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斑馬魚和青鳉：現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的新模式生物
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雖然斑馬魚和青鳉是原始脊椎動(dòng)物，但已經(jīng)超過了其他的動(dòng)物，成為最常用的模式生物。斑馬魚胚胎的基因表達(dá)模式、調(diào)控順式元件識(shí)別和基因功能的研究可以通過一些技術(shù)來促進(jìn)斑馬魚胚胎的發(fā)育，包括轉(zhuǎn)基因，體內(nèi)的瞬態(tài)試驗(yàn)，通過注射mRNA基因的過度表達(dá)，通過嗎啉代寡核苷酸注射敲除，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變敲除和編輯基因。此外，具有組織特異性報(bào)告的轉(zhuǎn)基因魚的轉(zhuǎn)基因株系已成為生物科學(xué)研究的有力工具，因?yàn)樵谕该髋咛ブ锌梢暬囟ɑ虻膭?dòng)態(tài)表達(dá)是可能的。特別是，一些轉(zhuǎn)基因魚系和突變體顯示出與人類疾病相似的缺陷表型。因此，種類繁多的魚類模型不僅揭示了體內(nèi)疾病發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制，而且為高通量篩選候選藥物提供了一個(gè)生存平臺(tái)。有趣的是，轉(zhuǎn)基因魚也可以作為生物傳感器來檢測(cè)環(huán)境污染物，甚至作為寵物魚展示美麗的熒光顏色。因此，轉(zhuǎn)基因模型魚具有廣譜的現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。
背景：雖然斑馬魚和青鳉是原始的脊椎動(dòng)物，他們比其它動(dòng)物模型有如下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如：光可以控制自己的排卵。產(chǎn)卵頻繁，產(chǎn)卵季節(jié)沒有限制。微量受精卵易于獲取且相對(duì)便宜。它們的胚胎是透明的，可以方便地監(jiān)測(cè)體內(nèi)各種組織和器官中的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)，而不需要犧牲實(shí)驗(yàn)對(duì)象。它們的基因組大小大約是哺乳動(dòng)物基因組的20到40%，使它們成為唯一用于大規(guī)模突變的脊椎動(dòng)物。他們的成熟時(shí)間只需要2?~?3個(gè)月，比較省力省時(shí)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因株系。此外，許多常規(guī)的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)技術(shù)，包括敲入和敲除，在模型魚中得到了很好的發(fā)展。
遺傳能力：一旦外源基因成功地轉(zhuǎn)移到胚胎中，然后將穩(wěn)定的種系傳遞到f1代，就可以建立F0轉(zhuǎn)基因系。一般來說，大約10 - 20%的處理過的胚胎有機(jī)會(huì)實(shí)現(xiàn)種系傳遞。已有報(bào)道表明，外源基因伴隨著腺相關(guān)病毒的反向末端重復(fù)序列，可以提高轉(zhuǎn)基因魚類的普遍表達(dá)和轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定傳遞。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以通過使用來自青鳉Tol2轉(zhuǎn)位子。一項(xiàng)尖端技術(shù)已將魚類基因轉(zhuǎn)移研究推向了新的視野，如敲除斑馬魚的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶系統(tǒng)和集群定期間隔短回文重復(fù)CRISPR相關(guān)結(jié)合蛋白9 。
轉(zhuǎn)基因熒光魚：熒光蛋白基因（FPG）作為報(bào)告基因用于熒光顯微鏡下直接觀察體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。許多轉(zhuǎn)基因模型魚含有各種組織特意性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白基因，包括紅系特異的轉(zhuǎn)錄因子GATA基因啟動(dòng)子、α肌肉特異性肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、視紫紅質(zhì)特異性啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異ISL-1啟動(dòng)子、胰腺PDX-1和胰島素啟動(dòng)子、心肌特異性cmlc2啟動(dòng)子、肝臟特異型L-FABP啟動(dòng)子、骨特異性COL10A1啟動(dòng)子，巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子和MFAP4，生殖細(xì)胞特異啟動(dòng)子基因。
生物醫(yī)學(xué)研究的新材料：（a）發(fā)育生物學(xué) 心臟發(fā)育：斑馬魚研究心臟發(fā)育的原因如下：（一）在受精后48個(gè)小時(shí)（HPF）斑馬魚有原始的心臟形態(tài)。（b）在具有FP標(biāo)記心臟的轉(zhuǎn)基因株系中很容易觀察到心臟發(fā)育。（c）有缺陷的心血管系統(tǒng)的斑馬魚胚胎仍能通過從水中獲得擴(kuò)散的氧氣而繼續(xù)生長。（d）通過簡單的單倍體突變方法可以促進(jìn)心臟發(fā)育相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)。例如，利用斑馬魚jekyll突變制備缺陷的心臟瓣膜，Stainier等人發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎發(fā)育正常心臟瓣膜需要UDP-葡萄糖脫氫酶。Tsai的實(shí)驗(yàn)室是第一個(gè)產(chǎn)生具有綠色熒光標(biāo)記心臟的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的實(shí)驗(yàn)室。已經(jīng)開發(fā)出心臟發(fā)展的4D動(dòng)態(tài)圖像。tbx1對(duì)第二心臟區(qū)的增殖起到促進(jìn)作用，根據(jù)該轉(zhuǎn)基因株系采集的心臟祖細(xì)胞，可以分析心臟特異基因的表達(dá)模式。對(duì)不同發(fā)育階段的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析。此外，這一轉(zhuǎn)基因魚是一個(gè)潛在的平臺(tái)，用于檢測(cè)影響心臟發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)、藥物和環(huán)境污染物，詳情見下文。
肌肉發(fā)育：在動(dòng)物胚胎中對(duì)注射的DNA片段進(jìn)行體內(nèi)瞬態(tài)檢測(cè)是分析調(diào)控順式元件功能的一種簡單而有效的方法。例如，Myf5，一個(gè)成肌調(diào)節(jié)因子（MRF），在規(guī)范肌肉的原始細(xì)胞分化過程中扮演著重要的角色。Myf5表達(dá)體節(jié)特異性和階段依賴性，它的激活和抑制都是精心策劃的。采用體內(nèi)瞬態(tài)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的順式作用元件位于-82/62對(duì)Myf5體節(jié)特異表達(dá)是必不可少的。除了調(diào)節(jié)體節(jié)，Myf5也參與顱面肌發(fā)育。Myf5在肌肉和軟骨發(fā)育的功能是獨(dú)立的。因此，三個(gè)可能的途徑，可以和Myf5和Myod之間的分子調(diào)控有關(guān)：（1）Myf5獨(dú)自能夠啟動(dòng)肌肉基因。（2）MyoD啟動(dòng)肌肉原基（3）MyoD單獨(dú)，但不是Myf5，調(diào)節(jié)肌肉原基的發(fā)育。此外，該six1a基因被發(fā)現(xiàn)在Myf5和Myod之間的相互作用中發(fā)揮重要作用。
眼神經(jīng)發(fā)育：鯉魚視紫紅質(zhì)基因的視網(wǎng)膜特異表達(dá)受兩個(gè)上游調(diào)控的DNA順式元件控制。一個(gè)是位于?63?75，這是鯉魚神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈反應(yīng)元件；其他位于?46?52，這是一個(gè)鯉魚青視網(wǎng)膜特定元素至關(guān)重要的報(bào)告基因的表達(dá)。有趣的是，直接激活的早期生長反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因可導(dǎo)致視網(wǎng)膜和晶狀體的分化不完全，導(dǎo)致小眼球。眼發(fā)展的另一個(gè)重要的因素是ADP-核糖基化因子6相互作用蛋白1（arl6ip1）。arl6ip1功能的喪失導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)元缺失，無序的視網(wǎng)膜層和較小的視杯。在失去arl6ip1，視網(wǎng)膜祖細(xì)胞持續(xù)表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1，提示眼祖細(xì)胞保持在早期祖細(xì)胞階段，而不能退出細(xì)胞周期分化。Tu等人發(fā)現(xiàn)arl6ip1突變導(dǎo)致異常的神經(jīng)嵴衍生組織以及神經(jīng)嵴說明符基因表達(dá)降低，如FOXD3，snail1b和SOX10，表明arl6ip1參與規(guī)范，但不誘導(dǎo)，神經(jīng)嵴細(xì)胞。
造血：雖然斑馬魚的主要造血部位不同于哺乳動(dòng)物，但斑馬魚和哺乳動(dòng)物都有共同造血系統(tǒng)產(chǎn)生的所有主要血細(xì)胞類型。此外，許多涉及造血的基因和信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物和斑馬魚中是保守的。例如，SCL是早期造血細(xì)胞中表達(dá)的第一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之一，在進(jìn)化上是保守的。斑馬魚的基因篩選產(chǎn)生了許多與血液相關(guān)的突變體，有助于研究人員了解造血基因及其功能。
斑馬魚作為人類疾病的動(dòng)物模型 心血管疾病：模式魚是研究人類疾病的優(yōu)秀材料，因?yàn)橐恍┩蛔凅w表現(xiàn)出與人類疾病相似的表型。此外，控制組織或器官發(fā)育的基本基因及其調(diào)控是高度保守的。例如，TBX5是一個(gè)T-box轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)細(xì)胞類型的規(guī)范和形態(tài)。TBX5突變表型與斑馬魚和哺乳動(dòng)物之間是高度相似。因此，具有心臟特異性熒光的轉(zhuǎn)基因魚可以為心血管疾病藥物提供高通量篩選平臺(tái)。例如，Tsai實(shí)驗(yàn)室建立了一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，可以誘導(dǎo)心肌肌鈣蛋白C在胚胎、幼蟲或成魚等發(fā)育階段的表達(dá)水平下降。肌鈣蛋白c的減少導(dǎo)致了擴(kuò)張型心肌病的模仿和人類的不完全性房室阻塞性疾病。因此，該轉(zhuǎn)基因株系有望為藥物篩選和闡明心血管疾病的分子機(jī)制做出重大貢獻(xiàn)。其次，研究了藥物對(duì)胚胎發(fā)育的影響。胺碘酮，這是III類抗心律失常藥物被用于治療快速性心律失常的人。然而，胺碘酮治療斑馬魚胚胎被發(fā)現(xiàn)在心臟中表現(xiàn)出血液回流。后來的研究表明胺碘酮導(dǎo)致心瓣膜形成失敗。具體而言，胺碘酮引起類似的聚糖B異位表達(dá)（s-vcanb），導(dǎo)致EGFR和GSK3β/蝸牛信號(hào)抑制，這反過來，上調(diào)心臟CDH5，導(dǎo)致有缺陷的心臟瓣膜。此外，還發(fā)現(xiàn)胺碘酮抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。一種類似胺碘酮抑制心臟內(nèi)EMT轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象。雖然斑馬魚兩腔心，相對(duì)于小鼠、大鼠和家兔的心率，動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間（APD）和心電圖（ECG）形態(tài)類似于人類。此外，Tsai et al證明斑馬魚心臟體外心電圖記錄是一種簡便、高效、高通量的檢測(cè)方法。因此，斑馬魚可以作為一個(gè)平臺(tái)，直接測(cè)試藥物對(duì)APD延長和QT間期延長的影響，這是FDA批準(zhǔn)藥物審批的必要條件。
癌癥研究：黑色素瘤 斑馬魚已成為人類癌癥研究的熱門實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，部分原因是由于人類癌基因和抑癌基因的魚類同源物已經(jīng)被鑒定出來，部分原因是因?yàn)檎{(diào)控腫瘤發(fā)展的信號(hào)通路是保守的。Amatruda等人報(bào)告說，許多斑馬魚腫瘤在組織學(xué)檢查中與人類癌癥相似。具有皮膚特異性紅色熒光的斑馬魚轉(zhuǎn)基因株系可用于皮膚腫瘤的檢測(cè)。用含砷溶液處理該胚胎后，在熒光顯微鏡下可以很容易地識(shí)別出皮膚上誘發(fā)的腫瘤。因此，該轉(zhuǎn)基因株系有望用于皮膚病的研究。例如，在這種轉(zhuǎn)基因株系中，紅色熒光表達(dá)可篩選出常見的皮膚癌黑色素瘤。斑馬魚轉(zhuǎn)基因株系也可用于建立模擬黑色素瘤發(fā)育的模型。人類致癌BRAF V600E表達(dá)的斑馬魚mitfa啟動(dòng)子控制下的黑色素細(xì)胞黑色素瘤模型的建立。皮膚特異紅色熒光mitfa驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)相結(jié)合，黑色素瘤可以很容易地追蹤。因此，轉(zhuǎn)基因株系和突變體為人類疾病的機(jī)理研究和治療研究提供了豐富的資源。
癌癥研究：轉(zhuǎn)移 斑馬魚是體內(nèi)腫瘤生物學(xué)研究的又一替代生物。特別是，將人類癌細(xì)胞移植到斑馬魚胚胎中作為評(píng)價(jià)癌癥進(jìn)展和藥物篩選的另一種方法。例如，用熒光標(biāo)記的人類原代腫瘤細(xì)胞已經(jīng)被植入斑馬魚肝臟，這些細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是直接觀察和容易追蹤的。為探討局部癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制，用熒光標(biāo)記的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)入斑馬魚胚胎腦內(nèi)。通過嫁接少量高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞在48 HPF斑馬魚胚胎心包膜，腫瘤細(xì)胞沿主動(dòng)脈縱向移動(dòng)。同樣，高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞熒光標(biāo)記分別注入48斑馬魚胚胎心包。之后，我們可以想象癌細(xì)胞是如何進(jìn)入血液循環(huán)并在頭部和尾部的小血管中被捕的。斑馬魚胚胎注射致瘤膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移，包括不同階段的干細(xì)胞 開始，接近，聚集，入侵，遷移，和永恒輪回。因此，將少量標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞嫁接到透明斑馬魚胚胎中，使我們能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞，而不受免疫抑制的干擾。斑馬魚模型除了用于分析腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的機(jī)制外，還可用于篩選潛在的抗癌化合物或藥物。此外，斑馬魚具有基因操作簡單、周期短、重復(fù)性好、維護(hù)成本低、胚胎高效電鍍等優(yōu)點(diǎn)。因此，這種魚僅次于SCID和裸鼠作為腫瘤細(xì)胞的異種移植接受者。
癌癥研究：白血病 白血病是一種與造血有關(guān)的癌癥。白血病通常是由白細(xì)胞的異常增加引起的。然而，一些人類骨髓癌和血液來源的父母細(xì)胞來自其他血細(xì)胞類型。尋找有效的白血病治療方法正在進(jìn)行中。有趣的是，斑馬魚與人類的造血發(fā)育過程和基因相似，使斑馬魚成為白血病研究的可行模型。此外，在斑馬魚的基因表達(dá)可以通過幾種方法，方便修改，如鉬誘導(dǎo)的基因沉默，TALENs和CRISPR/Cas9基因敲除，DNA / RNA過度表達(dá)。
癌癥研究：肝癌 kras, xmrk 和 myc肝癌特異性表達(dá)的幾種轉(zhuǎn)基因肝癌模型已被報(bào)道。 這些轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟腫瘤通常產(chǎn)生不同程度的肝細(xì)胞腺瘤。這三個(gè)轉(zhuǎn)基因肝癌模型已被用于通過RNA-SAGE測(cè)序鑒定差異表達(dá)基因。例如，研究人員在三種腫瘤模型中搜索或下調(diào)了基因，并分析了可能的信號(hào)通路。然后，確定了斑馬魚肝臟腫瘤特征與人類肝癌的不同階段之間的關(guān)系. 腫瘤的高發(fā)病率和方便的化學(xué)治療使這一轉(zhuǎn)基因斑馬魚成為研究肝腫瘤進(jìn)展、消退和抗腫瘤藥物篩選的理想平臺(tái)。
行為研究: 有趣的是，斑馬魚成為研究抑郁癥的現(xiàn)代有機(jī)體。因?yàn)樯恚ㄉ窠?jīng)解剖、神經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)）和斑馬魚的遺傳特性類似于哺乳動(dòng)物，斑馬魚是高通量遺傳和化學(xué)遺傳篩選的理想選擇。此外，由于斑馬魚對(duì)認(rèn)知、回避和社會(huì)范式的行為測(cè)試是可用的，識(shí)別抑郁響應(yīng)生理指標(biāo)的遺傳，環(huán)境和/或精神藥物的改變是可行的.事實(shí)上，斑馬魚表現(xiàn)出高度健壯的神經(jīng)行為障礙表型，如焦慮和回避行為。此外，行為指標(biāo)的新的信息可以接觸，包括通過自上而下垂直運(yùn)動(dòng)趨地性.斑馬魚的行為也可以使用自動(dòng)化的行為跟蹤軟件的監(jiān)控，從而提高效率和降低差異. 此外，斑馬魚提供了一個(gè)潛在的洞察抑郁癥的社會(huì)方面視角，可能是適合研究抑郁癥的認(rèn)知缺陷及其公認(rèn)的病因途徑。斑馬魚對(duì)精神藥物高度敏感，如抗抑郁藥、抗焦慮藥，情緒穩(wěn)定劑和抗精神病藥物，作為藥物發(fā)現(xiàn)的重要工具。
環(huán)境毒物生物傳感器：目前正在使用芳香烴、重金屬和環(huán)境雌激素來測(cè)試環(huán)境污染物對(duì)動(dòng)物的影響。這些研究主要集中在死亡率和異常率方面。然而，發(fā)育中的胚胎可能已經(jīng)以細(xì)微的方式被破壞，無法直接觀察形態(tài)學(xué)和檢測(cè)死亡率。
為了克服這一缺陷，轉(zhuǎn)基因魚可以用于研究（a）有毒物質(zhì)是否導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中的缺陷基因；（b）污染物是否影響組織特異性基因的表達(dá)；（c）污染物對(duì)胚胎發(fā)育的影響是否取決于劑量依賴性。通過簡單觀察魚在污染物之前或之后的形態(tài)變化。轉(zhuǎn)基因模型魚作為環(huán)境毒物和誘變劑的指示生物。
結(jié)論：越來越清楚的是，轉(zhuǎn)基因魚模型是一個(gè)強(qiáng)大的生物材料，用于研究多種學(xué)科，包括分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、癌癥生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)。它提供了一種簡單而有效的活體鑒定DNA序列的方法，以及確定基因功能和分子途徑。
更重要的是，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道，（a）模型魚突變體的缺陷表型可以與已知的人類疾病相重疊；（b）藥物對(duì)斑馬魚和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)也有相似的作用。
轉(zhuǎn)基因魚類模型為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域高通量藥物篩選提供了一個(gè)有用的平臺(tái)。此外，它可以作為一個(gè)環(huán)境指標(biāo)，在我們的日常生活中檢測(cè)污染物。然而，這種魚類模型有一些局限性和注意事項(xiàng)。
首先，不同于哺乳動(dòng)物，魚類缺乏心臟分隔，肺，乳腺，前列腺和四肢，使魚模型不可能為這些組織和器官的研究。此外，魚類沒有胎盤，因此魚胚胎直接暴露在環(huán)境中而不涉及胎盤。
二，魚是變溫通常維持在30°C，對(duì)于那些適應(yīng)37°C的哺乳動(dòng)物來說，這可能不是最佳的。最后，由于斑馬魚基因組是四倍體，所以對(duì)某些基因進(jìn)行功能研究就不那么直接了。
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