論文：魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)研究進(jìn)展與前景展望

魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)研究進(jìn)展與前景展望

陳 健 楊壯志 李良玉 楊 馬 唐 洪

魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)在魚(yú)類(lèi)繁殖和遺傳育種工作中起著至關(guān)重要的作用，它能夠最長(zhǎng)限度地保存雄性親魚(yú)的種質(zhì)資源，解決雌雄親魚(yú)性成熟不同步的問(wèn)題，提高魚(yú)類(lèi)精液利用率和配種效率。魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)廣泛應(yīng)用魚(yú)類(lèi)育種中，特別是在雜交育種中，它能充分利用雜種優(yōu)勢(shì)，改善種質(zhì)資源退化，進(jìn)一步優(yōu)化魚(yú)類(lèi)的優(yōu)良性狀。

魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)其實(shí)質(zhì)是降低精子代謝率，減少能量消耗，從而延長(zhǎng)精子壽命。精子具有運(yùn)動(dòng)能力，所需能量來(lái)自于原生質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但精子處在稠密環(huán)境的精巢內(nèi)是不活動(dòng)的，對(duì)于體外受精的魚(yú)類(lèi)，精子遇水后被氧氣激活，開(kāi)始活潑運(yùn)動(dòng)，而體內(nèi)受精的動(dòng)物則不同，精子液化后即開(kāi)始活潑運(yùn)動(dòng)。

由于精子的原生質(zhì)極少，能量有限，故精子排入水中被激活后的壽命很短。對(duì)于體外受精的魚(yú)類(lèi)，其精子的壽命較短；體內(nèi)受精的動(dòng)物，其精子壽命通常較長(zhǎng)，時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)至數(shù)日，甚至達(dá)到數(shù)十日。淡水硬骨魚(yú)的精子壽命為45s～5min左右，這與精子處于低滲環(huán)境有關(guān)，精子產(chǎn)生的能量既要用于運(yùn)動(dòng)又要用于滲透壓的調(diào)節(jié)，會(huì)造成能量迅速耗盡。精子的能量還用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡。魚(yú)類(lèi)精液的保存就是利用降低精子代謝率的方法減少能量的消耗，從而達(dá)到延長(zhǎng)精子壽命的目的。隨著魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展以及雜交育種和優(yōu)良品種的選育等工作的開(kāi)展，魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越 廣泛。魚(yú)類(lèi)精液的保存方法有常溫保存、低溫冷藏保存和超低溫冷凍保存。常溫保存和冷藏保存用于短期保存精液，而冷凍或超低溫冷凍則用于長(zhǎng)期保存精液。本文就魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)做一簡(jiǎn)單闡述。

一、常溫保存

在常溫條件下，即沒(méi)有冷藏和冷凍等設(shè)備，將魚(yú)類(lèi)精子處于等滲環(huán)境中，如利用同種魚(yú)的卵巢提取液或體腔液，減少精子用來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓平衡的能量消耗，從而延長(zhǎng)精子的壽命。

在實(shí)踐中利用卵巢提取液和體腔液的方法較少，許星鴻研究發(fā)現(xiàn)，用0.65%生理鹽水代替淡水，魚(yú)類(lèi)精子受精能力的時(shí)間可延長(zhǎng)半分鐘以上；張崇英等也報(bào)道稱(chēng)利用生理鹽水代替鹽水可提高魚(yú)類(lèi)受精率。

二、低溫冷藏保存

冷藏保存主要是利用低溫降低精子的代謝率，通常是在普通冰箱的冷藏室（0～4℃條件下）保存魚(yú)類(lèi)精液，這種方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，保存時(shí)間較長(zhǎng)，可保存精液達(dá)幾天至數(shù)十天，此法可在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛推廣使用。龔麗等研究發(fā)現(xiàn)，低溫冷藏條件下精子壽命可持續(xù)到15天左右，精子的密度對(duì)于虹鱒精液保存的活力和壽命都有一定影響，高密度的精液會(huì)導(dǎo)致精子活力消退和壽命縮短。Stoss J等研究在精原液中加入抗生素和氧氣，連晉等研究用人工精漿稀釋可有效地保存虹鱒精子達(dá)34天和60天。

低溫冷藏保存具體做法如下：采集到的魚(yú)類(lèi)精液放入潔凈的器皿中，加入抗生素以抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，若在精液中加入合適的稀釋液，保存時(shí)間將更持久。常用的抗生素有：青霉素，5000IU/mL精液；硫酸新霉素，1mg/mL精液；青霉素1000IU+鏈霉素5000IU/mL精液；金霉素0.6mg/mL精液等。實(shí)踐中硫酸新霉素及青霉素+鏈霉素混合使用其效果更佳。常用的稀釋劑：葡萄糖0.3g+檸檬酸鈉0.14g+卵黃2mL+蒸餾水10mL；檸檬酸鈉0.3g+磺胺粉0.03g+卵黃0.5mL+蒸餾水10mL；氯化鈉（7.5mol/L）100份+氯化鉀（7.5mol/L）2份+氯化鈣（11mol/L）2.1份+碳酸氫鈉（10mol/L）2.4份。稀釋劑現(xiàn)配現(xiàn)用或配好后放入冰箱冷藏備用（冷藏時(shí)間不可超過(guò)1周），稀釋倍數(shù)為6～10倍。

低溫保存時(shí)精子仍有微弱的代謝，需要消耗氧氣，因而盛放精液容器中所裝入的精液量只占容器體積的1/10～1/8，使容器存有一定體積空氣，為精子的代謝提供氧氣，條件允許情況下，可向容器內(nèi)充入氧氣代替空氣，精液保存效果更好。低溫保存要點(diǎn)：做好密封、防治污染、低溫穩(wěn)定，因此裝有精液的容器要用軟木塞和石蠟密封好，防治精液蒸發(fā)和被污染；在保持冷藏室低溫溫度穩(wěn)定前提下，盡可能調(diào)低冷藏室的溫度，減緩精子代謝，延長(zhǎng)精子壽命。

三、超低溫冷凍保存

常溫保存和低溫冷藏保存僅用于短期保存精液，在實(shí)踐生產(chǎn)和推廣應(yīng)用上有一定的局限性。在魚(yú)類(lèi)繁殖和育種中，往往出現(xiàn)雌雄親本性腺發(fā)育不同步，雌雄親魚(yú)性成熟時(shí)間跨度大，需要更長(zhǎng)時(shí)間保存精液，而冷凍或超低溫冷凍可以保存精液時(shí)間更長(zhǎng)，保存時(shí)間甚至長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久。超低溫條件下，精子的代謝停滯，處于假死狀態(tài)，代謝和運(yùn)動(dòng)完全停止，生命處于靜止?fàn)顟B(tài)，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒(méi)有受到損害，解凍后即會(huì)復(fù)蘇。

精子超低溫冷凍保存的具體做法如下：采集魚(yú)類(lèi)精液，加入稀釋液和抗凍劑后等溫稀釋?zhuān)ň汉拖♂屢合♂尡壤秊?∶3），降溫平衡，放入液氮中長(zhǎng)期保存，需要時(shí)解凍復(fù)蘇，活力檢測(cè)。

1.稀釋液的添加

稀釋液的配制是魚(yú)類(lèi)精液冷凍保存中至關(guān)重要的一步，茍興能報(bào)道稱(chēng)不同的保存液對(duì)同一種魚(yú)精子的保存作用是不同的，而同一保存液對(duì)不同種魚(yú)的精子保存效果也是不同的。由于魚(yú)種的特異性，不同魚(yú)類(lèi)精液冷凍保存對(duì)稀釋液的要求也略微存在差異，但大體類(lèi)似。稀釋液的成分在合適的范圍內(nèi)越簡(jiǎn)單越好，魚(yú)類(lèi)精液保存稀釋液成分主要包括：鹽類(lèi)（如碳酸氫鈉、氯化鈉、碳酸氫鉀、檸檬酸鈉等）、糖類(lèi)（如葡萄糖、果糖、蔗糖等）、脂類(lèi)（主要是磷脂）和蛋白質(zhì)（如卵黃、牛奶、小牛血清等）以及其他添加劑（如維生素、抗生素等）。李常健研究發(fā)現(xiàn)，K+能提高精子運(yùn)動(dòng)速度，延長(zhǎng)精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間；同時(shí)Ca2+、Mg2+也是部分魚(yú)類(lèi)精子活力的重要調(diào)節(jié)因子，它們濃度的增加可增強(qiáng)其精子活力，延長(zhǎng)精子壽命。因此，大多數(shù)魚(yú)類(lèi)的保存液中，應(yīng)具有一定濃度的 K+、Ca2+、Mg2+等離子。海水魚(yú)類(lèi)用由葡萄糖和檸檬酸鈉組成的稀釋液和甘油作為抗凍劑能獲得良好的冷凍效果；淡水魚(yú)類(lèi)稀釋液則以氯化鈉和氯化鉀為主，加入少量氯化鈣、氯化鎂、碳酸氫鈉和葡萄糖，以二甲基亞砜（DMSO）作為抗凍劑，于海濤等報(bào)道稱(chēng)10%的DMSO濃度是一個(gè)高度有效的濃度，能起到良好的抗凍作用，在實(shí)踐中已廣泛使用。

2.冷凍方法

冷凍方法目前主要使用4種方法：小丸顆粒冷凍法，麥管冷凍法，安瓿瓶冷凍法和塑料離心管冷凍法。（1）小丸顆粒冷凍法：將精液直接滴入干冰孔內(nèi)，精液冷凍成小顆粒，再轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存，此方法冷凍量小，操作較繁瑣。（2）麥管冷凍法：冷凍體積較大，操作較簡(jiǎn)便。（3）安瓿瓶冷凍法：體積較大，冷凍效果也較好，但降溫不均勻，瓶口需密封，操作復(fù)雜，且在解凍時(shí)，安瓿瓶易爆裂，在實(shí)踐中較少應(yīng)用。（4）塑料離心管冷凍法：具有冷凍量大、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用安全等特點(diǎn)，在魚(yú)類(lèi)精液保存中已廣泛應(yīng)用。

3.降溫平衡

降溫平衡步驟是否需要進(jìn)行因魚(yú)類(lèi)的種類(lèi)而異，每種魚(yú)類(lèi)精液都存在著最佳的冷卻速率，在最佳冷卻速率條件下會(huì)減少細(xì)胞損傷，提高精子的存活率。大體而言，目前常采用的下降速率為-10℃/min，到達(dá)低溫后（-76℃）可直接放入液氮中保存。

4.解凍復(fù)蘇

在需要使用魚(yú)類(lèi)精液時(shí)，須將精液解凍復(fù)蘇，該步驟是精子升溫溶解復(fù)蘇的過(guò)程。決定解凍復(fù)蘇效果的關(guān)鍵因素是解凍液和解凍速度。淡水魚(yú)類(lèi)精液解凍液常用0.65%氯化鈉溶液，海水魚(yú)類(lèi)凍精則可直接利用海水解凍復(fù)蘇。解凍速度與解凍液的初始溫度、解凍液在精液中所占比例、凍精的體積和水浴的溫度等有關(guān)系，所以解凍速度不能準(zhǔn)確測(cè)定和控制。一般情況下，若精液冷卻過(guò)程的速率較快，那么其復(fù)溫速率也相對(duì)較快。

5.活力檢測(cè)

精液解凍復(fù)蘇后應(yīng)立即對(duì)精子活力進(jìn)行檢測(cè)。在原地?cái)[動(dòng)或做微弱曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)的精子無(wú)受精能力，顯微鏡視野下做直線(xiàn)前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子所占的比例即為精子活力百分比。

四、小結(jié)與展望

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展、魚(yú)類(lèi)人工育苗和遺傳育種技術(shù)工作的不斷改善，魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)受到極大關(guān)注，精液保存技術(shù)的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，特別是在雜交育種、優(yōu)良品種的選育與種質(zhì)資源的保護(hù)等工作中，精液保存的魚(yú)類(lèi)種類(lèi)也越來(lái)越多。常見(jiàn)的淡水魚(yú)類(lèi)、海水魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)已較為成熟，對(duì)于一些瀕危和保護(hù)水生生物而言，精液保存技術(shù)的應(yīng)用具有十分重要的意義。魚(yú)類(lèi)精液保存方法由較簡(jiǎn)便的常溫保存、低溫冷藏保存向超低溫冷凍保存逐步深入，目前，魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)已日趨完善，但仍存在亟待解決的問(wèn)題，如冷藏保存和冷凍保存的優(yōu)化，精液保存后活率低、壽命短等問(wèn)題有待深入研究解決；針對(duì)不同魚(yú)種其特異性的稀釋液配方、抗凍劑選擇、降溫速率、保存方法和解凍條件摸索等問(wèn)題還需進(jìn)一步探究。

（通聯(lián)：611130，四川省成都市農(nóng)林科學(xué)院 成都市溫江區(qū)）