外源精子基因組整入雌核生殖銀鯽卵子創(chuàng)制異源八倍體的有效方法

外源精子基因組整入雌核生殖銀鯽卵子創(chuàng)制異源八倍體的有效方法

李 志 魯 蒙 周 莉 王忠衛(wèi) 李熙銀 汪 洋 張曉娟 桂建芳

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072;2. 中國科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院, 北京 100101; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

多倍化(Polyploidy)是指基因組中加入了一套或多套完整的基因組, 從而產(chǎn)生含有3套或3套以上完整染色體組的生物體即多倍體(Polyploid)的過程。同源或異源多倍體可通過發(fā)育早期有絲分裂受到抑制導(dǎo)致染色體組加倍, 減數(shù)分裂異常產(chǎn)生不減數(shù)配子、多精受精或雜交等產(chǎn)生[1—3]。盡管基因組加倍后可能對多倍體造成細(xì)胞核質(zhì)比例失衡、有絲分裂和減數(shù)分裂同源染色體配對紊亂、表觀遺傳不穩(wěn)定等不利影響, 但多倍體通常表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢、基因冗余和單性繁殖三個優(yōu)勢[1]。大量冗余的重復(fù)基因為基因功能的歧化提供了原始材料;“多倍化-二倍化”過程中發(fā)生了大量染色體重排、轉(zhuǎn)座子重激活、表觀遺傳重塑等其他非孟德爾的基因組變化[4—9], 使得多倍體產(chǎn)生新的性狀并驅(qū)動改變生態(tài)位和擴(kuò)大地理分布[1,10—12]。因此, 基因組多倍化是物種演化的主要驅(qū)動力之一[1,3,13—18]。

從理論上說, 由于基因組倍性的增加, 往往細(xì)胞尺寸會隨之增加, 多倍體常常表現(xiàn)出比二倍體近親生長更快, 營養(yǎng)器官或個體更大[19]等特點; 也常常表現(xiàn)出適應(yīng)性和抗病力強(qiáng)等優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀[2,3,20]。基于這一原因, 大量天然的多倍體魚類, 如鯉、銀鯽、鯽、鮭和鱘等, 已被選為重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對象[3]。銀鯽曾被視為鯽(Carassius auratusL.)的一個亞種(C. auratus gibelioBloch)[21], 但隨著對其核型、生殖方式、性別決定方式等研究的深入, 已被視為一個獨立的物種(C. gibelio), 并被證實經(jīng)歷了連續(xù)的額外兩輪多倍化, 因而被稱為六倍體[22—26]。銀鯽的卵子可以被異源的精子刺激激活胚胎發(fā)育, 采用單性雌核生殖的方式繁衍后代[3,20]。有趣的是, 當(dāng)進(jìn)行異精雌核生殖時, 銀鯽具有將其他魚類精子的染色體組、染色體片段并入到卵核中協(xié)同發(fā)育的能力[21,27—29]。這種獨特的能力可為異育銀鯽新品種選育創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)[30], 并有望從中選育出生長快、抗病力強(qiáng)的新品種。譬如, 異育銀鯽“中科5號”[20,31—33]和“長豐鯽”[34]的選育就是利用了這種能力。

通過異精雌核生殖自發(fā)形成異源八倍體子代的概率僅為0.2%—0.33%[29,35]。由于異源的精子進(jìn)入銀鯽卵質(zhì)后, 不解凝, 呈固縮狀態(tài)[36,37], 因此丁軍等[35]嘗試用胰蛋白酶處理紅鯉精子后再與銀鯽卵子受精, 根據(jù)其細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果推測胚胎中的異源八倍體率可提高到3.3%。盡管他們未能獲得異源八倍體幼魚, 但他們的嘗試為建立一個簡單易行的、可用于創(chuàng)制滲入有異源精子整套染色體組或部分染色體的銀鯽新種質(zhì)的方法提供了雛形。白鯽(C. cuvieri)具有食性廣、生長快、體型大、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)勢[38], 且與銀鯽具有相似的外形。因此,在本研究中, 我們摸索了胰蛋白酶消化濃度和時間等處理異源白鯽精子的條件, 通過分析對照組與不同處理組合中受精率、孵化率、成活率、畸形率、一月齡子代中八倍體率的差異, 以及精子活力和精子結(jié)構(gòu)的變化, 建立了一種將外源精子基因組整入雌核生殖銀鯽卵子創(chuàng)制異源八倍體的有效方法; 并運(yùn)用該方法批量處理并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)篩選6月齡子代, 獲得57尾融入有白鯽精子染色體組的異源八倍體。該方法的建立為后續(xù)培育生長快、抗病能力強(qiáng)的銀鯽新品種提供了技術(shù)支撐, 創(chuàng)制的異源八倍體可作為新品種培育的核心育種材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和溶液

異育銀鯽“中科3號”(A+系)來自中國科學(xué)院水生生物研究所官橋養(yǎng)殖基地(武漢), 白鯽取自廣西水產(chǎn)引育種中心(南寧)。在繁殖季節(jié), 選擇性成熟親魚, 注射鯉腦垂體(PG)、絨毛膜促性腺激素(HCG)和促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)的混合物人工催產(chǎn)獲得成熟的卵子和精子[39]。

1×精子保存液(8 g/L NaCl, 0.4 g/L KCl, 0.14 g/L CaCl2, 0.2 g/L MgSO4·7H2O, 0.06 g/L Na2HPO4·H2O,0.06 g/L KH2PO4, 0.35 g/L NaHCO3, 1 g/L葡萄糖),用滅菌H2O配置, pH調(diào)制6.9。

1.2 精液的胰蛋白酶溶液處理及人工受精

首先將0.25、0.5、1、2和4 g胰蛋白酶粉末分別加入到100 mL的1×精子保存液中, 新鮮配置成0.25%、0.5%、1%、2%和4%的胰蛋白酶溶液。對照為未加入胰蛋白酶的1×精子保存液。每次按1﹕10體積比將精液與不同濃度的胰蛋白酶溶液(實驗組)或1×精子保存液(對照組)混勻, 并在23℃靜置10min后, 分別與異育銀鯽A+系的成熟卵子進(jìn)行干法授精[39]。將受精卵分別鋪灑在裝有曝氣水的白瓷盤(每盤鋪灑約2000—4000個受精卵)中進(jìn)行孵化。每組實驗進(jìn)行三次重復(fù)。統(tǒng)計不同組合的受精率、畸形率、存活率以及八倍體率。

接著, 按1﹕10體積比將精液與1%的胰蛋白酶溶液(實驗組)或1×精子保存液(對照組)混勻, 23℃靜置處理5min、10min、15min、20min和25min后,采用相同方法進(jìn)行受精和孵化。

1.3 精子的活力檢測及掃描電鏡(Transmission electron microscope, TEM)觀察

精子的活力在HT CASAⅡAnimal系統(tǒng)中測定,統(tǒng)計精子被激活1min之內(nèi)的運(yùn)動參數(shù), 參照朱要軍等[40]描述方法進(jìn)行。在23℃, 水激活精子后, 每隔3s點擊軟件“俘獲”鍵, 持續(xù)捕捉精子運(yùn)動參數(shù), 每次樣品至少進(jìn)行7次平行測量。

精子形態(tài)觀察是在中國科學(xué)院水生生物研究所儀器平臺中心的HT7700透射電鏡(Hitachi High-Tech)上進(jìn)行, 樣品的制備方法參照朱要軍等[40]。

1.4 繁育親本及子代的倍性檢測和染色體核型分析

每個實驗組合隨機(jī)選取25—124尾一月齡幼魚(體長1.5 cm左右), 斷尾采約0.1 μL的新鮮血液放入200 μL 4℃預(yù)冷的CyStain DNA 1Step(德國Partec CyStain DNA 1Step)溶液并混勻后放置冰上, 等待上機(jī)檢測DNA含量(CytoFLEX流式細(xì)胞儀)。其中1%的胰蛋白酶溶液處理15min的子代, 養(yǎng)至六月齡時檢測倍性, 共檢測340尾個體的DNA含量。親本異育銀鯽A+系和白鯽作為對照。

采用PHA體內(nèi)誘導(dǎo)腎細(xì)胞制片技術(shù), 制備繁育親本及子代的中期分裂相, 具體方法參照[41, 42]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

受精率、孵化率、成活率、畸形率、八倍體率分別根據(jù)如下公式進(jìn)行統(tǒng)計[42,43]：

受精率(Fertilization rate,FR, %)=(受精卵數(shù)/總卵數(shù))×100%

孵化率(Hatching rate,HR, %)=(總出苗數(shù)/總卵數(shù))×100%

成活率(Survival rate,SR, %)=(開始攝食時正常魚苗數(shù)/總卵數(shù))×100%

畸形率(Deformity rate,DR, %)=(畸形魚苗數(shù)/總出苗數(shù))×100%

八倍體率(Octoploid rate,OR, %)=(八倍體魚苗數(shù)/所檢測的總魚苗數(shù))×100%

將上述數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析,獨立重復(fù)的實驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析, 數(shù)據(jù)間比較用Duncan法進(jìn)行。柱狀圖由GraphPad Prism 6軟件繪制,P＜0.05視為統(tǒng)計學(xué)顯著性差異,P＜0.01視為統(tǒng)計學(xué)極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度胰蛋白酶溶液處理白鯽精子對異育銀鯽子代八倍體率的影響

首先進(jìn)行胰蛋白酶濃度梯度分析以確定本實驗的最適處理濃度。我們選擇了0.25%、0.5%、1%、2%和4%共5種濃度的胰蛋白酶溶液, 同時處理白鯽精液10min后與異育銀鯽A+系的成熟卵子受精。與對照組相比, 胰蛋白溶液處理白鯽精子會導(dǎo)致受精率、孵化率和存活率均顯著下降(表1)。將每個組合孵化的正常魚苗養(yǎng)至1月齡, 隨機(jī)挑選個體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測定DNA含量。結(jié)果表明, 在對照組的25尾幼魚中, 未能檢測到八倍體個體, 均為六倍體個體(圖1A)。在0.25%胰蛋白酶溶液處理白鯽精子10min后的子代, 可以檢測到八倍體個體, 其DNA直方圖的峰值與六倍體個體峰值比例為4﹕3(圖1A-B)。隨著胰蛋白酶濃度的增加, 子代平均八倍體率從(3.8±0.6)%顯著上升到(18.5±1.4)%(表1)。2%和4%胰蛋白酶溶液處理的魚苗平均畸形率分別為(15.3±1.8)%和(33.2±8.8)%, 顯著高于其他3個濃度處理組合; 1%胰蛋白酶溶液處理的子代平均八倍體率可達(dá)(8.3±2.4)%, 顯著高于0.25%和0.5%處理組合, 而其平均畸形率與對照組和兩個低濃度組合無顯著差異。

表1 不同濃度胰蛋白酶溶液處理白鯽精子對異育銀鯽A+系受精卵孵化、仔魚成活以及子代八倍體率的影響Tab. 1 Effects of C. cuvieri sperm digested with trypsin solution at different concentrations on the hatching, survival and octoploid rates of allogynogenetic gibel carp clone A+

2.2 不同濃度胰蛋白酶溶液處理后白鯽精子的運(yùn)動活力和結(jié)構(gòu)變化

從不同運(yùn)動類型精子的比例、激活或前進(jìn)性精子運(yùn)動速度和方式以及鞭毛鞭打頻率四個方面對不同組合白鯽精子的活力進(jìn)行了比較。從精子運(yùn)動比例來看, 激活精子(MOT)和前進(jìn)性運(yùn)動精子(PRO)比例均隨著胰蛋白酶濃度的增加而下降, 而慢速運(yùn)動精子(SLO)比例呈現(xiàn)上升趨勢。與對照組相比, MOT下降幅度表現(xiàn)出顯著性差異的是4%的胰蛋白酶濃度處理, PRO下降幅度和SLO上升幅度表現(xiàn)出顯著性差異的是2%和4%的胰蛋白酶濃度處理(圖1C)。激活精子運(yùn)動速度檢測結(jié)果表明,2%和4%胰蛋白酶處理白鯽精子10min后, 激活精子的平均路徑速度(VAP)、直線運(yùn)動速度(VSL)和曲線運(yùn)動速度(VCL)均急劇下降。激活精子運(yùn)動方式的變化不明顯, 與對照組相比, 僅當(dāng)用4%胰蛋白酶處理時擺動性(WOB)呈現(xiàn)顯著性下降(圖1D)。不同濃度的胰蛋白酶溶液處理10min對白鯽前進(jìn)性精子的運(yùn)動速度、方式和鞭毛鞭打頻率影響較小, 僅當(dāng)用4%胰蛋白酶處理時, 前進(jìn)性精子的VSL和WOB顯著性下降(圖1E)。

我們也采用透射電鏡觀察了不同濃度胰蛋白酶溶液處理對白鯽精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的影響。精子頭部橫切面透射電鏡觀察(圖1F)結(jié)果表明, 未經(jīng)胰蛋白酶處理的白鯽精子頭部質(zhì)膜呈雙線形結(jié)構(gòu), 與核結(jié)合較緊密。當(dāng)用0.25%的胰蛋白酶溶液處理10min后,精子質(zhì)膜與核之間的空隙增多, 質(zhì)膜少數(shù)地方出現(xiàn)破損斷裂。隨著胰蛋白酶濃度的增加, 質(zhì)膜呈現(xiàn)明顯的波浪狀皺褶, 質(zhì)膜與核膜之間的空隙越來越大,質(zhì)膜被酶解破損程度加劇, 部分質(zhì)膜脫落。從1%的胰蛋白溶液處理組合開始, 可以觀察到核膜不完整,部分被酶解。因此, 綜合考慮子代八倍體率、畸形率、存活率以及精子活力和結(jié)構(gòu)等因素, 我們選定1%的胰蛋白酶濃度為有效處理濃度。

2.3 1%胰蛋白酶溶液處理白鯽精子不同時間后對異育銀鯽子代八倍體率的影響

圖1 不同濃度胰蛋白酶溶液處理對子代倍性(A-B)、精子運(yùn)動能力(C-E)和精子結(jié)構(gòu)(F)的影響Fig. 1 Effects of C. cuvieri sperm digested with trypsin solution at different concentrations on offspring ploidy (A-B), sperm motility (C-E)and structure (F)

表2 1%胰蛋白酶溶液處理白鯽精子不同時間對異育銀鯽A+系受精卵孵化、仔魚成活以及子代八倍體率的影響Tab. 2 Effects of C. cuvieri sperm digested with 1% trypsin solution at different times on the hatching, survival and octoploid rates of allogynogenetic gibel carp clone A+

用1%的胰蛋白酶溶液分別處理白鯽5min、10min、15min、20min和25min后, 分別與異育銀鯽A+系的成熟卵子受精(表2)。與對照組相比, 1%胰蛋白酶溶液處理5min后, 子代中的平均八倍體率為(4±0.0)% (圖2A-B), 但受精率、孵化率和存活率均顯著下降, 僅有10%左右。隨著處理時間的增加,如處理15min后, 子代中的平均八倍體率上升至(16.3±0.5)%, 而受精率、孵化率和存活率進(jìn)一步呈梯度下降。1%胰蛋白酶溶液處理25min后, 受精率、孵化率和存活率降到千分之幾, 同時畸形率顯著上升, 而子代八倍體率與處理15min組合沒有顯著差異。

2.4 1%的胰蛋白酶溶液處理不同時間后白鯽精子運(yùn)動活力和結(jié)構(gòu)變化

與對照組相比, 1%胰蛋白酶溶液處理不同時間, 對MOT、PRO和SLO的比例沒有顯著影響。僅當(dāng)處理25min時, SLO上升比例與對照組比有顯著差異(圖2C)。精子運(yùn)動速度檢測結(jié)果表明, 處理20min和25min后, 激活精子的VAP和VCL顯著下降(圖2D); 處理25min后, 精活精子的WOB、前進(jìn)性精子的VSL和VCL, 與對照組比顯著下降(圖2D-E)。

同樣, 我們采用透射電鏡觀察1%胰蛋白酶溶液處理白鯽精子不同時間后的結(jié)構(gòu)變化(圖2F)。與對照組相比, 處理5min后, 精子質(zhì)膜與核之間的空隙明顯增多增大; 處理10min后, 質(zhì)膜呈現(xiàn)明顯的波浪狀皺褶, 核膜的少數(shù)部分出現(xiàn)酶解損壞; 處理15min后, 質(zhì)膜與核膜之間的空隙進(jìn)一步加大, 質(zhì)膜開始酶解脫落。處理20min和25min后的精子頭部結(jié)構(gòu)與處理15min的沒有明顯差異。

圖2 1%胰蛋白酶濃度處理不同時間對子代倍性(A-B)、精子運(yùn)動能力(C-E)和結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effects of C. cuvieri sperm digested with 1% trypsin solution at different times on offspring ploidy (A-B), sperm motility (C-E) and structure (F)

2.5 銀鯽新八倍體的創(chuàng)制及其DNA含量和染色體核型分析

綜合考慮子代八倍體率、畸形率、存活率以及精子的運(yùn)動活力等因素, 我們選定1%的胰蛋白酶濃度處理15min作為有效處理條件, 大規(guī)模創(chuàng)制合成銀鯽新多倍體。將獲得的正常魚苗養(yǎng)至6月齡時, 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測DNA含量篩選銀鯽新多倍體。在分析的340尾個體中, 共有57尾個體被鑒定為八倍體, 體型與母本異育銀鯽A+系雖相似, 但略有差異(圖3A); 其DNA直方圖的峰值與母本、父本的比值分別為4﹕3﹕2 (圖3B); 腎細(xì)胞有絲分裂中期染色體計數(shù)分析表明, 八倍體個體的染色體數(shù)目為209±6, 母本異育銀鯽A+系的染色體數(shù)為159±6,父本白鯽的染色體數(shù)為100(圖3C)。上述的結(jié)果表明, 創(chuàng)制的銀鯽異源八倍體是A+系卵子融入了一套白鯽精子染色體組發(fā)育而來。

圖3 銀鯽異源八倍體與親本的形態(tài)(A)、DNA含量(B)和染色體數(shù)量(C)差異Fig. 3 Differences of morphology (A), DNA content (B) and chromosome number (C) among gibel carp allo-octoploid and its parents

3 討論

作為一種經(jīng)典、且卓有成效的細(xì)胞工程育種技術(shù), 多倍體育種(Polyploid breeding)已廣泛地運(yùn)用于動植物育種中, 包括在養(yǎng)殖魚類和貝類的品種選育中[2,3,20,44,45]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中, 成功的范例有三倍體太平洋牡蠣[46,47]以及從鯉科和鮭科等天然多倍體魚類中合成的同源或異源多倍體[3,43]。因此, 依據(jù)物種特性, 優(yōu)化或發(fā)展新的、高效的倍性操作技術(shù), 一直是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物遺傳育種的重要方向之一。

異育銀鯽是我國重要的大宗淡水養(yǎng)殖魚類之一[20], 是由銀鯽培育出來的系列品系的統(tǒng)稱。銀鯽雌核生殖和異精效應(yīng)[48], 有性生殖和雄性個體在種群作用[21]等的揭示, 為異育銀鯽新品種的培育開創(chuàng)了一條獨特的育種技術(shù)路線。在過去的四十多年里, 異育銀鯽[49]、高體型異育銀鯽[20]、異育銀鯽“中科3號”[50]、“長豐鯽”[34]和異育銀鯽“中科5號”[31—33]等系列新品種陸續(xù)被選育出來, 并帶動我國鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展[3,20,21]。其中, 異育銀鯽“中科5號”是從滲入有團(tuán)頭魴精子微小染色體片段、性狀發(fā)生明顯改變的育種核心群體, 經(jīng)連續(xù)十代雌核生殖選育而來[20,31—33]; “長豐鯽”是D系銀鯽卵子融入了一套興國紅鯉精子的染色體組發(fā)育而來[34], 且遺傳和表觀遺傳穩(wěn)定, 仍保持著雌核生殖的能力[4]; 在A+系銀鯽用興國紅鯉精子刺激發(fā)育的子代中也發(fā)現(xiàn)了類似的異源八倍體個體[41]。在本研究中, 我們通過設(shè)置不同的胰蛋白酶消化異源精子的濃度梯度和時間梯度, 優(yōu)化并建立了一種將外源精子基因組整入雌核生殖銀鯽卵子創(chuàng)制異源八倍體的有效方法。

用計算機(jī)輔助精子自動分析(Computer-aided sperm analysis, CASA)[50]已廣泛運(yùn)用于魚類精子的活力檢測中[40,51—53]。在硬骨魚類中, 如非洲鯰、鯉、金魚等精子運(yùn)動參數(shù)與受精率的關(guān)聯(lián)分析表明, 前進(jìn)性運(yùn)動精子的VCL和VSL是最能反映精子活力的參數(shù), 在一定范圍內(nèi)與精子受精率呈正相關(guān)[54—58]。在本研究中, 用低濃度胰蛋白酶溶液處理白鯽精子, 或者高濃度胰蛋白酶溶液處理較短時間,對精子的運(yùn)動能力沒有影響。在光學(xué)顯微鏡下對不同組合精子運(yùn)動能力的觀察結(jié)果(未顯示)與CASA一致。但0.25%的胰蛋白酶溶液處理白鯽精子10min以及1%胰蛋白酶溶液處理白鯽精子5min后, 均導(dǎo)致受精率顯著下降至10%—20%左右(表1和表2)。因此, 異育銀鯽受精率顯著下降與白鯽精子的運(yùn)動能力之間沒有明顯關(guān)聯(lián)。正常受精時, 硬骨魚類的精子穿過精孔管, 精子質(zhì)膜與卵子質(zhì)膜發(fā)生相互識別和融合, 精核入卵, 隨后發(fā)生精核核膜崩解等一系列復(fù)雜的生理變化?？紤]到精子質(zhì)膜的完整性與其受精能力呈高度正相關(guān)[59], 我們也采用透射電鏡觀察了白鯽精子結(jié)構(gòu)在胰蛋白酶溶液處理后的變化。胰蛋白酶消化處理白鯽精子, 必然導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)受損。0.25%的胰蛋白酶溶液處理白鯽精子10min以及1%胰蛋白酶溶液處理白鯽精子5min后, 均觀察到精子質(zhì)膜與核之間的空隙明顯增多增大; 隨著胰蛋白酶濃度的增加, 質(zhì)膜被酶解破損程度加劇, 部分質(zhì)膜脫落(圖1F和圖2F)。上述的結(jié)果表明, 精子質(zhì)膜上與精卵識別相關(guān)的蛋白, 以及其他質(zhì)膜結(jié)構(gòu)受損應(yīng)該是異育銀鯽受精率顯著下降的主要原因。

細(xì)胞學(xué)觀察表明, 進(jìn)入銀鯽受精卵的異源精核不解凝, 高度固縮, 不與雌性原核融合, 為典型的雌核生殖生殖方式; 而進(jìn)入銀鯽受精卵的同源精核可部分解凝[49]。兩性生殖物種非細(xì)胞體系中的研究表明, 脫膜精核在卵質(zhì)提取物中的解凝不具有物種特異性[60—62]。譬如, 我們不僅可以觀察到銀鯽脫膜精核在銀鯽卵質(zhì)提取物, 興國紅鯉脫膜精核在興國紅鯉提取物中解凝, 也可觀察到銀鯽脫膜精核在興國紅鯉卵質(zhì)提取物中發(fā)生疏松、解凝等形態(tài)變化。但將興國紅鯉脫膜精核在銀鯽卵質(zhì)提取物中進(jìn)行溫育, 未能觀察到精核的解凝[63]。這些在體和離體的觀察均表明, 銀鯽的卵質(zhì)中可能存在著抑制異源精核解凝的調(diào)控因子; 同時異源和同源精核在銀鯽卵質(zhì)中所呈現(xiàn)的截然不同的發(fā)育行為也暗示精核解凝與精子的成分相關(guān)。如果保持核膜的完整性, 無論是銀鯽還是紅鯉精核, 在銀鯽或紅鯉卵質(zhì)提取物中均不能解凝[63], 暗示精子核膜的崩解是非細(xì)胞體系精核解凝的前提條件。我們的結(jié)果表明, 1%濃度以上的胰蛋白溶液處理白鯽精子10min以上, 可以觀察到核膜不完整, 部分被酶解(圖1F和圖2F)。因此, 我們猜測核膜的部分消解可能會導(dǎo)致精核的遺傳物質(zhì)滲入受精卵卵質(zhì)中, 從而大幅提高了子代中的八倍體率。因此, 綜合考慮子代八倍體率、畸形率、存活率, 以及CASA分析精子活力和透射電鏡觀察精子結(jié)構(gòu)變化結(jié)果, 我們選擇1%的胰蛋白酶濃度處理15min作為有效處理條件, 大規(guī)模創(chuàng)制合成銀鯽新多倍體。

總之, 本研究建立了一種將外源精子基因組整入雌核生殖銀鯽卵子創(chuàng)制異源八倍體的有效方法,兼顧受精率、孵化率、成活率等繁育指標(biāo)與較高的子代八倍體率, 以期在異育銀鯽育種實踐中獲得較多子代同時減少篩選工作量。在本研究中篩選獲得的57尾融入有白鯽精子染色體組的異源八倍體成魚, 可作為后續(xù)培育生長快、抗病能力強(qiáng)的銀鯽新品種的核心育種材料。