指標之一, 而且很大程度上受到魚體內皮質醇的影響, 因此將血漿滲透壓作為魚類運輸應激的評價指標是非常必要的。除此之外, 也有研究將血漿無機鹽離子作為魚類運輸應激的評價指標之一, 報道較多的是血漿Na+離子、Cl-離子和K+離子, 因為這些離子對魚類滲透壓影響較大, 如維多利亞野鯪、庫魯魯■、三帶鉛筆魚(Nannostomus trifasciatus)、細鱗肥脂鯉、小鋸蓋魚(Centropomus parallelus)、克林雷氏鯰(Rhamdia quelen)等。

血液學指標也被用于評價魚類運輸應激,但其對應激的響應時間較長, 用于評價魚類長途運輸應激和魚類應激第二階段可能更加合適。近年來, 隨著研究手段的進步, 應用于評價魚類運輸應激的生理指標也越來越多, 如肌肉品質、核苷酸含量、性激素、對氧磷酶活性、血氨濃度、耗氧率、基因表達水平、轉錄組學等。這些指標在特定的研究條件和研究目的下, 可作為經典應激評價指標(皮質醇和血糖)的補充資料, 對真實反映特定狀態(tài)下魚類運輸后的應激生理具有重要意義。

3　應用中降低運輸應激的措施

魚類運輸在生產中應用十分廣泛, 如何在運輸過程中維持水質指標、盡可能的降低應激反應是相關研究重點關注的方向之一, 對提高運輸成活率起到關鍵的作用, 常用的措施主要有i)增加水體溶解氧, ii)調整水體鹽度, iii)添加緩沖劑, iv)氨處理措施, v)降低水溫, vi)麻醉運輸, vii)添加益生菌,viii)合理的運輸密度。

3.1　增加水體溶解氧

溶解氧是魚類運輸過程中的重要限制因子之一, 理想的運輸水體中溶解氧飽和度應為100%。氧氣在水體中的溶解度受水溫、氣體組成、鹽度、氣壓等因素的影響。充氧是魚類運輸過程中最常用的措施之一, 常用的設備有氧氣罐、增氧機及液氧等, 有關這幾種充氧方式的優(yōu)劣點可見Harmon的綜述。運輸開始的0.5—1h內魚類活動會異常激烈, 對氧氣的消耗也非常大, 在此期間必須保證足夠的水體溶解氧。然而, 水體中過飽和的溶解氧也存在一定的危害性, 如過高的溶解氧會以氣泡的形式存在并導致魚類的氣泡病, 而且過飽和的溶解氧是否會對魚類造成氧化應激反應也是需要關注的問題之一。

3.2　調整水體鹽度

魚類處于運輸應激狀態(tài)下, 由于腎上腺素的釋放會導致魚類鰓上皮的水通透性改變。在這種情況下會引起魚類滲透壓內穩(wěn)態(tài)失調, 進而引起運輸魚類的死亡。淡水魚類為高滲型, 需要抑制外源水的進入和體內無機鹽離子的流失, 因此在淡水魚類運輸中通常選擇加入適量的鹽(如NaCl、NaHCO3和海水)以形成體內外等滲的環(huán)境, 有助于降低淡水魚類運輸過程中的應激反應, 對維多利亞野鯪、刀鱭、虹鱒等淡水魚類的研究結果均證實了這一結論。但在巨骨舌魚(Arapaima gigas)幼魚運輸過程中加入NaCl不僅不會降低其運輸應激反應, 還會導致其滲透壓調節(jié)紊亂, 說明適量添加鹽可降低淡水魚類運輸應激似乎是因種而異的, 針對不同種類的研究仍然是必要的。有關水體鹽度對海水魚類運輸應激的研究并不多, 僅見軍曹魚(Rachycentron canadum)[7]和大黃魚, 后續(xù)研究應關注這一問題。

3.3　添加緩沖劑

運輸會造成魚類代謝速率明顯加快, 繼而排泄大量的CO2溶于水中, 導致水體pH降低。由于運輸用水體積有限, 添加緩沖劑可有效的緩解水體酸化。研究表明在運輸容器中加入小蘇打、三甲醇氨基甲烷(Tris)以及氫氧化鎂微?？捎行Ь徑膺\輸導致的水體pH降低。由于運輸過程中水體中氨的含量會顯著增加(表 2), 而氨的存在形式很大程度上又取決于水體pH。在偏堿性環(huán)境中氨主要以分子態(tài)(NH3)形式存在, 對水生動物毒性較大; 在偏酸性環(huán)境中主要以離子態(tài)形式存在,毒性較小。因此, 在使用緩沖劑時還應考慮到水體中氨氮的含量, 以免造成氨中毒。

3.4　氨處理措施

氨是水體中常見的環(huán)境毒素之一, 可造成魚類鰓結構異化、腦組織損傷、氧化應激等毒理作用。因此, 運輸導致的水體氨增加也是急需處理的問題之一。甲醛亞硫酸氫鈉及沸石等氨還原劑均被證實可有效降低運輸導致的水體氨累積?？紤]到水體pH對氨毒性的影響, 氨還原劑和pH緩沖劑的同時使用更利于魚類運輸過程中水質的調控。

3.5　降低水溫

對于魚類這種變溫動物來說, 降低水溫可降低其消化酶活性、降低新陳代謝速率, 也就降低了魚類的耗氧率、CO2和氨的排泄率, 還可增加氧氣在水體中的溶解率。在對圓口銅魚的研究中發(fā)現(xiàn)降低水溫可降低運輸應激并提高水質。但水溫降低需要精細的操作規(guī)程, 并不能驟降, 而且各種魚類對溫度的適應性也各不相同, 基礎資料的累積和規(guī)范化操作規(guī)程的制定是必要的。

3.6　麻醉運輸

麻醉是魚類運輸中常用的降低應激措施之一,麻醉后魚類的代謝速率、耗氧率、CO2和氨排泄率均有明顯的降低趨勢。MS-222、丁香酚、苯佐卡因、喹哪啶及2-苯氧乙醇等麻醉劑已廣泛應用于魚類運輸中, 并取得了良好的抗應激效果。某些植物提取的精油同樣對魚類具有一定的麻醉效果, 也可用于魚類運輸抗應激, 如丁香屬、過江藤屬、阿萊藤屬以及羅勒屬等屬的植物。然而, 對小鋸蓋魚的研究中發(fā)現(xiàn)植物精油盡管可以起到麻醉的作用, 但并不能降低其運輸過程中的應激反應?？梢娐樽碓隰~類運輸中的作用并不都是積極的, 針對特定種類的研究仍然是必要的。此外, 麻醉劑對魚類也是具有一定的生理副作用的, 如常用的MS-222可造成魚類血液學指標的變化。因此, 在魚類運輸過程中使用麻醉劑是需要充分的科研理論作為支撐的, 相關的理論研究也需要加強。

3.7　添加益生菌

近年來, 一些益生菌和免疫多糖類被應用于水產養(yǎng)殖中, 用于提高養(yǎng)殖魚類的生長速度和免疫機能。也有將益生菌和免疫多糖應用于魚類運輸中以維持機體內穩(wěn)態(tài)、提高運輸成活率, 如益生菌Efinol®L可降低阿氏霓虹脂鯉(Paracheirodon axelrodi)運輸過程中代謝廢物的排放量, 從而維持水質、提高運輸成活率; 飼料中添加β-1, 3葡聚糖投喂三帶鉛筆魚7d可維持其運輸過程中Na+和K+內平衡和水質指標。然而, 添加益生菌對庫魯魯魟等運輸并沒有明顯的有益作用。因此, 特定益生菌和免疫多糖對特定魚類運輸過程中的作用仍需要持續(xù)研究。

3.8　合理的運輸密度

魚類運輸過程中的裝載密度受到水質、運輸時間、水溫、規(guī)格和魚的種類等因素影響, 運輸密度反之又會影響魚類運輸過程中的應激反應和水質。過高的運輸密度會導致應激更強、代謝廢物排放更多、水質惡化更快, 運輸成活率顯著降低; 過低的運輸密度則意味著更高的運輸成本。合理的運輸密度是魚類運輸操作規(guī)程中重要的組成部分之一, 隨著運輸時間的延長, 運輸密度應相應降低。

4　結論

運輸在水產養(yǎng)殖業(yè)中是非常重要的, 魚類標準化運輸操作規(guī)程的制定有利于水產養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。運輸會對魚類造成應激反應, 引起生理指標和水質的變化。盡管近年來魚類運輸越來越受到關注, 相關研究報道也逐年增加, 但與世界上種類繁多的經濟魚類和觀賞魚類相比, 這些研究的量仍明顯不足。水質惡化(尤其是pH降低和氨累積)是魚類運輸中急需解決的關鍵問題, 現(xiàn)有的解決措施主要是通過添加緩沖劑、氨還原劑以及降低運輸魚類代謝來實現(xiàn)水質調控, 然而這些解決措施尚存在一定的不穩(wěn)定性。運輸引起的魚類應激反應, 常用的評價指標有皮質醇和血糖。皮質醇仍然是經典的應激評價指標, 適用于魚類短途和長途運輸,而血糖則更加適用于評價短途運輸應激。某些特殊的生理指標在特定的研究條件和研究目的下, 可作為皮質醇和血糖的補充資料, 對真實反映特定狀態(tài)下魚類運輸后的應激生理具有重要意義。生理影響和水質影響在魚類運輸中是相互影響的, 水質惡化會導致魚類生理學變化, 魚類生理學活動又會影響水質。因此, 在魚類運輸相關研究中, 水質和生理指標都是需要評價的。

5　展望

魚類標準化運輸操作規(guī)程的制定是魚類運輸相關研究的核心任務, 后續(xù)的研究應圍繞這一主題進行。以下幾個方面應該是后續(xù)研究應該重點關注的： 第一, 不同魚類的生態(tài)習性和不同生活史階段對運輸?shù)捻憫? 第二, 魚類運輸過程中CO2的排泄率和水體中CO2含量應該被充分認識和重視; 第三, 針對特定魚類其適宜的運輸密度、運輸時間、水溫、鹽度、麻醉劑種類和麻醉方式等抗應激措施應被充分評估; 第四, 更加多樣化的應激評價指標(如抗氧化酶等)和更加科學的測定手段應被應用到后續(xù)研究中; 第五, 干法運輸可以避免運輸過程中水質的惡化, 且很大程度上消除了運輸密度的限制, 某些氣呼吸型魚類如大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)等, 可在空氣中(需保持體表濕潤)存活相當長的時間, 其干法運輸?shù)目尚行灾档蒙罹俊?/span>