化學(xué)物質(zhì)毒性檢測(cè)：魚(yú)類(lèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)

魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)，是水生生態(tài)毒理學(xué)的重要內(nèi)容之一，并廣泛應(yīng)用于水域環(huán)境污染監(jiān)測(cè)工作中，對(duì)控制工業(yè)廢水的排放、保護(hù)水域環(huán)境、發(fā)展?jié)O業(yè)生產(chǎn)，制定漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，具有重要意義。

一、實(shí)驗(yàn)原理

魚(yú)類(lèi)對(duì)水環(huán)境的變化反應(yīng)十分靈敏，當(dāng)水體中的污染物達(dá)到一定程度時(shí)，就會(huì)引起一系列中毒反應(yīng)，例如行為異常、生理功能紊亂、組織細(xì)胞病變、直至死亡。在規(guī)定的條件下，使魚(yú)接觸含不同濃度受試物的水溶液，實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行24h，最好以96h為一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，在24h、48h、72h、96h時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)魚(yú)的死亡率，確定魚(yú)類(lèi)死亡50%時(shí)的受試物濃度。魚(yú)類(lèi)毒性試驗(yàn)在研究水污染及水環(huán)境質(zhì)量中占重要地位。通過(guò)魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)可以評(píng)價(jià)受試物對(duì)水生生物可能產(chǎn)生的影響，以短期暴露效應(yīng)表明受試物的毒害性。魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)不僅用于測(cè)定化學(xué)物質(zhì)毒性強(qiáng)度、測(cè)定水體污染程度、檢查廢水處理的有效程度，也為制定水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、評(píng)價(jià)環(huán)境質(zhì)量和管理廢水排放提供環(huán)境依據(jù)。

二、實(shí)驗(yàn)材料

1、試驗(yàn)用魚(yú)的選擇與馴養(yǎng)

試驗(yàn)用的魚(yú)必須對(duì)毒物敏感，應(yīng)具有代表性，便于在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)，來(lái)源豐富，個(gè)體健康。我國(guó)可采用的試驗(yàn)魚(yú)有四大養(yǎng)殖淡水魚(yú)（青魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)和鳙魚(yú)）、金魚(yú)、鯽魚(yú)等。

在同一實(shí)驗(yàn)中要求試驗(yàn)魚(yú)必須同屬、同種、同齡，最好是當(dāng)年生。魚(yú)的平均體長(zhǎng)以7cm以下為宜。金魚(yú)體短、身寬，一般以3cm以下較為合適。同組魚(yú)中最大的體長(zhǎng)不應(yīng)超過(guò)最小的體長(zhǎng)的1.5倍。

選用的試驗(yàn)魚(yú)在試驗(yàn)前必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)過(guò)馴養(yǎng)，使之適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件的生活環(huán)境和進(jìn)行健康選擇。馴養(yǎng)魚(yú)應(yīng)該與試驗(yàn)相同水質(zhì)水溫的水體中至少馴養(yǎng)7天，使其適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境，不應(yīng)長(zhǎng)期養(yǎng)殖（

試驗(yàn)前必須挑選健康的魚(yú)，即選擇行動(dòng)活潑、體色光澤、魚(yú)鰭舒展完整、逆水性強(qiáng)、大小無(wú)太大懸殊、無(wú)任何疾病的魚(yú)作為試驗(yàn)魚(yú)。任何畸形魚(yú)、外觀上反常態(tài)的魚(yú)都不得作試驗(yàn)魚(yú)。

2、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

（1）實(shí)驗(yàn)容器

實(shí)驗(yàn)容器一般用玻璃或其他化學(xué)惰性材質(zhì)制成的水族箱或水槽。容器體積可根據(jù)試驗(yàn)魚(yú)的體重確定，通常以每升水中魚(yú)的負(fù)荷不得超過(guò)2g（最好為1g），或者其盛水量以每條魚(yú)2～3L為宜。一些小型魚(yú)類(lèi)幼魚(yú)可選擇500mL或1000mL燒杯為實(shí)驗(yàn)容器。容器的深度必須超過(guò)16cm，水體表面積越大越好。同一實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用相同規(guī)格和質(zhì)量的容器。為防止魚(yú)類(lèi)跳出容器，可在容器上加上網(wǎng)罩。實(shí)驗(yàn)容器使用后，必須徹底洗凈，以除去所有毒性殘留物。

（2）其他

溶解氧測(cè)定儀、水硬度計(jì)、溫度控制儀、pH計(jì)、分析天平。

3、實(shí)驗(yàn)用水（稀釋水）及水質(zhì)條件

用來(lái)馴養(yǎng)和配制實(shí)驗(yàn)液的水，必須是未受污染的清潔水。一般可采用天然河水、湖水或地下水，但需過(guò)濾以除去大的懸浮物質(zhì)。也可用放置3天以上的自來(lái)水。如果試驗(yàn)?zāi)康氖窃u(píng)價(jià)工業(yè)廢水或化學(xué)物質(zhì)對(duì)接納水體的影響時(shí)，則最好采用接納水體的污染源上游水作為試驗(yàn)用稀釋水。蒸餾水不適合作稀釋水，因?yàn)檎麴s水中已除去了自然界水中的鹽類(lèi)，與實(shí)際差距太大，另外由于蒸餾器的影響，有時(shí)使蒸餾水中帶有對(duì)魚(yú)類(lèi)不利的金屬離子，影響試驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)用水的水質(zhì)條件一般是指水的溫度、pH、溶解氧、硬度、水中的有機(jī)物和水量等。

（1）水溫

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)保持魚(yú)類(lèi)原來(lái)的適應(yīng)溫度，一般冷水魚(yú)溫度為12～18℃，溫水魚(yú)溫度為20～28℃。為使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，在同一實(shí)驗(yàn)中，溫度的波動(dòng)范圍不要超過(guò)4（即±2℃）。冬天可以通過(guò)加熱室內(nèi)的空氣溫度達(dá)到調(diào)節(jié)水溫的目的，也可以采用電熱棒直接控制調(diào)節(jié)水溫。

（2）pH

水的pH與水生生物的代謝作用有密切關(guān)系。對(duì)毒物的毒性作用也有一定的影響。因此，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)維持pH在魚(yú)類(lèi)適宜范圍內(nèi)。一般實(shí)驗(yàn)液的pH在6.7～8.5為宜。如需調(diào)節(jié)pH，可用1M或0.1M的HCl和NaOH來(lái)調(diào)節(jié)受試物貯備液的pH。調(diào)節(jié)貯備液的pH時(shí)不能使受試物濃度明顯改變，或發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或沉淀。

（3）溶解氧

溶解氧是魚(yú)類(lèi)生存的必要條件，它能影響魚(yú)類(lèi)對(duì)毒物的敏感性。一般溫水魚(yú)要求溶解氧在4mg/L以上，冷水魚(yú)要求溶解氧在5mg/L以上。

（4）硬度

水的總硬度為10～250mg/L（以CaCO3計(jì)）。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、預(yù)試驗(yàn)

用確定正式實(shí)驗(yàn)所需濃度范圍，可選擇較大范圍的濃度系列，如1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L、0.1mg/L。每個(gè)濃度放入5條魚(yú)，可用靜態(tài)方式進(jìn)行，不設(shè)平等組，試驗(yàn)持續(xù)48h～96h。每天至少兩次記錄各容器內(nèi)的死魚(yú)數(shù)，并及時(shí)取出死魚(yú)。求出24h100%死亡濃度和96h無(wú)死亡濃度。

如果依次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)法確定正式試驗(yàn)所需的濃度范圍，應(yīng)另選一濃度范圍再次進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。

2、正式實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得出的結(jié)果，在包括使魚(yú)全部死亡的最低濃度和96h魚(yú)類(lèi)全部存活的最好濃度之間至少設(shè)置5個(gè)濃度組，并以幾何級(jí)數(shù)排布。濃度間隔系數(shù)應(yīng)≤2.2。

每個(gè)試驗(yàn)濃度組應(yīng)至少設(shè)2～3個(gè)平行，每一系列設(shè)一個(gè)空白對(duì)照。如使用了助溶劑，應(yīng)增設(shè)溶劑對(duì)照組，其濃度與試劑中的最高溶劑濃度相同。試驗(yàn)魚(yú)的數(shù)目以每組實(shí)驗(yàn)濃度10～20尾合適，不得少于10尾。

試驗(yàn)溶液調(diào)節(jié)至相應(yīng)溫度后，從馴養(yǎng)魚(yú)群中隨機(jī)取出魚(yú)并隨機(jī)迅速放入各試驗(yàn)容器中。轉(zhuǎn)移期間處理不當(dāng)?shù)聂~(yú)均應(yīng)棄除。同一試驗(yàn)，所有試驗(yàn)用魚(yú)應(yīng)30min內(nèi)分組完畢。

在24h、48h、72h、96h后檢查受試魚(yú)的狀況。如果沒(méi)有任何肉眼可見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)，如鰓的扇動(dòng)、碰觸尾柄后無(wú)反應(yīng)等，即可判斷該魚(yú)已死亡。觀察并記錄死魚(yú)數(shù)目后，將死魚(yú)從容器中取出。應(yīng)在試驗(yàn)開(kāi)始后3h或6h觀察各處理組魚(yú)的狀況，并記錄試驗(yàn)魚(yú)的異常行為（如魚(yú)體側(cè)翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力減弱，色素沉積等）。

試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)要測(cè)定pH、溶解氧和溫度。試驗(yàn)期間，每天至少測(cè)定一次。

至少在試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)，測(cè)定實(shí)驗(yàn)容器中試驗(yàn)液的受試物濃度。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組的死亡率不得超過(guò)10%。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、數(shù)據(jù)處理

以暴露濃度為橫坐標(biāo)，死亡率為縱坐標(biāo)，在計(jì)算機(jī)或?qū)?shù)概率紙上，繪制暴露濃度對(duì)死亡率的曲線。用直線內(nèi)插法或常用統(tǒng)計(jì)程序計(jì)算出24h、48h、72h、96h的半致死濃度（LC50）值，并計(jì)算95%的置信限。

如果試驗(yàn)數(shù)據(jù)不適于計(jì)算LC50，可用不引起死亡的最高濃度和引起100%死亡的最低死亡濃度估算LC50的近似值，即這兩個(gè)濃度的幾何平均值（）。

2、化學(xué)物質(zhì)急性毒性分級(jí)

依據(jù)LC50值的大小，可以將化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分為劇毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5級(jí)。

魚(yú)類(lèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

3、編寫(xiě)報(bào)告

在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)包括：試驗(yàn)名稱(chēng)、目的、試驗(yàn)原理、試驗(yàn)的準(zhǔn)確起止日期，還有如下幾項(xiàng)：

（1）試驗(yàn)魚(yú)的種名、來(lái)源、體重、體長(zhǎng)、健康和馴化狀況。

（2）受試物質(zhì)名稱(chēng)、來(lái)源物化學(xué)性質(zhì)和保存方法。

（3）實(shí)驗(yàn)用水的來(lái)源、物化性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)前的處理等。

（4）實(shí)驗(yàn)溶液的濃度與配制方法、實(shí)驗(yàn)溫度。

（5）實(shí)驗(yàn)條件，如容器形式、實(shí)驗(yàn)液的體積與深度、受試生物數(shù)目及負(fù)荷率。

（6）實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后24h、48h、72h、96h時(shí)的LC50值，及其毒性分級(jí)。

4、注意事項(xiàng)

（1）試驗(yàn)期間，對(duì)照組魚(yú)死亡率不得超過(guò)10%。

（2）試驗(yàn)期間，受試物實(shí)測(cè)濃度不能低于設(shè)置濃度的80%。如果試驗(yàn)期間受試物實(shí)測(cè)濃度與設(shè)置濃度相差超過(guò)20%，則應(yīng)該以實(shí)測(cè)受試物濃度來(lái)表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果。

（3）試驗(yàn)期間，盡可能維持恒定條件。