論文：大蒜素在鯉、鯽血漿中的藥物代謝動力學研究

大蒜素在鯉、鯽血漿中的藥物代謝動力學研究

潘浩1,2，王荻1，盧彤巖1

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,哈爾濱150070;2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院,上海201306)

摘要：建立鯉(Cyprinus carpio specularis)、鯽(Carassius auratus)血漿中大蒜素含量的氣相色譜檢測方法,并研究大蒜素在鯉、鯽體內(nèi)的藥物代謝動力學特征。對鯉、鯽以7.5 mg/kg的劑量單次口灌大蒜素，于停藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h采集血漿，采用氣相色譜法(GC)檢測藥物含量，通過DAS3.0軟件分析藥動學參數(shù)。結(jié)果顯示：二烯丙基二硫醚(DADS)和二烯丙基三硫醚(DATS)的最低檢測限均為10 ng/mL ，DADS、DATS在鯉血漿中的平均回收率分別為77.05%～97.98%、73.39%～108.51%，在鯽血漿中的平均回收率分別為87.05%～ 95.68%、83.69%～102.75%。藥物的兩種主要成分在健康鯉鯽體內(nèi)吸收較完全，分布廣泛，DADS較DATS吸收快，消除慢。

關鍵詞：鯉(Cyprinus carpio specularis);鯽(Carassius auratus)氣相色譜法；大蒜素；藥物代謝動力學

大蒜素(garlicin)，化學名為二烯丙基三硫化物，是大蒜的主要有效成分，有刺鼻氣味，微溶于水，溶于乙醇、苯、乙醚等有機溶劑[1]。大蒜素性質(zhì)不穩(wěn)定，常溫下極易揮發(fā)，可進一步分解生成性質(zhì)穩(wěn)定的二烯丙基二硫化物(DADS) 、二烯丙基硫化物(DAS) 、阿霍烯(ajoene) 及少量的二烯丙基硫化合物(DATS)等[2]。大蒜素抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌都具有較好的抑制作用[3]，對有益菌則無抑制作用，而且大蒜素無毒副作用，不會產(chǎn)生藥物殘留，不會導致細菌產(chǎn)生耐藥性，是抗生素的首選替代藥物[4]。

目前，對大蒜素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為添加劑的研究己經(jīng)做了大量的工作。有研究表明，飼料中添加適量大蒜素可顯著提升魚的攝食量與生長速度[5-9]。有關大蒜素抗菌作用也有諸多報道，李嬋等[10]在虹鱒飼料中添加15 mg/kg的大蒜素,結(jié)果表明大蒜素顯著提高了腎臟中堿性磷酸酶的活力；時威等[4]的研究表明，大蒜素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌作用；宋文華等[11]對草魚的研究表明飼料中添加0.4%、0.8%大蒜素組的草魚血清超氧化物岐化酶活性高于對照組。但尚未見關于大蒜素在魚體內(nèi)的藥代動力學研究報道，本實驗就此進行研究，通過計算有關的藥動學參數(shù)，為制定大蒜素在鯉、鯽養(yǎng)殖病害防治中的科學、合理給藥方案提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物

1.1.1試驗魚

鯉(Cyprinuscarpiospecularis)(1.3±0.2)kg、鯽(Carassiusauratus)(0.7±0.2)kg，由黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭冷水性魚類試驗站提供；試驗在自動循環(huán)水族缸中進行，每缸兩尾試驗魚，試驗期間持續(xù)給氧。試驗魚暫養(yǎng)3 d，期間正常飼喂全價基礎飼料。給藥前停飼24 h，試驗期間不投喂，水溫保持在(20±0.5)℃，持續(xù)給氧，保持溶氧濃度大于6.00 mg/L。

1.1.2藥品與試劑

DADS標準品：含量94.2%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100384-201403；DATS標準品：75%，上海安普CNW，貨號：CFEQ-4-440081-0005。二氯甲烷(A.R)；正己烷(GC),大蒜油，含量98%，北京漁經(jīng)生物技術有限責任公司。

1.1.3試驗儀器

安捷倫7890B氣相色譜儀，Agilent儀器公司；3K15離心機，Sigma公司；FJ200-S調(diào)速混勻器，上海標準模型廠；SB5002電子天平，上表電子儀器廠；MD200-2氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1給藥劑量及血漿采集

以7.5 mg/kg體質(zhì)量的給藥劑量對鯉、鯽單次口灌大蒜素油溶液(18.75 μL大蒜油溶于10 mL植物油)，各18尾魚，隨機分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組6尾魚。單次口灌大蒜素后，采用活體多次體側(cè)取血法[12]，各劑量組取樣方案為，Ⅰ組分別于給藥后 0.25、1、4、12、48 h，Ⅱ組于 0.5、1.5、6、24、72 h，Ⅲ組于 0.75、2、8、36 h 在試驗魚尾部采集血液1 mL(注射器事先用3‰肝素鈉潤洗)，每次采樣前后均用 75%酒精棉球于進針部位進行消毒，并在采樣后按壓針孔部位以止血。血液樣品4 000 r/min離心10 min后，取上層血漿置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2血漿樣品處理

從-20 ℃冰箱中取出血漿樣品，于冰上自然解凍后搖勻，取0.5 mL血漿，加0.5 mL正己烷渦旋0.5 min，3 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機濾膜上機待測。

1.2.3氣相色譜條件

色譜柱:Agilent 7890B HP-5柱(30 m×320 μm×0.25 μm)；柱溫：50 ℃(25 ℃/min)升至150℃，保持2 min,(30 ℃/min)升至240 ℃，保持1 min；檢測器：火焰光度檢測器FPD(S)；檢測器溫度：200 ℃，空氣流量：60 mL/min，氫氣燃氣流量：60 mL/min，尾吹氣流量：60 mL/min；進樣量：1 μL，不分流進樣；進樣口溫度：160 ℃；燃氣：氫氣，純度≥99.999%；助燃氣：空氣；載氣：高純氮氣，恒流模式，2 mL/min。

1.2.4標準曲線的繪制

用正己烷將DATS、DADS標準品稀釋成濃度為25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 ng/mL的混合標準工作液，精確吸取1 μL注入氣相色譜儀，以檢測峰面積為縱坐標，大蒜素質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，分別求出DADS、DATS的回歸方程和相關系數(shù)。

1.2.5回收率測定

取空白血漿0.5 mL，添加100、500、1 000 μg/L的混合標準液，添加標準液的總體積為1 mL，設三個平行組，混勻靜置一段時間后，使藥物充分滲入組織中，按照樣品前處理的方法處理后，進行測定。按照公式進行計算：

回收率=實測藥物濃度/實際藥物濃度×100%

1.2.6精密度測定

在1 d內(nèi)分別重復測定上述6個濃度梯度的同一樣品3次，在一周內(nèi)重復測定3次，計算出樣品在不同濃度梯度下的相對標準偏差，計算出日內(nèi)和日間精密度。

1.2.7數(shù)據(jù)處理

標準曲線由氣象色譜檢測報告所得，藥-時曲線采用Microsoft Excel軟件繪制；藥動學模型擬合及參數(shù)計算使用DAS3.0軟件處理。

2結(jié)果

2.1標準曲線及其檢測限

應用本試驗建立的氣相色譜檢測方法，DADS和DATS的最低檢測限均為10 ng/mL。以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標x，以峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線如圖1、圖2所示?；貧w方程分別為：

y=9.112 74e-2x2+3.764 00x-802.576 7，r=0.999 25；

y=6.646 68e-2x2-3.379 01x+64.551 61，r=0.999 19。

圖1　DADS標準曲線

圖2　DATS標準曲線

2.2標準品與樣品色譜圖

在本試驗條件下,DADS的出峰時間在3.7 min左右,DATS的出峰時間在5.2 min左右。與標準品色譜圖對比可以發(fā)現(xiàn),兩者的色譜峰和出峰時間一致。

2.3回收率與精密度

本試驗條件下，混合標準液在鯉血漿的回收率分別為91%～97%，在鯽血漿的回收率為73%～100%。日內(nèi)精密度分別為0.38%±0.053%和0.40%±0.060%，日間精密度分別為0.28%±0.069%和0.45%±0.077%。

2.4大蒜素在鯉、鯽體內(nèi)的藥時曲線與主要藥動學參數(shù)

DADS、DATS在鯉、鯽血漿中藥動學特征均符合一級吸收二室開放模型，其代謝方程分別為：C=27.02e-0.14t+0.001e-0.05t-27.021e-27.02t、C=26.72e-0.23t+0.001e-0.002 5t-26.721e-173.87t、C=26.04e-0.57t+18.3e-0.23t-44.34e-44.34t、C=7.07e-0.61t+12.18e-0.11t-19.25e-19.25t。

主要藥物代謝動力學參數(shù)如表1，藥時數(shù)據(jù)如表2。圖 3、4 顯示的是在(20±0.5)℃時以7.5 mg/kg體質(zhì)量藥量給鯉、鯽單劑量口灌大蒜素后，藥物在鯉、鯽血漿的濃度隨時間變化的規(guī)律。

表1　DADS和DATS在鯉、鯽血漿中的藥代動力學參數(shù)

注:B.消除相的零時截距；β.消除速率常數(shù)；A.分布相的零時截距；α.分布速率常數(shù)； ka.藥物吸收速率常數(shù)； TL.延滯時間； T1/2β.消除相半衰期；T1/2α.分布相半衰期； T1/2ka.吸收相半衰期； K21.藥物自周邊室到中央室的一級轉(zhuǎn)運速率； K12.藥物自中央室到周邊室的一級轉(zhuǎn)運速率；K10.藥物自中央室的消除速率； AUC.藥時曲線下總面積； CL(s).體積內(nèi)總消除率；Cmax.峰濃度； Tmax.達峰時間； V/F(c).表觀分布容積。

表2　DADS和DATS在鯉、鯽血漿中的濃度

圖3　DADS、DATS在鯉魚血漿中的濃度

圖4　DADS、DATS在鯽魚血漿中的濃度

3討論

氣相色譜法是近年興起的一種新型、高效的色譜技術，適宜于檢測易于揮發(fā)但不會發(fā)生分解的化合物。氣相色譜的典型用途包括測試某一特定化合物的純度以及對混合物中的各組分進行分離鑒定(同時還可以測定各組分的相對含量)。在某些情況下，氣相色譜還可能對化合物的表征有所幫助。大蒜素的兩種主要有效成分DADS、DATS性質(zhì)相對穩(wěn)定但極易揮發(fā)，因而氣相色譜法可以在其揮發(fā)的同時較為完全地測定其含量。

由藥-時曲線可以看出，DADS在鯉、鯽的血漿組織中均有雙峰出現(xiàn)，魏鳳環(huán)等[20]研究表明:雙峰乃至多峰現(xiàn)象出現(xiàn)的機制被認為可能是腸-肝循環(huán)(即藥物經(jīng)膽汁或部分藥物經(jīng)膽汁排入腸道，在腸道中藥物成分又重新被吸收，經(jīng)門靜脈又返回肝臟的現(xiàn)象)和胃腸道的多部位吸收(胃腸道不同部位有多個不同的吸收位點，由于不同位點的腔道內(nèi)膜對藥物的通透性不同，故口服后不同部位對藥物的吸收時間和吸收速率并不一致，使被吸收的藥物在血液中疊加)，而腸-肝循環(huán)又被認為是藥-時曲線產(chǎn)生雙峰或者多峰現(xiàn)象最有可能的一種機制，如果存在腸-肝循環(huán)，則第二峰的濃度要低于第一峰[21-22]。本試驗中，DADS在鯽的血漿組織內(nèi)的第二峰濃度遠高于第一峰，明顯不符合腸-肝循環(huán)的特征；DADS在鯉血漿中第二峰濃度高于第一峰，推測第二峰濃度較高的原因可能與藥物于某一時間點的集中轉(zhuǎn)運、排泄以及腎小管的重吸收有關。因此， DADS在鯉鯽血漿中出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象的機制并不是為腸-肝循環(huán)，推測本試驗中大蒜素在鯉、鯽血漿中的藥物代謝動力學與其它常規(guī)藥物不同，其吸收分布機制有待進一步研究。

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