作用于細(xì)胞壁的抗真菌藥物研究進(jìn)展

與人類細(xì)胞相比，細(xì)胞壁為真菌的特有結(jié)構(gòu)，因此作用于細(xì)胞壁的抗真菌藥物相較于其他類型抗真菌藥物而言具有高效、低毒的特點(diǎn)，是迄今為止安全性最高的一類抗真菌藥物。本文對作用于細(xì)胞壁的抗真菌藥物進(jìn)行綜述，根據(jù)作用機(jī)制及靶點(diǎn)的不同分別介紹葡聚糖合成酶抑制劑、幾丁質(zhì)合成酶抑制劑及糖基磷脂酰肌(
glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白抑制劑，對其進(jìn)行總結(jié)和歸納，為相關(guān)藥物的研發(fā)及將來的臨床應(yīng)用前景提供參考。

隨著抗生素和免疫抑制劑等治療手段的廣泛應(yīng)用，以白念珠菌Candida albicans、新生隱球菌Cryptococcus neoformans和煙曲霉Aspergillus fumigatus等為代表的侵襲性真菌的感染率和致死率不斷提升，嚴(yán)重威脅著人類健康(Liao et al. 2013；Hütte 2021)。然而，由于目前抗真菌藥物種類匱乏、毒副作用大且易發(fā)生耐藥，使得抗真菌治療存在一定的挑戰(zhàn)(廖萬清等2017；Stephenson et al. 2021)。

真菌是真核生物，與哺乳動物細(xì)胞存在相似的生物學(xué)特征，因而常規(guī)抗真菌治療效果有限且副作用較大。針對真菌與哺乳動物細(xì)胞的差異化靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物能夠更有效的抑制真菌生長，并降低對機(jī)體的毒副作用。細(xì)胞壁是真菌特有且賴以生存的結(jié)構(gòu)，近年來，隨著對真菌細(xì)胞壁成分的深入研究，一系列旨在靶向抑制細(xì)胞壁關(guān)鍵成分合成的藥物相繼被開發(fā)并應(yīng)用。本文旨在探討靶向真菌細(xì)胞壁的天然藥物、衍生物以及相關(guān)作用機(jī)制，為進(jìn)一步探索研究提供思路。

01

真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

真菌細(xì)胞壁是一種復(fù)雜的多糖結(jié)構(gòu)，包裹著真菌胞質(zhì)，使其免受外界滲透壓、酸堿度等理化性質(zhì)變化的影響。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的缺失會導(dǎo)致質(zhì)膜破裂和細(xì)胞溶解，因此細(xì)胞壁的完整性對于真菌的存活至關(guān)重要。細(xì)胞壁的多糖結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)三維的空間特性，且隨著真菌不同階段的生命周期而不斷發(fā)生變化。細(xì)胞壁是與宿主細(xì)胞接觸的重要生物結(jié)構(gòu)，與侵襲性真菌的致病性和毒力密切相關(guān)。

真菌細(xì)胞壁主要由β-葡聚糖、幾丁質(zhì)及甘露糖蛋白等組成，這些成分的比例因真菌種類不同而異(Fang et al. 2019)。β-葡聚糖是一種通過葡萄糖之間的糖苷鍵連接而成的多糖，根據(jù)糖苷鍵連接方式不同分為β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖，而真菌細(xì)胞壁中β-1,3-葡聚糖占絕大部分。幾丁質(zhì)又稱甲殼質(zhì)，是通過β-1,4糖苷鍵連接N-乙酰葡糖胺(2-乙酰胺-2-脫氧-D-葡萄糖)單體聚合而成的多糖結(jié)構(gòu)，具有較大的拉伸強(qiáng)度。β-葡聚糖和幾丁質(zhì)由質(zhì)膜相關(guān)合成酶合成，在合成過程中運(yùn)送至細(xì)胞壁，而甘露糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，在運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面之前在高爾基體中進(jìn)行修飾。真菌的細(xì)胞壁通常有內(nèi)外兩層，結(jié)構(gòu)組分存在一定差異。其中內(nèi)層是由含有側(cè)鏈的β-1,3-葡聚糖分子與分子鏈之間的氫鍵結(jié)合形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其末端是β-1,6-葡聚糖和幾丁質(zhì)的受體。內(nèi)層多聚體相互連接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可防止糖蛋白的外泄，外層的甘露糖蛋白通常與β-1,6-葡聚糖結(jié)合構(gòu)成肽聚糖網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)細(xì)胞壁內(nèi)外兩層又通過氫鍵、側(cè)鏈等方式維持穩(wěn)定。

除上述細(xì)胞壁組分外，一些真菌還含有特有的聚糖結(jié)構(gòu)，比如新生隱球菌細(xì)胞壁的內(nèi)層還含有α-1,3-1,4-葡聚糖其結(jié)構(gòu)是由兩條α-1,3鍵連接的聚糖再通過α-1,4鍵連接而成。α-1,3-1,4-葡聚糖在真菌細(xì)胞壁內(nèi)層及核心層與甲殼素形成疏水剛性支架，其稍外側(cè)由相互連接的α-1,3-葡聚糖、β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖的水合軟基質(zhì)覆蓋。α-1,3-葡聚糖在真菌細(xì)胞壁外層參與宿主細(xì)胞的黏附及免疫逃逸過程，與侵襲性真菌的致病性及毒力密切相關(guān)。真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)示意圖

Fig. 1 Fungal cell wall components.

02

針對細(xì)胞壁的抗真菌藥物的作用機(jī)制

在真菌生命周期的不同形態(tài)發(fā)生階段，細(xì)胞壁必須不斷重建，包括舊交叉鏈的斷裂、多糖和蛋白質(zhì)的新合成鏈插入細(xì)胞壁以及新交叉鏈的形成。靶向干預(yù)細(xì)胞壁關(guān)鍵成分的合成酶可導(dǎo)致細(xì)胞壁組分減少、屏障破壞，繼而誘發(fā)真菌胞質(zhì)結(jié)構(gòu)異常、胞膜破裂及細(xì)胞死亡。下面就常見的靶向細(xì)胞壁的抗真菌藥物的作用機(jī)制進(jìn)行闡述。

2.1 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑

β-1,3-葡聚糖主要位于真菌細(xì)胞壁內(nèi)層，對于真菌結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起到重要作用。β-1,3-葡聚糖由β-1,3-葡聚糖合成酶催化轉(zhuǎn)運(yùn)尿苷二磷酸葡萄糖生成，通過靶向作用于該合成酶的關(guān)鍵基團(tuán)，導(dǎo)致β-1,3-葡聚糖在細(xì)胞壁的含量下降，進(jìn)而造成細(xì)胞破裂死亡(Ma et al. 2017)。

2.1.1 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑分類

目前研究較多的β-1,3-葡聚糖合成酶非競爭性抑制劑為棘白菌素(echinocandins)衍生物和阜孢霉素(papulacandi)衍生物。棘白菌素為非核糖體環(huán)六肽，其脂肪酸側(cè)鏈的位置和構(gòu)象對其抗真菌活性至關(guān)重要，可能與該側(cè)鏈插在真菌質(zhì)膜的磷脂雙層中有關(guān)(Hüttel 2021)。棘白菌素以非競爭性的方式與β-1,3-葡聚糖合成酶的催化亞基結(jié)合，使真菌細(xì)胞壁完整性降低，進(jìn)而導(dǎo)致真菌死亡(Douglas et al. 1994)。天然的棘白菌素由真菌生成，但受限于其低溶解性和高毒性，無法直接應(yīng)用于臨床(Hüttel 2017)。目前批準(zhǔn)用于臨床治療的棘白菌素類藥物有卡泊芬凈(caspofungin)、阿尼芬凈(anidulafungin)和米卡芬凈(micafungin) (Brown et al. 2012)。

阜孢霉素的抗真菌活性于1977年被發(fā)現(xiàn)，最早由Ciba-Geigy分離提純，其主要活性成分為阜孢霉素B (Traxler et al. 1977)。與棘白菌素類藥物抗真菌作用機(jī)制類似，阜孢霉素也通過靶向作用于β-1,3-葡聚糖合成酶抑制β-1,3-葡聚糖的生成(Berzaghi et al. 2019)。

2.1.2 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑的臨床應(yīng)用

棘白菌素類藥物在臨床的使用已近20年，其中卡泊芬凈于2001年獲得美國食品藥品管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)，米卡芬凈和阿尼芬凈分別于2005年和2006年獲得FDA批準(zhǔn)(Tap?s?z 2011；Wasmann et al. 2018)。鑒于棘白菌素類藥物的廣譜真菌抑制作用，2016年國際腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南推薦卡泊芬凈作為侵襲性念珠菌感染的一線用藥(Baden et al. 2016)。米卡芬凈對念珠菌具有廣譜的殺菌作用，并且能夠有效的抑制曲霉菌的活性，目前廣泛應(yīng)用于重癥患者的侵襲性真菌感染治療中(van der Geest et al. 2016；Timsit et al. 2016)。阿尼芬凈主要應(yīng)用于念珠菌及對唑類耐藥的光滑念珠菌感染的治療中(Marzuttini et al. 2021)。

2.1.3 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑的耐藥性

臨床上棘白菌素的耐藥性通常在重復(fù)用藥的情況下發(fā)生，偶爾也出現(xiàn)在短暫使用的患者中 (Chang et al. 2017)。真菌獲得耐藥性的最常見機(jī)制之一是通過改變編碼藥物靶構(gòu)象的基因突變，從而減少藥物的結(jié)合和功效 (Revie et al. 2018)。針對棘白菌素衍生物對合成酶的抑制效應(yīng)，真菌可通過改變β-1,3-葡聚糖合成酶中Fks亞基的構(gòu)型而導(dǎo)致耐藥(Walker et al. 2010)。真菌發(fā)生耐藥性的另一種機(jī)制來源于現(xiàn)有的棘白菌素類藥物過短的半衰期，導(dǎo)致藥物無法長期維持有效濃度，進(jìn)而使殘活真菌有機(jī)會發(fā)生突變(Healey & Perlin 2018)。

2.2 幾丁質(zhì)合成酶抑制劑

幾丁質(zhì)通過氫鍵與β-1,3-葡聚糖連接，韌性較高，在維持真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用(Iyer et al. 2021)。幾丁質(zhì)合成酶抑制劑通過靶向UDP-N-乙酰葡糖胺合成酶，可有效抑制幾丁質(zhì)的合成，導(dǎo)致真菌胞質(zhì)滲透壓改變，進(jìn)而破裂死亡(Sass et al. 2021a)。幾丁質(zhì)靶向的經(jīng)典抗真菌藥物為尼可霉素Z，由德國拜爾制藥公司于1970年分離提純(Sass et al. 2021b)。后續(xù)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，尼可霉素Z對皮炎芽生菌引起的慢性膿腫有一定的治療作用，而對新生隱球菌引發(fā)的侵襲性感染治療效果有限(Hector et al. 1990；Clemons & Stevens 1997；Li & Rinaldi 1999)。除了有限的真菌治療譜外，尼可霉素Z的臨床應(yīng)用還受限于其極短的半衰期(靜脈和口服給藥的半衰期分別為15分鐘和1小時(shí))(Hector et al. 1990)。

2.3 糖基磷脂酰肌(
glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白抑制劑

GPI是真核細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)膜錨定細(xì)胞表面蛋白的重要分子(Müller et al. 2021)。在真菌中，GPI通過協(xié)助β-1,3-葡聚糖與糖蛋白交聯(lián)，在細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間起到橋梁作用。從GPI的合成到最終形成有生物學(xué)功能的GPI錨定蛋白需要大量的化學(xué)修飾，其中關(guān)鍵的限速酶為Gwt1酶和Mcd4酶(Traxler et al. 1977)。通過抑制這兩個(gè)限速酶可有效減少GPI錨定蛋白的合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)紊亂，抑制真菌的毒力。

03

針對細(xì)胞壁的抗真菌藥物的研究進(jìn)展

3.1 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑

隨著β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑的廣泛應(yīng)用，棘白菌素衍生物耐藥的相關(guān)報(bào)道逐漸引起人們重視(Sharma et al. 2016；Geddes & Shapiro 2019)。針對現(xiàn)有棘白菌素類藥物半衰期短、可溶性差等缺點(diǎn)，新型棘白菌素類藥物的研發(fā)取得了如下實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。

3.1.1 雷扎芬凈(rezafungin)

雷扎芬凈又稱CD101，相較于上述棘白菌素類藥物具有更好的可溶性和化學(xué)穩(wěn)定性(Locke et al. 2018)。有研究表明，雷扎芬凈的殺菌效應(yīng)與藥物濃度密切相關(guān)，同時(shí)還具有令人滿意的安全性(Ong et al. 2016；Sandison et al. 2017)。與其他棘白菌素類藥物類似，雷扎芬凈對念珠菌和曲霉菌具有顯著的抑制效應(yīng)，但無法作用于隱球菌(Pfaller et al. 2020)。

3.1.2 SCY-078 (ibrexafungerp)

SCY-078是一種新型的β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑，其前體為天然化合物enfumafungin。不同于先前的棘白菌素類藥物，SCY-078通過口服給藥即可發(fā)揮有效的抗真菌作用(Kuhnert et al. 2018)。SCY-078具有體外抗念珠菌活性，并且對大多數(shù)Fks亞基突變導(dǎo)致的耐藥菌株仍有較強(qiáng)殺傷作用(Apgar et al. 2021)。在念珠菌感染的免疫缺陷小鼠模型中，SCY-078可對對棘白菌素敏感性較低的光滑念珠菌引起的感染產(chǎn)生功效，能夠有效減少腎臟真菌負(fù)荷(Wiederhold 2018)。根據(jù)報(bào)道，SCY-078在兩項(xiàng)藥物II期臨床試驗(yàn)研究中均展現(xiàn)了較好的治療效果和安全性(Wring et al. 2018；Spec et al. 2019)。

3.1.3 其他抑制β-1,3-葡聚糖的天然活性物質(zhì)

抗真菌藥物的更新有賴于天然產(chǎn)物及其半合成衍生物的發(fā)現(xiàn)。近年來發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的一些通過抑制β-1,3-葡聚糖合成而發(fā)揮抗真菌作用的天然活性物質(zhì)如下：聚醋酸(poacic acid)可特異性結(jié)合β-1,3-葡聚糖并顯著的破壞其完整性(Lee et al. 2018)；指甲花醌提取自植物指甲花葉，其結(jié)構(gòu)與維生素K相似，近期國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，指甲花醌在體內(nèi)、外均可通過損傷尖孢鐮刀菌的細(xì)胞壁而抑制其增殖(Dananjaya et al. 2017)；萘內(nèi)酯E (Nagilactone E)是提取自羅漢松的去甲二萜雙內(nèi)酯，據(jù)報(bào)道可通過降低β-1,3-葡聚糖合成酶活性導(dǎo)致釀酒酵母菌細(xì)胞壁滲漏(Hayashi et al. 2018)。

3.2 GPI錨定蛋白抑制劑

近年來，隨著對GPI錨定蛋白合成認(rèn)識的深入，相關(guān)靶向藥物不斷被研發(fā)。對GPI錨定蛋白的抑制主要基于限速酶Gwt1酶和Mcd4酶。新型藥物APX001A可特異性抑制Gwt1酶對GPI的肌醇?；?，進(jìn)而阻斷GPI錨定蛋白的合成(Mutz & Roemer 2016)。與APX001A作用機(jī)理類似的藥物還有G884、G365和Gepinacin等(Hager et al. 2018)。Mcd4是一種乙醇胺磷酸轉(zhuǎn)移酶，通過抑制其活性也可達(dá)到使真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)紊亂的目的(Hasegawa et al. 2019)。目前通過抑制Mcd4酶進(jìn)而抑制GPI錨定蛋白的新型藥物有M743和M720等(Hasegawa et al. 2019)。

04

總結(jié)

近年來，盡管人們對于侵襲性真菌感染的研究取得了長足進(jìn)展，但自本世紀(jì)初期卡泊芬凈上市后，世界范圍內(nèi)尚未有作用于新靶點(diǎn)的抗真菌藥物上市，臨床醫(yī)師可選擇的抗真菌藥物種類較少，不能滿足治療需求。相較于傳統(tǒng)藥物，部分仍處于研發(fā)階段的抗真菌藥物具有獨(dú)特優(yōu)勢，例如尼克霉素Z和APX001A可作用于新的靶點(diǎn)發(fā)揮抗真菌作用，前者抑制幾丁質(zhì)合成酶，后者抑制Gwt1蛋白；SCY-078雖然作用于已知靶點(diǎn)，但因可以口服使用而具有新的治療效果；雷扎芬凈則通過改變藥物結(jié)構(gòu)而延長其半衰期。隨著研究的深入，一些處于研發(fā)階段的抗真菌藥物上市后對于臨床治療將發(fā)揮重大意義，我們期待越來越多的新型抗真菌藥物上市，為侵襲性真菌感染的治療提供更高效、更安全的治療方案。

在生物細(xì)胞學(xué)研究中，有時(shí)需要體外培養(yǎng)和分析癌細(xì)胞。細(xì)胞要養(yǎng)好，就要用好血清，如Ausbian®特級進(jìn)口胎牛血清，它的內(nèi)毒素小于3Eu/ml，使細(xì)胞更健康，客戶做實(shí)驗(yàn)更加順利。

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