魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展

魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展

董安然 成智麗 張彤 王宏宇 柏彬彬

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院；遼寧省水生生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023)

魚(yú)類(lèi)是人類(lèi)重要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一，且具有懷卵量大、體外發(fā)育，易于觀察等特點(diǎn)。因此，魚(yú)類(lèi)不但是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物也是研究中常用的模式動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因技術(shù)有效打破了動(dòng)物細(xì)胞接納外源基因的進(jìn)化壁壘，能將人為篩選改造過(guò)的基因遺傳給下一代。相比于傳統(tǒng)育種，為培育和改良優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的魚(yú)類(lèi)新品系提供了更高效的途徑。1985年，朱作言等研制出世界首例轉(zhuǎn)基因魚(yú)并建立了第一個(gè)轉(zhuǎn)基因魚(yú)模型，隨后英國(guó)、法國(guó)、美國(guó)等幾十個(gè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始了轉(zhuǎn)基因魚(yú)的研究[1]。近幾年，美國(guó)批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因大西洋鮭(Salmosalar)上市，成為全球第一例準(zhǔn)入市場(chǎng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品[2]。極大促進(jìn)了培育安全可靠轉(zhuǎn)基因魚(yú)新品種的步伐。

1 魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要原理及方法

1.1 魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要原理

魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，人工操作把外源目的基因?qū)胄约?xì)胞系，使外源目的基因整合到動(dòng)物本身的基因組中，從而外源目的基因隨胚胎發(fā)育賦予受體動(dòng)物新的生物學(xué)性狀并穩(wěn)定遺傳給后代。如果外源目的基因整合到動(dòng)物的部分細(xì)胞的基因組中,叫作嵌合體動(dòng)物；而動(dòng)物所有的細(xì)胞均整合外源目的基因,并具有將外源基因遺傳給下一代的能力,叫作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？梢哉f(shuō)，魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的綜合應(yīng)用[3]。

不論是原核顯微注射法等物理手段，或者DEAE-葡聚糖法等化學(xué)手段，還是逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的生物手段，其目的是將外源目的基因?qū)胄约?xì)胞系，重點(diǎn)在于外源目的基因的整合與表達(dá)效率。通過(guò)對(duì)生物基因與表現(xiàn)型進(jìn)行分析,從而了解外源目的基因的功能。

1.2 修飾外源目的基因常用方法

1.2.1 鋅指核酸酶技術(shù)

ZFN ( zinc finger endonuclease )，鋅指核酸酶是第一代人工核酸內(nèi)切酶。鋅指核酸酶包括DNA切割結(jié)構(gòu)域FokI和鋅指結(jié)構(gòu)的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域兩部分。FokI內(nèi)切酶只有形成二聚體才有活性，DNA識(shí)別域包含3個(gè)或更多的Cys2-His2鋅指蛋白。這些鋅指蛋白每個(gè)可與3個(gè)連續(xù)的堿基對(duì)相互作用。ZFN技術(shù)開(kāi)啟了基因組靶向修飾技術(shù)的大門(mén)，與同源重組相比大大提高了基因編輯效率，其缺點(diǎn)在于細(xì)胞毒性和脫靶現(xiàn)象，且成本相對(duì)昂貴，所以被TALEN取代。

1.2.2 類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)

TALEN( transcription activator-like effector nuclease)，類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶是第二代人工核酸內(nèi)切酶，包括人工改造的核酸內(nèi)切酶切割域FokI以及DNA識(shí)別域。DNA的識(shí)別區(qū)域包含許多重復(fù)保守的氨基酸序列模塊組，其中每34個(gè)氨基酸組成一個(gè)模塊，第12位、第13位氨基酸種類(lèi)可變，決定了模塊識(shí)別靶向點(diǎn)的特異性。TALEN與ZFN相似的是都是由一個(gè)結(jié)合域、DNA序列識(shí)別區(qū)以及一個(gè)DNA切割域構(gòu)成的，不同的是TALEN的兩個(gè)單體尾對(duì)尾對(duì)靶DNA進(jìn)行特異性識(shí)別、結(jié)合，具有切割活性的非特異性二聚體FokI實(shí)現(xiàn)識(shí)別和切割。相比于ZFN，TALEN具有使基因操作簡(jiǎn)便、低毒性、低脫靶率等優(yōu)點(diǎn)。但制約TALEN應(yīng)用推廣的因素在于其模塊組裝費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

1.2.3 CRISPR/CAS核酸酶技術(shù)

CRISPR/CAS 9系統(tǒng)，成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)蛋白是第三代人工內(nèi)切酶技術(shù)，CRISPR系統(tǒng)有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三種類(lèi)型，CRISPR/CAS 9是由結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的Ⅱ型系統(tǒng)為基礎(chǔ)衍生而來(lái)。其原理簡(jiǎn)述為crRNA-tracrRNA形成RNA雙鏈導(dǎo)向RNA分子(sgRNA)，sgRNA與CAS 9蛋白結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶DNA的編輯。其較前兩代的優(yōu)勢(shì)在于成本低、制作簡(jiǎn)單、效率高、適用性廣。

基因編輯技術(shù)在轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)的研究中，主要應(yīng)用在基因敲除、基因定點(diǎn)整合和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控三方面。對(duì)于培育新品系，實(shí)現(xiàn)多基因調(diào)控性狀的改良，基因編輯技術(shù)具有廣闊的前景和重要意義。近年來(lái)，利用基因編輯技術(shù)在斑馬魚(yú)的研究中，進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。日本學(xué)者(2014年)運(yùn)用CRISPR/CAS 9技術(shù)，對(duì)evx2 基因位點(diǎn)和eng1b 基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾，用顯微注射法注射到斑馬魚(yú)性細(xì)胞系中，成功將外源目的基因整合并表達(dá)；劉斐斐(2017年)等利用CRISPR/CAS 9技術(shù)有效將外源目的基因整合到斑馬魚(yú)基因組的特定位置，通過(guò)顯微注射法將eGFP熒光蛋白導(dǎo)入斑馬魚(yú)性細(xì)胞系中，獲得了51.72%的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。

1.3 魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的常用方法

1.3.1 顯微注射法

顯微注射法是借助顯微鏡的放大技術(shù)，直接將外源目的基因注射到魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞、受精卵、早期胚胎、胚胎干細(xì)胞活體細(xì)胞中，然后生產(chǎn)個(gè)體的方法。此方法是制備轉(zhuǎn)基因生物最簡(jiǎn)單可靠的方法，其應(yīng)用范圍廣，轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百kb，即盡量在合子(受精卵)形成早期導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的DNA，當(dāng)精子和卵細(xì)胞結(jié)合，DNA就被直接注射入細(xì)胞中，不需要載體。因此，不存在擾亂該過(guò)程的外源基因序列。其缺點(diǎn)在于導(dǎo)入的基因隨機(jī)整合在染色體DNA上，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組的重排、易位、缺失或點(diǎn)突變。顯微注射法應(yīng)用依賴(lài)于魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)，至今報(bào)道的卵母細(xì)胞能在體外條件下完全成熟的只有金魚(yú)、斑馬魚(yú)和青鳉3種[3]。在斑馬魚(yú)、大西洋鮭魚(yú)、鯉魚(yú)、美國(guó)鲇魚(yú)、泥鰍魚(yú)、鯽魚(yú)等轉(zhuǎn)基因研究中廣泛采用此方法。1986年，Ozato等用顯微注射法將外源目的基因SV40PcCr導(dǎo)入青鳉魚(yú)體內(nèi)成功獲得了轉(zhuǎn)基因魚(yú)[4]。

1.3.2 電穿孔法

電穿孔法是利用脈沖電場(chǎng)提高細(xì)胞膜的通透性，在細(xì)胞膜上形成納米大小微孔，使外源目的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。此方法可大批處理受精卵且操作簡(jiǎn)便，但外源基因?qū)腚S機(jī)且轉(zhuǎn)移頻率相對(duì)較低[3]。1992年，Buono等用此技術(shù)成功使乙酰轉(zhuǎn)移酶基因在斑馬魚(yú)體內(nèi)表達(dá)[5]。

1.3.3 精子載體介導(dǎo)法

該方法是將精子作為外源目的基因運(yùn)載工具，用人工授精的方法導(dǎo)入卵內(nèi)的技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性極高，且省略了顯微注射等方法的復(fù)雜過(guò)程和設(shè)備；缺點(diǎn)在于難以高效地將外源目的基因?qū)刖蛹?xì)胞中。目前，根據(jù)外源目的基因的導(dǎo)入形式等，又可分為直接混合法、電穿孔精子載體法、脂質(zhì)體法三種。1989年，沈孝宙用鯉精子作為運(yùn)載工具，成功獲得超過(guò)50%明顯表達(dá)生長(zhǎng)素的轉(zhuǎn)基因魚(yú)[6]。

1.3.4 基因槍法(微彈轟入法)

基因槍法是用吸附DNA的鎢微粒子高速轟擊受體細(xì)胞，從而達(dá)到轉(zhuǎn)移外源目的基因的目的。此方法在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域應(yīng)用較多。其優(yōu)點(diǎn)在于可在短期內(nèi)處理多個(gè)細(xì)胞。但由于其穩(wěn)定性和表達(dá)的問(wèn)題，以及魚(yú)類(lèi)的卵核小而卵黃大的特點(diǎn)，導(dǎo)致該方法應(yīng)用較少[3]。1990年，Zelenin等用基因槍法將含有半乳糖酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的目的基因序列成功轉(zhuǎn)移到虹鱒、歐洲泥鰍和斑馬魚(yú)的胚胎中[7]。

此外，動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)還有染色體片段微注入法、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、磷酸鈣共沉淀法、激光處理法、DEAE-葡聚糖法等。但在魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因研究中，還沒(méi)有較為成功的報(bào)道。

2 魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究方向

2.1 抗病育種

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中，抗病育種一直作為一個(gè)研究熱點(diǎn)，在魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因的研究中對(duì)比畜牧轉(zhuǎn)基因抗病育種工作，開(kāi)展的工作相對(duì)晚一些。2004年，Mao等使用電穿孔法將hLF基因的cDNA轉(zhuǎn)入草魚(yú)的性細(xì)胞系中，獲得了超過(guò)55%的對(duì)嗜水氣單胞菌抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因草魚(yú)；2005年，EL-Zaeem and Assem將鯊魚(yú)的DNA注射到了羅非魚(yú)性細(xì)胞系中，獲得了具有抗體活性高、免疫球蛋白大量提高的轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)。

2.2 性狀改良

魚(yú)類(lèi)的品種改良涉及到魚(yú)的生長(zhǎng)速度、適應(yīng)性、營(yíng)養(yǎng)組成和抗逆性等。對(duì)比傳統(tǒng)育種通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)魚(yú)類(lèi)進(jìn)行品種改良可以極大縮短改良進(jìn)程。在最早的轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)的研究中，首先是導(dǎo)入生長(zhǎng)激素基因(GH)加快生長(zhǎng)速度，提高經(jīng)濟(jì)效益。2000年，Martinez等成功從鮭魚(yú)提取生長(zhǎng)激素，導(dǎo)入了羅非魚(yú)性細(xì)胞系中，在CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，成功培育出食物轉(zhuǎn)化率顯著提高2.9倍的轉(zhuǎn)基因魚(yú)。在品種改良中，抗凍蛋白的轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)培育也是轉(zhuǎn)基因的熱點(diǎn)，但此前的轉(zhuǎn)抗凍蛋白基因魚(yú)類(lèi)都未達(dá)到預(yù)期效果。2005年，Dunham等將轉(zhuǎn)抗凍蛋白的斑點(diǎn)叉尾鮰置入土池，存活率對(duì)比非轉(zhuǎn)基因斑點(diǎn)叉尾鮰約提高40%。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)魚(yú)類(lèi)進(jìn)行品種改良育種，將是未來(lái)的重要研究方向。

2.3 模式生物

魚(yú)類(lèi)具有個(gè)體適中，世代周期短、胚胎透明、體外發(fā)育等特點(diǎn)，斑馬魚(yú)是魚(yú)類(lèi)中較有代表性的種類(lèi)。因此，轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)作為模式生物對(duì)于基因的表達(dá)調(diào)控、形態(tài)發(fā)生發(fā)育、環(huán)境監(jiān)測(cè)藥物篩選等領(lǐng)域具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。2009年，夏銘等成功用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)構(gòu)建了胰島素β-細(xì)胞發(fā)育模型；2013年，蒲韻竹等用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)建立了阿爾茨海默病動(dòng)物模型[10]。隨著多種魚(yú)類(lèi)基因組測(cè)序工作的完成，我們看到了魚(yú)類(lèi)作為模式生物的廣闊前景，為人類(lèi)在疾病治療、疾病機(jī)理、藥物研發(fā)等領(lǐng)域提供了更多科學(xué)依據(jù)。

3 魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)

3.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與多種生物技術(shù)結(jié)合發(fā)展

近幾年，轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)的研究主要集中在提高生長(zhǎng)速度、抗逆抗病育種等與經(jīng)濟(jì)效益有關(guān)的研究工作，但隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的不斷突破，魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因研究將越來(lái)越呈現(xiàn)多學(xué)科交叉的特點(diǎn)。最近，我國(guó)我國(guó)完成了大量魚(yú)類(lèi)的基因組測(cè)序和功能基因注釋工作，包括鯉魚(yú)、草魚(yú)、大黃魚(yú)等，將已知魚(yú)類(lèi)的優(yōu)良性狀通過(guò)轉(zhuǎn)基因平臺(tái)，可以廣泛的開(kāi)展轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)的育種工作?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展不僅顯著提高了轉(zhuǎn)基因效率，還在外源目的基因的定點(diǎn)整合中，對(duì)轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)的研究起到了不可替代的作用。未來(lái)的魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因，將會(huì)越來(lái)越依靠分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科等學(xué)科的理論技術(shù)突破，完成自身的創(chuàng)新發(fā)展。

3.2 重要功能基因來(lái)源多樣化

隨著基因組、蛋白組等“組學(xué)”的發(fā)展，以及基因組測(cè)序、高通量基因篩選、基因組關(guān)聯(lián)分析等技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，外源目的基因的來(lái)源呈現(xiàn)多樣化趨勢(shì)，可以從微生物、動(dòng)物、植物等挖掘出抗旱、抗寒、抗蟲(chóng)、營(yíng)養(yǎng)改良等功能豐富的基因。魚(yú)類(lèi)作為脊椎動(dòng)物門(mén)中占半數(shù)以上的種類(lèi)，其繁殖周期和繁殖數(shù)量的優(yōu)勢(shì)明顯，將會(huì)成為功能基因的“重要產(chǎn)地”和性狀輸出生物，為轉(zhuǎn)基因育種研究注入新的動(dòng)力。

3.3 多基因復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因魚(yú)的研發(fā)

轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)在研發(fā)初期主要集中在單一功能的外源目的基因上。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，多基因復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將成為研發(fā)重點(diǎn)。多基因不僅能夠使性狀協(xié)同表達(dá)，還會(huì)大大提高基因轉(zhuǎn)化率。未來(lái)轉(zhuǎn)基因魚(yú)將具有肉質(zhì)好、生長(zhǎng)快、耐低溫低氧等許多復(fù)合優(yōu)良性狀。

3.4 轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)作為生物反應(yīng)器的研發(fā)

生物反應(yīng)器是指通過(guò)轉(zhuǎn)基因生物對(duì)外源目的基因的高效率表達(dá)，進(jìn)而工業(yè)化生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)的技術(shù)?，F(xiàn)在，世界許多公司利用轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白，例如β-乳球蛋白、hFVIII和紅細(xì)胞生成素等。但以轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)作為生物反應(yīng)器的研究還相對(duì)滯后，魚(yú)類(lèi)作為高產(chǎn)量、低成本的生物反應(yīng)器優(yōu)勢(shì)明顯。隨著魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟，魚(yú)類(lèi)作為生物反應(yīng)器必將迎來(lái)屬于自己的時(shí)代。