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投喂氟苯尼考后黃顙魚腸道內(nèi)細(xì)菌耐藥性的變化
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摘要
對平均體重（22.0±5.0）g的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）連續(xù)投喂含有25.0mg/kg.魚體重氟苯尼考的顆粒飼料5d后，從每尾試驗黃顙魚腸道中分離10個菌株，分別對這些分離菌株進行藥物敏感性測定，比較了用藥前后分離菌株對各種抗菌素藥物感受性的變化。結(jié)果表明，與未投喂藥物的對照黃顙魚相比，從投喂氟苯尼考黃顙魚的消化道中分離的細(xì)菌，對同屬于酰胺醇類的氟苯尼考和甲砜霉素的耐藥性明顯增加，而對不屬于酰胺醇類的硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素和恩諾沙星的感受性則沒有明顯影響。
關(guān)鍵詞 黃顙魚；氟苯尼考；藥敏實驗；耐藥率
對人工養(yǎng)殖黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）的細(xì)菌性疾病，主要依靠各種抗菌素類藥物治療[1]。但是，抗菌素的使用容易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，而且細(xì)菌對不同抗菌素耐藥性的產(chǎn)生強弱與速率，可能因細(xì)菌的種類和抗菌素使用頻率有關(guān)[2]。了解抗菌素使用后魚類消化道中細(xì)菌耐藥性的變化，對于將抗菌素作為水產(chǎn)用獸藥時制定科學(xué)用藥程序是具有重要參考作用的。
本研究將氟苯尼考添加在飼料中連續(xù)投喂黃顙魚5 d后，從供試黃顙魚消化道中分離細(xì)菌，測定了這些細(xì)菌在用藥前后的對部分漁用抗菌素藥物感受性變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1 材料與方法
1.1 供試藥物
本次試驗中用于投喂黃顙魚的藥物是屬于酰胺醇類的氟苯尼考（Florfenicol），華北制藥總廠生產(chǎn)，含量為98.9%，批號：130208。用于測定分離菌株藥物感受的藥物包括屬于酰胺醇類的甲砜霉素（Thiamphenicol），山東方明藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，含量為97.5%，批號：130123。屬于氨基糖苷類的硫酸新霉素（Neomycin Sulfate），宜昌三峽制藥有限公司生產(chǎn)，含量為98.0%，批號：130201。屬于四環(huán)素類的鹽酸多西環(huán)素（Doxycycline Hcl），是廣東華南藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，含量為96.8%，批號：130311。屬于喹諾酮類的恩諾沙星（Enrofloxacin），華北制藥總廠生產(chǎn)，含量為98.8%，批號：130302。
1.2 試驗魚及其飼養(yǎng)條件
本研究中的黃顙魚由鹽城裕達水產(chǎn)養(yǎng)殖公司提供。選擇健康、活潑無外傷的黃顙魚作試驗魚。在每個2.0m×2.0m×1.6m的網(wǎng)箱（圖1）中飼養(yǎng)50尾平均體重為（22.0±5.0）g的黃顙魚，每天投喂相當(dāng)于魚體重1.5%的人工配合飼料（鹽城裕達飼料有限公司生產(chǎn)的黃顙魚專用配合飼料）。馴養(yǎng)10 d，待供試黃顙魚適應(yīng)環(huán)境，并確認(rèn)無疾病癥狀后，開始試驗。試驗期間池塘中日均換水量約20.0%左右。飼養(yǎng)水溫變化幅度為（21±3）℃。
圖1 設(shè)置在水泥池中的飼養(yǎng)網(wǎng)箱
1.3 藥物餌料的制備與投喂
將氟苯尼考按25.0mg/kg.魚體重的用藥量，將藥物首先均勻地拌和在熟化的淀粉糊（圖2）中，再均勻地拌合在顆粒飼料中制作成藥餌（圖3）。添加藥物的餌料投喂3個網(wǎng)箱中的黃顙魚，作為試驗組；以未添加藥物的餌料喂養(yǎng)1個網(wǎng)箱中的黃顙魚，作為對照組。每天投喂1次藥餌，連續(xù)投喂5 d。停止投喂藥物餌料1d后，從供試魚消化道中采樣。
圖2 熟化淀粉糊
圖3 拌合藥物飼料
1.4 細(xì)菌分離
在投喂藥物餌料結(jié)束后的第2 d，從每個試驗和對照網(wǎng)箱中各隨機撈取5尾黃顙魚，在無菌條件下，將供試魚體用酒精消毒后解剖，從其腸道中采樣并接種在鋪有腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHIA，Difco）的平板上，從每尾魚消化道中分離的細(xì)菌接種3個平板。將接種后的平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，從每尾魚腸道中接種的3個平板中，共隨機挑取10個菌落，從3個試驗組黃顙魚消化道中共分離150個菌株，對照組黃顙魚消化道中共分離50個菌株。分別轉(zhuǎn)接在BHIA平板中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中進行分離菌株的純培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，用滅菌生理鹽水洗下平板中的菌落，并調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度為106cfu/mL，冷藏備用。
1.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定
依日本化學(xué)療法學(xué)會的方法進行[3]。首先將各種抗菌藥物以適宜溶媒溶解后，再用滅菌生理鹽水分別稀釋至1000.0mg/L的濃度。然后在無菌條件下，用滅菌后的腦心浸液培養(yǎng)基（BHI，Difco）將藥物稀釋10倍，從而使培養(yǎng)基中藥物的濃度達到100.0mg/L的濃度。再用定量移液槍向每支盛有2.9 mL BHI培養(yǎng)基的試管中加入2.9 mL含有藥物的培養(yǎng)基，將試管在混懸器上混合均勻后，從中吸取2.9 mL含有藥物的BHI培養(yǎng)基加到下一試管中，以此類推制作成藥物濃度分別為100.0mg/L、50.0mg/L、25.0mg/L……0.025mg/L的2倍稀釋藥物系列培養(yǎng)基試管。最后，定量吸取0.1mL濃度約為1.2×106cfu/mL活菌液（比濁法測定）加入上述每支試管中，搖勻。置于25℃條件下培養(yǎng)72 h，經(jīng)肉眼觀察證實無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
1.5 最小殺菌濃度（MBC）的測定
從各種藥物的MIC濃度以及高于MIC濃度的試管中分別取0.1mL培養(yǎng)液，接種于BHIA（Difco）培養(yǎng)基平皿中，置36℃條件下培養(yǎng)5 d，沒有菌落出現(xiàn)的相應(yīng)試管中的最低藥物濃度，即判為這種藥物的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentrations，MBC）。
2 結(jié)果
2.1 用藥前后菌株MIC的變化
從試驗和對照黃顙魚消化道中分離菌株對各種抗菌藥物的MIC測定結(jié)果如表1所示。
表1 用藥前后黃顙魚消化道中細(xì)菌對各種藥物最小抑菌濃度（MIC）變化
由表1可以看出，氟苯尼考對從對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MIC分別為0.05~0.78μg/mL，從連續(xù)投喂5 d氟苯尼考藥物餌料后的黃顙魚消化道中分離的150個菌株，其MIC上升至0.39~6.25μg/mL。對屬于同一類的甲砜霉素，對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MIC為0.05~0.78μg/mL，而對從試驗組黃顙魚消化道中分離的150個菌株的MIC上升0.10~3.13μg/mL。硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素和恩諾沙星等3種抗菌藥物，無論是對從試驗還是對照組黃顙魚消化道中分離菌株的MIC均沒有明顯變化。
2.1 用藥前后菌株MBC的變化
從試驗和對照黃顙魚消化道中分離菌株對各種抗菌藥物的MBC測定結(jié)果如表2所示。
表2 用藥前后黃顙魚消化道中細(xì)菌對各種藥物最小殺菌濃度（MBC）變化
由表2可以看出，氟苯尼考對從對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MBC分別為3.13~6.25μg/mL，從連續(xù)投喂5 d氟苯尼考藥物餌料后的黃顙魚消化道中分離的150個菌株，其MBC上升至3.13~12.5μg/mL。對屬于同一類的甲砜霉素，對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MBC為1.56~6.25μg/mL，而對從試驗組黃顙魚消化道中分離的150個菌株的MBC上升3.13~12.5μg/mL。硫酸新霉素對試驗和對照黃顙魚消化道中分離菌株的MBC均為3.13~25.0μg/mL；鹽酸多西環(huán)素的MBC為6.25~50.0μg/mL；恩諾沙星等的MBC均為12.5~100.0μg/mL。即無論是對從試驗還是對照組黃顙魚消化道中分離菌株的MBC均沒有明顯變化。
3 討論
已經(jīng)有研究結(jié)果證明，對魚類使用抗菌素與對其他動植物使用抗菌素一樣，容易導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生耐藥性[4~12]。本研究中經(jīng)過連續(xù)5d給黃顙魚投喂氟苯尼考藥物餌料后，從試驗魚消化道中分離的菌株，至少是大部分菌株已經(jīng)對該藥物的耐藥性明顯增強。說明給魚類投喂氟苯尼考容易導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類消化道內(nèi)的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。
細(xì)菌對不同抗菌素的敏感性是不同的[8,9]，在本研究中的5種抗菌素中，從對照黃顙魚消化道中分離的菌株對氟苯尼考、甲砜霉素均比較敏感，對硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素的敏感程度稍遜于氟苯尼考和甲砜霉素，而對恩諾沙星的敏感程度最低。這可能是養(yǎng)殖業(yè)者以往預(yù)防和治療黃顙魚疾病過程中，使用恩諾沙星比較多的緣故。
值得注意的是，給供試黃顙魚投喂氟苯尼考藥物餌料后，黃顙魚消化道中的細(xì)菌不僅對氟苯尼考的耐藥性有所上升，而且同屬于酰胺醇類抗菌藥物的甲砜霉素的耐藥性也相應(yīng)上升了，即氟苯尼考與甲砜霉素之間顯示出了明顯地交叉耐藥性。而測定結(jié)果也證明了分離菌株對屬于氨基糖苷類的硫酸新霉素、屬于四環(huán)素類的鹽酸多西環(huán)素和屬于喹諾酮類的恩諾沙星，均未出現(xiàn)明顯交叉耐藥性的現(xiàn)象。
需要說明的是，本研究中未對分離菌株做種類鑒定，而對抗菌藥物的敏感性是與細(xì)菌的種類相關(guān)的[13]。試驗與對照組中各種細(xì)菌種類的差異，以及因為種類差異導(dǎo)致的對藥物敏感性測定結(jié)果的影響，尚需要進一步研究。
作者：陳昌福1 陳亮波2 郭慶2 孟憲東2 金鈴2
（1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070；2 鹽城裕達飼料有限公司，江蘇鹽城 224341）
對平均體重（22.0±5.0）g的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）連續(xù)投喂含有25.0mg/kg.魚體重氟苯尼考的顆粒飼料5d后，從每尾試驗黃顙魚腸道中分離10個菌株，分別對這些分離菌株進行藥物敏感性測定，比較了用藥前后分離菌株對各種抗菌素藥物感受性的變化。結(jié)果表明，與未投喂藥物的對照黃顙魚相比，從投喂氟苯尼考黃顙魚的消化道中分離的細(xì)菌，對同屬于酰胺醇類的氟苯尼考和甲砜霉素的耐藥性明顯增加，而對不屬于酰胺醇類的硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素和恩諾沙星的感受性則沒有明顯影響。
關(guān)鍵詞 黃顙魚；氟苯尼考；藥敏實驗；耐藥率
對人工養(yǎng)殖黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）的細(xì)菌性疾病，主要依靠各種抗菌素類藥物治療[1]。但是，抗菌素的使用容易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，而且細(xì)菌對不同抗菌素耐藥性的產(chǎn)生強弱與速率，可能因細(xì)菌的種類和抗菌素使用頻率有關(guān)[2]。了解抗菌素使用后魚類消化道中細(xì)菌耐藥性的變化，對于將抗菌素作為水產(chǎn)用獸藥時制定科學(xué)用藥程序是具有重要參考作用的。
本研究將氟苯尼考添加在飼料中連續(xù)投喂黃顙魚5 d后，從供試黃顙魚消化道中分離細(xì)菌，測定了這些細(xì)菌在用藥前后的對部分漁用抗菌素藥物感受性變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1 材料與方法
1.1 供試藥物
本次試驗中用于投喂黃顙魚的藥物是屬于酰胺醇類的氟苯尼考（Florfenicol），華北制藥總廠生產(chǎn)，含量為98.9%，批號：130208。用于測定分離菌株藥物感受的藥物包括屬于酰胺醇類的甲砜霉素（Thiamphenicol），山東方明藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，含量為97.5%，批號：130123。屬于氨基糖苷類的硫酸新霉素（Neomycin Sulfate），宜昌三峽制藥有限公司生產(chǎn)，含量為98.0%，批號：130201。屬于四環(huán)素類的鹽酸多西環(huán)素（Doxycycline Hcl），是廣東華南藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，含量為96.8%，批號：130311。屬于喹諾酮類的恩諾沙星（Enrofloxacin），華北制藥總廠生產(chǎn)，含量為98.8%，批號：130302。
1.2 試驗魚及其飼養(yǎng)條件
本研究中的黃顙魚由鹽城裕達水產(chǎn)養(yǎng)殖公司提供。選擇健康、活潑無外傷的黃顙魚作試驗魚。在每個2.0m×2.0m×1.6m的網(wǎng)箱（圖1）中飼養(yǎng)50尾平均體重為（22.0±5.0）g的黃顙魚，每天投喂相當(dāng)于魚體重1.5%的人工配合飼料（鹽城裕達飼料有限公司生產(chǎn)的黃顙魚專用配合飼料）。馴養(yǎng)10 d，待供試黃顙魚適應(yīng)環(huán)境，并確認(rèn)無疾病癥狀后，開始試驗。試驗期間池塘中日均換水量約20.0%左右。飼養(yǎng)水溫變化幅度為（21±3）℃。
圖1 設(shè)置在水泥池中的飼養(yǎng)網(wǎng)箱
1.3 藥物餌料的制備與投喂
將氟苯尼考按25.0mg/kg.魚體重的用藥量，將藥物首先均勻地拌和在熟化的淀粉糊（圖2）中，再均勻地拌合在顆粒飼料中制作成藥餌（圖3）。添加藥物的餌料投喂3個網(wǎng)箱中的黃顙魚，作為試驗組；以未添加藥物的餌料喂養(yǎng)1個網(wǎng)箱中的黃顙魚，作為對照組。每天投喂1次藥餌，連續(xù)投喂5 d。停止投喂藥物餌料1d后，從供試魚消化道中采樣。
圖2 熟化淀粉糊
圖3 拌合藥物飼料
1.4 細(xì)菌分離
在投喂藥物餌料結(jié)束后的第2 d，從每個試驗和對照網(wǎng)箱中各隨機撈取5尾黃顙魚，在無菌條件下，將供試魚體用酒精消毒后解剖，從其腸道中采樣并接種在鋪有腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHIA，Difco）的平板上，從每尾魚消化道中分離的細(xì)菌接種3個平板。將接種后的平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，從每尾魚腸道中接種的3個平板中，共隨機挑取10個菌落，從3個試驗組黃顙魚消化道中共分離150個菌株，對照組黃顙魚消化道中共分離50個菌株。分別轉(zhuǎn)接在BHIA平板中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中進行分離菌株的純培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，用滅菌生理鹽水洗下平板中的菌落，并調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度為106cfu/mL，冷藏備用。
1.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定
依日本化學(xué)療法學(xué)會的方法進行[3]。首先將各種抗菌藥物以適宜溶媒溶解后，再用滅菌生理鹽水分別稀釋至1000.0mg/L的濃度。然后在無菌條件下，用滅菌后的腦心浸液培養(yǎng)基（BHI，Difco）將藥物稀釋10倍，從而使培養(yǎng)基中藥物的濃度達到100.0mg/L的濃度。再用定量移液槍向每支盛有2.9 mL BHI培養(yǎng)基的試管中加入2.9 mL含有藥物的培養(yǎng)基，將試管在混懸器上混合均勻后，從中吸取2.9 mL含有藥物的BHI培養(yǎng)基加到下一試管中，以此類推制作成藥物濃度分別為100.0mg/L、50.0mg/L、25.0mg/L……0.025mg/L的2倍稀釋藥物系列培養(yǎng)基試管。最后，定量吸取0.1mL濃度約為1.2×106cfu/mL活菌液（比濁法測定）加入上述每支試管中，搖勻。置于25℃條件下培養(yǎng)72 h，經(jīng)肉眼觀察證實無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
1.5 最小殺菌濃度（MBC）的測定
從各種藥物的MIC濃度以及高于MIC濃度的試管中分別取0.1mL培養(yǎng)液，接種于BHIA（Difco）培養(yǎng)基平皿中，置36℃條件下培養(yǎng)5 d，沒有菌落出現(xiàn)的相應(yīng)試管中的最低藥物濃度，即判為這種藥物的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentrations，MBC）。
2 結(jié)果
2.1 用藥前后菌株MIC的變化
從試驗和對照黃顙魚消化道中分離菌株對各種抗菌藥物的MIC測定結(jié)果如表1所示。
表1 用藥前后黃顙魚消化道中細(xì)菌對各種藥物最小抑菌濃度（MIC）變化
由表1可以看出，氟苯尼考對從對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MIC分別為0.05~0.78μg/mL，從連續(xù)投喂5 d氟苯尼考藥物餌料后的黃顙魚消化道中分離的150個菌株，其MIC上升至0.39~6.25μg/mL。對屬于同一類的甲砜霉素，對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MIC為0.05~0.78μg/mL，而對從試驗組黃顙魚消化道中分離的150個菌株的MIC上升0.10~3.13μg/mL。硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素和恩諾沙星等3種抗菌藥物，無論是對從試驗還是對照組黃顙魚消化道中分離菌株的MIC均沒有明顯變化。
2.1 用藥前后菌株MBC的變化
從試驗和對照黃顙魚消化道中分離菌株對各種抗菌藥物的MBC測定結(jié)果如表2所示。
表2 用藥前后黃顙魚消化道中細(xì)菌對各種藥物最小殺菌濃度（MBC）變化
由表2可以看出，氟苯尼考對從對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MBC分別為3.13~6.25μg/mL，從連續(xù)投喂5 d氟苯尼考藥物餌料后的黃顙魚消化道中分離的150個菌株，其MBC上升至3.13~12.5μg/mL。對屬于同一類的甲砜霉素，對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MBC為1.56~6.25μg/mL，而對從試驗組黃顙魚消化道中分離的150個菌株的MBC上升3.13~12.5μg/mL。硫酸新霉素對試驗和對照黃顙魚消化道中分離菌株的MBC均為3.13~25.0μg/mL；鹽酸多西環(huán)素的MBC為6.25~50.0μg/mL；恩諾沙星等的MBC均為12.5~100.0μg/mL。即無論是對從試驗還是對照組黃顙魚消化道中分離菌株的MBC均沒有明顯變化。
3 討論
已經(jīng)有研究結(jié)果證明，對魚類使用抗菌素與對其他動植物使用抗菌素一樣，容易導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生耐藥性[4~12]。本研究中經(jīng)過連續(xù)5d給黃顙魚投喂氟苯尼考藥物餌料后，從試驗魚消化道中分離的菌株，至少是大部分菌株已經(jīng)對該藥物的耐藥性明顯增強。說明給魚類投喂氟苯尼考容易導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類消化道內(nèi)的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。
細(xì)菌對不同抗菌素的敏感性是不同的[8,9]，在本研究中的5種抗菌素中，從對照黃顙魚消化道中分離的菌株對氟苯尼考、甲砜霉素均比較敏感，對硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素的敏感程度稍遜于氟苯尼考和甲砜霉素，而對恩諾沙星的敏感程度最低。這可能是養(yǎng)殖業(yè)者以往預(yù)防和治療黃顙魚疾病過程中，使用恩諾沙星比較多的緣故。
值得注意的是，給供試黃顙魚投喂氟苯尼考藥物餌料后，黃顙魚消化道中的細(xì)菌不僅對氟苯尼考的耐藥性有所上升，而且同屬于酰胺醇類抗菌藥物的甲砜霉素的耐藥性也相應(yīng)上升了，即氟苯尼考與甲砜霉素之間顯示出了明顯地交叉耐藥性。而測定結(jié)果也證明了分離菌株對屬于氨基糖苷類的硫酸新霉素、屬于四環(huán)素類的鹽酸多西環(huán)素和屬于喹諾酮類的恩諾沙星，均未出現(xiàn)明顯交叉耐藥性的現(xiàn)象。
需要說明的是，本研究中未對分離菌株做種類鑒定，而對抗菌藥物的敏感性是與細(xì)菌的種類相關(guān)的[13]。試驗與對照組中各種細(xì)菌種類的差異，以及因為種類差異導(dǎo)致的對藥物敏感性測定結(jié)果的影響，尚需要進一步研究。
作者：陳昌福1 陳亮波2 郭慶2 孟憲東2 金鈴2
（1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070；2 鹽城裕達飼料有限公司，江蘇鹽城 224341）
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