油茶粕制備復合茶皂素清塘劑產品對魚和蝦毒殺效能的研究

        油茶粕制備復合茶皂素清塘劑產品對魚和蝦毒殺效能的研究

高 晶，馬 力，陳隆升，李志鋼，陳永忠

(1.湖南省林業(yè)科學院，湖南 長沙 410004；2.省部共建木本油料資源利用國家重點實驗室，湖南 長沙 410004；3.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125)

油茶籽經物理壓榨或浸出提取后的副產品稱為油茶粕，我國平均年產量大概為40～80萬t，約為茶油年產量的3倍[1]。茶皂素是指存在于油茶粕中的一種天然糖苷化合物。茶皂素溶于水時，表現出生物活性和表面活性，具有較強的殺菌抑菌作用[2- 3]。此外，茶皂素可與血紅細胞細胞壁組成物質膽固醇相結合，形成水溶性分子復合物，造成血紅細胞滲透壓增大而破裂的溶血現象[4- 5]。但這種毒性對人體無害，而特異性作用于冷血動物，尤其是魚類。魚藤酮來自豆科藤本植物——魚藤的根部，具有殺蟲活性，對大約800多種害蟲均具有殺蟲效果。魚藤進入害蟲體內后，對害蟲的生長發(fā)育起抑制作用，同時減弱其呼吸作用而使害蟲能量供應不足最終死亡。此外，據研究，魚藤酮對人畜無害且對環(huán)境無污染，是一種環(huán)保的殺蟲劑。三氯異氰脲酸和溴氰菊酯都具有較強的殺菌抑菌能力，不僅對環(huán)境和人體安全，而且無致畸和致癌作用。

我國蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)從1978年萌芽開始就經歷飛速發(fā)展。 到2019年，中國對蝦單位面積產量達2.08 t·hm-2。據2020年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒統(tǒng)計，我國南美白對蝦養(yǎng)殖產量已占世界對蝦養(yǎng)殖總產量的80%以上[6]。然而，在對蝦蟹的養(yǎng)殖中常常會遭遇養(yǎng)殖池中固有的魚類以及野生雜魚的威脅，造成飼料競爭，甚至威脅幼蝦蟹苗和處于蛻殼生長期的對蝦，從而嚴重影響蝦蟹的產量，對蝦蟹養(yǎng)殖者造成較大的經濟損失[7- 8]。目前,我國蝦蟹養(yǎng)殖還主要依靠石灰等化學試劑作為清塘劑，大多數存在毒殺無選擇性、成本高和不安全等缺點[9]。因此，開發(fā)一種低毒、高效、低殘留且對環(huán)境友好的對蝦蟹養(yǎng)殖清塘劑具有較好的應用前景。茶皂素屬于三萜類皂角甙，可從油茶粕中提取獲得[10]。油茶粕茶皂素對魚類紅細胞具有溶血作用，可以通過破壞魚鰓的上皮細胞而進入魚鰓的血管，使細胞膜的通透性增加，導致細胞質外滲與血紅細胞解體[11- 12]。而茶皂素對蝦蟹無毒性且可促進蝦的脫殼和生長。此外，茶皂素可通過自然分解或者微生物迅速降解，是一種理想的環(huán)境友好型清塘劑[13]。本文旨在以油茶粕為主要原料，精提主要活性成分茶皂素，尋求高效、高安全性、低成本的新型清塘劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗涉及的雄魚、鯽魚、草魚、基圍蝦、中國對蝦均從農貿市場購得。雄魚體長10～25 cm，鯽魚體長10～15 cm，草魚體長10～25 cm，基圍蝦體長3～6 cm，中國對蝦體長2～5 cm。試驗魚在曝氣的自來水中預飼2 d。試驗魚用水族箱大小120 cm×60 cm×60 cm，試驗水深40 cm左右；試驗蝦用水族箱大小90 cm×50 cm×50 cm，試驗水深30 cm左右。試驗水溫為26 ℃，試驗用pH值在6.0～7.0之間。

1.2 試驗地點

試驗地點在國家林業(yè)局油茶研究開發(fā)中心(于2008年經國家林業(yè)局批準，依托湖南省林業(yè)科學院而成立的專門從事油茶產業(yè)研究與成果轉化的平臺)內。

1.3 試驗設計與方法

1.3.1 茶皂素復合清塘劑的制備 首先，稱取55～75 g茶粕用粉碎機粉碎并過篩網，加入100 ml水攪拌，混合均勻并過濾。然后，加入15～25 g魚藤酮，用渦旋混勻儀(保鮮膜包裹)混合均勻并過濾；加入4～10 g三氯異氰脲酸，用渦旋混勻儀(保鮮膜包裹)混合均勻并過濾；再加入8～15g溴氰菊酯，用渦旋混勻儀(保鮮膜包裹)混合均勻。所得溶液攪拌后抽濾濃縮得到濃縮液，通過噴霧干燥得到清塘劑試驗品。

1.3.2 茶皂素復合清塘劑對常見淡水魚的毒殺計量關系的研究試驗 制備茶皂素55%～70%、魚藤酮15%～25%、三氯異氰脲酸4%～10%、溴氰菊酯8%～15%的復合清塘劑4種(見表1)。每只水族箱放養(yǎng)鯽魚(A1組)、雄魚(B1組)和草魚(C1組)各20條，分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對濃度(參考已有報道和本試驗所用清塘劑成分)加入復合清塘劑1，同時設空白對照組1(cont1 — 1組)，不加任何藥物；另外設置其他品牌清塘劑作為對照組2(cont 2 — A1，其他品牌清塘劑鯽魚對照組/ cont 2 — B1，其他品牌清塘劑雄魚對照組/ cont 2 — C1，其他品牌清塘劑草魚對照組)。試驗時采用氧氣泵充氧，進行48小時觀察記錄，試驗重復2次。

表1 各茶皂素復合清塘劑成分及其含量百分比Tab.1 Percentage of tea saponin-pond clearing agents com-position and content of tea saponin%茶皂素魚藤酮三氯異氰脲酸溴氰菊酯復合清塘劑155251010復合清塘劑26020812復合清塘劑36518611復合清塘劑47016410

復合清塘劑2-4試驗設計與復合清塘劑1一致。復合清塘劑3試驗過程分組如下：鯽魚(A3組)、雄魚(B3組)和草魚(C3組)，空白對照組1(cont 1 — 3組)、其他品牌清塘劑作為對照組2(cont 2 — A3，其他品牌清塘劑鯽魚對照組/ cont 2 — B3，其他品牌清塘劑雄魚對照組/ cont 2 — C3，其他品牌清塘劑草魚對照組)。

1.3.3 茶皂素復合清塘劑對基圍蝦和中國對蝦的毒殺計量關系的研究試驗 蝦鰓與魚鰓的結構和成分完全不同，蝦鰓的主要成分是幾丁質和蛋白質。較低濃度茶皂素對蝦幾乎不產生毒副作用。因此，本試驗選擇較大劑量復合茶皂素清塘劑來驗證對基圍蝦和中國對蝦的毒殺效能。每只水族箱放養(yǎng)基圍蝦(D組)和中國對蝦(E組)各30尾，分別以10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1絕對濃度加入復合清塘劑1，同時設空白對照組3(cont 3 — 1組)，不加任何藥物；另外設置其他品牌清塘劑作為對照組4(cont 4 — D1，其他品牌清塘劑基圍蝦對照組/ cont 4 — E1，其他品牌清塘劑中國對蝦對照組)。采用氧氣泵充氧，進行48小時觀察記錄，試驗重復2次。

復合清塘劑2 — 4試驗設計與復合清塘劑1一致。復合清塘劑3試驗過程分組如下：基圍蝦(D3組)和中國對蝦(E3組)、空白對照組3(cont 3 — 3組)、其他品牌清塘劑作為對照組4(cont 4 — D3，其他品牌清塘劑基圍蝦對照組/ cont 4 — E3，其他品牌清塘劑中國對蝦對照組)。

2 結果與分析

2.1 相同濃度茶皂素復合清塘劑毒殺效能的研究

2.1.1 相同濃度復合清塘劑1毒殺效能的研究

(1)對魚類毒殺效能的研究。分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對濃度復合清塘劑1處理鯽魚、雄魚和草魚，研究不同濃度復合清塘劑1對鯽魚、雄魚和草魚的毒殺效能(見圖1 A-D)。根據結果可知：相同濃度的復合清塘劑1對各試驗用魚的毒殺能力與試驗時間成正比；當復合清塘劑1的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時，各類魚存活率依次是鯽魚<草魚<雄魚；與其他品牌清塘劑相比，復合清塘劑1對鯽魚、雄魚和草魚的毒殺效能更高。

圖1 相同濃度復合清塘劑1對各類魚的毒殺效能Fig.1 The same concentration of the composite pond clearing agent 1s′ poisoning effectiveness on various types of fish

(2)對基圍蝦和中國對蝦毒殺效能的研究。分別以10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1絕對濃度復合清塘劑1處理基圍蝦和中國對蝦，研究不同濃度復合清塘劑1對基圍蝦和中國對蝦的毒殺效能(見圖2 A-D)。根據結果可知：跟其他品牌清塘劑相比，復合清塘劑1對基圍蝦和中國對蝦幾乎無毒殺能力；復合清塘劑1對基圍蝦和中國對蝦的毒殺能力隨著時間的推移并沒有增強。

圖2 相同濃度復合清塘劑1對蝦的毒殺效能Fig.2 The same concentration of the composite pond clearing agent 1s′ poisoning effectiveness on shrimp

2.1.2 相同濃度復合清塘劑2毒殺效能的研究

(1)對魚類毒殺效能的研究。按照1.3所示試驗方法制備復合清塘劑2，同樣以 1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對濃度處理鯽魚、雄魚和草魚，結果顯示復合清塘劑2對鯽魚、雄魚和草魚的毒殺效能與復合清塘劑1結果類似。

(2)對基圍蝦和中國對蝦毒殺效能的研究。制得復合清塘劑2，選擇10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1絕對濃度處理基圍蝦和中國對蝦，結果顯示復合清塘劑2對基圍蝦和中國對蝦的毒殺效能與復合清塘劑1結果類似。

2.1.3 相同濃度復合清塘劑3毒殺效能的研究

(1)對魚類毒殺效能的研究

分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對濃度復合清塘劑3處理鯽魚、雄魚和草魚，研究不同濃度復合清塘劑3對鯽魚、雄魚和草魚的毒殺效能(見圖3 A-D)。根據結果可知：相同濃度的復合清塘劑3對各試驗用魚的毒殺能力與試驗時間成正比；與其他品牌清塘劑和復合清塘劑3相比，復合清塘劑3對鯽魚、雄魚和草魚的毒殺效能更強；當復合清塘劑3的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時，各類魚存活率依次是鯽魚<草魚<雄魚。

圖3 相同濃度復合清塘劑3對各類魚的毒殺效能Fig.3 The same concentration of the composite pond clearing agents 3s′ poisoning effectiveness on various types of fish

(2)對基圍蝦和中國對蝦毒殺效能的研究。分別以10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1絕對濃度復合清塘劑3處理基圍蝦和中國對蝦，研究不同濃度復合清塘劑3對基圍蝦和中國對蝦的毒殺效能(見圖4 A-D)。根據結果可知：跟其他品牌清塘劑相比，復合清塘劑3對基圍蝦和中國對蝦幾乎無毒殺能力；復合清塘劑3對基圍蝦和中國對蝦的毒殺能力隨著時間的推移并沒有增強。

圖4 相同濃度復合清塘劑3對蝦的毒殺效能Fig.4 The same concentration of the composite pond clearing agents 3s′ poisoning effectiveness on shrimp

2.1.4 相同濃度復合清塘劑4毒殺效能的研究

(1)對魚類毒殺效能的研究。同樣的試驗方法和設計研究復合清塘劑4對鯽魚、雄魚和草魚的毒殺效能，結果顯示復合清塘劑4對鯽魚、雄魚和草魚的毒殺效能與復合清塘劑3結果類似。

(2)對基圍蝦和中國對蝦毒殺效能的研究。復合清塘劑4對基圍蝦和中國對蝦的毒殺效能與復合清塘劑3結果類似。

2.2 不同濃度茶皂素復合清塘劑對魚類毒殺效能的研究

2.2.1 不同濃度復合清塘劑1對魚類毒殺效能的研究 分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對濃度復合清塘劑1處理鯽魚、雄魚和草魚，研究不同濃度復合清塘劑1對鯽魚草魚和雄魚的毒殺效能(見圖5 A-C)。根據結果可知：不同濃度的復合清塘劑1對各試驗用魚的毒殺能力隨著時間推移而增強；當復合清塘劑1的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時，1.5 mg·L-1復合清塘劑1在36 h對各類魚的毒殺效能最強；當復合清塘劑1的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時，2.0 mg·L-1復合清塘劑1在24 h時對各類魚的毒殺效能最強。

圖5 不同濃度復合清塘劑1對各類魚的毒殺效能Fig.5 The different concentration of the composite pond clearing agents 1s′ poisoning effectiveness on various types of fish

2.2.2 不同濃度復合清塘劑2對魚類毒殺效能的研究 不同濃度復合清塘劑2處理鯽魚、雄魚和草魚的毒殺效能與復合清塘劑1的毒殺效能類似。

2.2.3 不同濃度復合清塘劑3對魚類毒殺效能的研究 分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對濃度復合清塘劑3處理鯽魚、雄魚和草魚，研究不同濃度復合清塘劑3對鯽魚草魚和雄魚的毒殺效能(見圖6 A-C)。根據結果可知：不同濃度的復合清塘劑3對各試驗用魚的毒殺能力隨著時間推移而增強；不同濃度的復合清塘劑3對各類魚的毒殺能力相似，當復合清塘劑3的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時，1.5 mg·L-1復合清塘劑3在36 h時對各類魚的毒殺效能最強，2.0 mg·L-1復合清塘劑3在24小時對各類魚的毒殺效能最強，3.5 mg·L-1復合清塘劑3在8 h對各類魚的毒殺效能最強。

圖 6不同濃度復合清塘劑3對各類魚的毒殺效能Fig.6 The different concentration of the composite pond clearing agents 3s′ poisoning effectiveness on various types of fish

2.2.4 不同濃度復合清塘劑4對魚類毒殺效能的研究 結果顯示不同濃度復合清塘劑4處理鯽魚、雄魚和草魚的毒殺效能與復合清塘劑3結果類似。

2.3 各復合清塘劑對魚毒活性持續(xù)能力的研究

所有水族箱備水，投入1.5 mg·L-1復合清塘劑1，48 h后每只水族箱放養(yǎng)鯽魚、雄魚和草魚各20條，基圍蝦和中國對蝦各30尾，觀察48 h。在試驗持續(xù)的48 h內，鯽魚、雄魚、草魚、基圍蝦和中國對蝦均無死亡，表明本研究所使用復合清塘劑在投入養(yǎng)殖塘48 h后清塘效能減弱或消失，對塘內魚和蝦類幾乎不具有毒性。

3 結論與討論

茶皂素對蝦蟹養(yǎng)殖中固有魚類存在較強的魚毒活性。在生產實際中，當清塘劑中茶皂素含量在55%～70%時，當使用濃度達到1.5 mg·L-1時，36 h即可將養(yǎng)殖塘中鯽魚、雄魚和草魚等常見魚類清理干凈，并對基圍蝦和中國對蝦無毒性；當使用濃度達到3.5 mg·L-1時，用藥8 h，試驗用魚死亡率可達到100%。此外，蝦蟹養(yǎng)殖生產中，使用茶皂素復合清塘劑清塘48 h后，茶皂素復合清塘劑可在自然條件下降解，不影響后續(xù)的生產養(yǎng)殖[8，14]。

目前，國內外蝦蟹養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，全球對蝦養(yǎng)殖產量高達400萬t以上，預計將會持續(xù)增長，蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)仍是水產養(yǎng)殖業(yè)中具有前景和活力的行業(yè)[15-16]。然而各類固有魚和細菌等的存在阻礙了蝦蟹養(yǎng)殖的總產量和存活率，造成了較大的經濟損失[17]。因此，尋求安全環(huán)保、持續(xù)性好的清塘劑產品十分關鍵。本文所述茶皂素復合清塘劑具有制備工藝簡單、生產成本低、操作性簡單等優(yōu)點，具有高效、低殘留的特點,適用于工業(yè)生產，可為現實生產實際中固有魚類的清除提供理論基礎和指導。