青蒿末復(fù)方制劑對草魚鰓上小瓜蟲作用的研究

        青蒿末復(fù)方制劑對草魚鰓上小瓜蟲作用的研究

章海鑫 付輝云 陳文靜 周智勇 黃江峰 饒 毅 余智杰 朱桂根 李左宏

(江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039)

小瓜蟲分布廣，對寄主大小、種類、部位選擇性低，發(fā)病前期不易察覺，易引起暴發(fā)性死亡，而且治療困難，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了巨大的損失。目前對于小瓜蟲的防治研究主要有物理、化學(xué)藥物、免疫等方面。雖然在物理方面得到一些結(jié)論，但超聲波、紫外線、增加水溫等方法不適合在大水體中應(yīng)用，有條件的可以考慮使用紫外線(LARRY J W.，1998)。免疫和化學(xué)藥物方面的進(jìn)展緩慢，如發(fā)現(xiàn)有一定作用的醋酸亞汞和孔雀石綠都已被禁用(Houghton G.et al，1986)，篩選出的硫酸銅、高錳酸鉀、氯化鈉、福爾馬林、生石灰等有一定療效的藥物，但這些藥物大多數(shù)對掠食體階段有一定效果，而對滋養(yǎng)體階段效果不明顯(POST G et al，1983)。免疫學(xué)方法則處于起步階段，而且困難很大，對于小瓜蟲疫苗的開發(fā)主要停留在活體培養(yǎng)小瓜蟲幼蟲注射來免疫魚體，大規(guī)模培養(yǎng)活體幼體的方法還不成熟，只是停留在實驗階段，缺乏可行性。

近年很多研究者開始使用中草藥來治療和預(yù)防小瓜蟲。青蒿末是從菊科植物黃花蒿(Artemisia annuaLinn)的地上部分干燥后制成粉而來，含有有效成分青蒿素(Arteannuin、 Artemisinine、Qinghaosu，QHS)，對人類瘧疾具有良好的治療作用(屠呦呦等，1998；鄒樟等，1985；張秋紅等，2011)。目前也有零星報道其對多子小瓜蟲殺滅研究的報道，但青蒿素在實際生產(chǎn)上成本過高，實際應(yīng)用不太現(xiàn)實。而直接使用青蒿末殺滅多子小瓜蟲的濃度很高(徐先棟等，2012)，使得其在水產(chǎn)實際應(yīng)用上受限。因此，本實驗在已有研究的基礎(chǔ)上，利用中藥配方技術(shù)配成了青蒿末復(fù)方制劑，研究其對多子小瓜蟲的臨床作用，并分析其藥理性，以期為其水產(chǎn)實踐應(yīng)用提供用法和理論借鑒。

一、材料與方法

1.實驗動物與實驗場所

鰓上寄生小瓜蟲的草魚來源于進(jìn)賢縣梅莊，健康草魚［(80±5)克/尾］來源于江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地。實驗用水泥池為8 米2，位于室內(nèi)養(yǎng)殖大棚內(nèi)，水泥池均徹底消毒曝曬。

2.藥餌和飼料

青蒿末復(fù)方制劑為含青蒿末80%的復(fù)方中草藥制劑。將正常草魚飼料(江西丙申飼料公司提供，粗蛋白質(zhì)含量為28%)磨碎，加入青蒿末復(fù)方制劑粉末充分混勻，制成含青蒿末復(fù)方制劑2.4%的藥用飼料，晾干備用。

正常投喂飼料由江西丙申飼料公司提供，為粗蛋白質(zhì)含量28%的草魚全價料。

3.儀器與設(shè)備

電子天平、小撈網(wǎng)、溫度計、顯微鏡、飼料制備機、解剖鏡、培養(yǎng)皿、冰箱、生化培養(yǎng)箱、5毫升離心管、剪刀。

4.實驗設(shè)計

(1)青蒿末復(fù)方制劑對小瓜蟲寄生的預(yù)防。將顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)小瓜蟲的草魚放養(yǎng)在8 米2的水池中，每個水池放10 尾，總共6 個水泥池，保持24小時連續(xù)充氣，水溫控制在(20±2)℃。實驗組3 個水池，投喂1 周藥餌，每天兩次，投喂率為4%。對照組3 個水池投喂1 周正常飼料，每天兩次，投喂率為4%。之后向?qū)嶒灲M和對照組每池放入3尾感染小瓜蟲的草魚，每天觀察各池草魚感染小瓜蟲的數(shù)量。

(2)青蒿末復(fù)方制劑對魚體上的小瓜蟲的影響。將寄生小瓜蟲可攝食的草魚放入8 米2的水泥池，每池10尾，保持24小時連續(xù)充氣，水溫控制在(20±2)℃。然后取6個水泥池分別投喂藥餌(實驗組3 個)和常規(guī)飼料(對照組3 個)，每天投喂3次，投喂率為4%。每天使用顯微鏡觀察魚體鰓上小瓜蟲的數(shù)量，記錄每天小瓜蟲的減少情況。

寄生小瓜蟲草魚為平均每尾草魚鰓絲上顯微鏡下可觀察每個視野(10×10)5～8個。

(3)青蒿末復(fù)方制劑血清對離體小瓜蟲的殺滅作用。選用未寄生小瓜蟲的草魚放入兩個6 米2的水泥池，保持24小時連續(xù)充氣，水溫控制在(20±2)℃。將其中一個水泥池投喂藥餌，另一個則投喂常規(guī)飼料，每天投喂兩次，投喂率為4%；投喂10 天后，采用尾靜脈取血的方法取血制作血清。從感染小瓜蟲的魚體上分離出小瓜蟲，取5個小瓜蟲放入含1毫升純水的干凈培養(yǎng)皿中，然后向培養(yǎng)皿中分別加入含有10、20、40、80 微升喂藥餌的血清和40、80 微升投喂常規(guī)飼料的血清，同時設(shè)1個不加血清只有純水和小瓜蟲的對照。將培養(yǎng)皿放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中，在0.5、1、1.5、3、5小時等時間點觀察培養(yǎng)皿中小瓜蟲的數(shù)量，實驗連續(xù)重復(fù)3次。

(4)投喂青蒿末復(fù)方制劑草魚血清對鰓上小瓜蟲的影響。將寄生小瓜蟲的草魚鰓絲剪斷，放入培養(yǎng)皿中。選擇使用投喂青蒿末飼料魚的血清滴入鰓絲上(加入40、80 微升)和正常飼料魚的血清滴入鰓絲上(加入40、80 微升)，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后觀察鰓絲上小瓜蟲的活動情況。

5.統(tǒng)計方法

使用Excel記錄數(shù)據(jù)，并做簡單分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗。

小瓜蟲數(shù)量統(tǒng)計：每10 尾魚在顯微鏡每個視野(10×10)小瓜蟲平均個數(shù)。

二、結(jié)果

1.青蒿末復(fù)方制劑對小瓜蟲的預(yù)防

青蒿末對小瓜蟲的預(yù)防效果見表1。從表1 可以看，到攝食藥餌的草魚一直都沒有發(fā)現(xiàn)小瓜蟲寄生，而攝食常規(guī)飼料的草魚在放入寄生小瓜蟲的草魚后第1天就發(fā)現(xiàn)有小瓜蟲寄生，然后每天都有增加。第5天時所有的魚都寄生有小瓜蟲。

表1 青蒿末藥餌對小瓜蟲的效果

2.青蒿末復(fù)方制劑對魚體小瓜蟲的影響(表2)

從表2中可以看到寄生小瓜蟲的魚攝食藥餌后魚體上小瓜蟲的數(shù)量減少情況，可以發(fā)現(xiàn)投喂兩天后實驗組小瓜蟲數(shù)量開始減少，到第5天后減少到平均每個視野只有(2±1.1)個。而投喂正常飼料組則沒有明顯減少，表明青蒿末復(fù)方制劑對小瓜蟲有一定的治療作用。

表2 青蒿末對魚體上小瓜蟲的影響

3.攝食青蒿末復(fù)方制劑草魚血清對小瓜蟲的殺滅作用(表3)

從表3中可以看到，采集到投喂藥餌和正常飼料魚體的血清對離體的小瓜蟲都不具有殺滅作用，而且對照組中沒有加任何血清的小瓜蟲反而先死。

表3 復(fù)方青蒿末制劑投喂后血清對離體小瓜蟲的作用 個

4.攝食青蒿末復(fù)方制劑草魚血清對鰓上小瓜蟲的影響

通過血清離體殺蟲實驗發(fā)現(xiàn)藥餌投喂后魚體血清并沒有殺滅小瓜蟲的作用，因此采取直接在鰓片上滴加血清的實驗來觀察血清對小瓜蟲的作用，結(jié)果見表4 和圖1。從表4 可以看到，投喂藥餌魚體的血清能夠?qū)Ⅵw絲上的小瓜蟲驅(qū)離鰓絲；而投喂正常飼料魚的血清則不具有這個功能。圖1左邊顯示小瓜蟲剛在鰓絲上，右邊則已經(jīng)離開了鰓絲。

表4 青蒿末血清對鰓上小瓜蟲影響

圖1 滴血清后鰓絲上小瓜蟲活動情況

三、討論

目前，對于小瓜蟲的臨床治療研究有很多，而且也提出了很多新的建議和方法，但由于技術(shù)、成本等原因的限制，取得的效果都不太理想。因此，目前對于小瓜蟲的防治還是集中在藥物方面，如倪達(dá)書等(1960)篩選出醋酸亞汞對小瓜蟲有一定效果，同樣有效的還有孔雀石綠，但由于這兩種化學(xué)藥物均被禁止。同時也篩選出硫酸銅、高錳酸鉀、氯化鈉、福爾馬林、生石灰等有一定療效的藥物，但這些藥物大多數(shù)對掠食體階段有一定效果，而對滋養(yǎng)體階段效果不明顯。所以目前國內(nèi)對小瓜蟲病治療的研究主要集中在中草藥上，如辣椒、生姜、五倍子、青蒿琥酯等，想從中找出對小瓜蟲有效的藥物和成分。

本文選取青蒿末作為主要成分的復(fù)方制劑，目的在于研究其對小瓜蟲的防治作用。青蒿末的藥理學(xué)性質(zhì)已有一定的研究基礎(chǔ)，而且其對多種人體和動物寄生蟲具有一定的療效。實驗中得到投喂青蒿末復(fù)方制劑后的草魚能夠抵御小瓜蟲的寄生，同時寄生小瓜蟲的草魚鰓部蟲體數(shù)量也顯著減少，可以肯定青蒿末復(fù)方制劑在防治小瓜蟲方面有一定效果，但青蒿末復(fù)方制劑對小瓜蟲的具體藥理作用還不是很明了。因此筆者設(shè)計了血清實驗，喂藥后的血清并不能殺死小瓜蟲，但能夠有效地將小瓜蟲從鰓部驅(qū)離。徐先棟等(2012)研究得到青蒿末水浸液在高濃度條件下對小瓜蟲具有一定的殺滅作用，與本實驗結(jié)果有一定差異，可能原因為實驗中投喂藥物量少，而青蒿末確實含有一種能夠?qū)π」舷x有害的物質(zhì)，使得蟲體在低濃度條件下不適應(yīng)、高濃度條件下死亡，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。