論文：卵黃抗體在水產養(yǎng)殖病害防治中的應用

卵黃抗體在水產養(yǎng)殖病害防治中的應用

俞晶晶 ，蕭槍槍 ，鄭晨陽 ，趙軒 ，林晨韜 

（1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.福建師范大學南方海洋研究院，福建省特色海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，福建 福州 350117；3.福建師范大學海洋生物醫(yī)藥與制品產業(yè)化開發(fā)技術公共服務平臺，福建 福州 350117）

我國作為水產養(yǎng)殖大國，每年的水產品產量約占世界水產養(yǎng)殖產量的70%，位居世界第一，也是世界上唯一養(yǎng)殖量大于捕撈量的國家。但由于水產動物的集約化養(yǎng)殖，導致水環(huán)境日益惡化，水產動物病害頻繁發(fā)生，造成了巨大的經濟損失，因此防控和治療水產動物疾病十分重要。抗生素能有效地防治水產養(yǎng)殖中的細菌性疾病，但長期使用后，也暴露出病原菌產生耐藥性及藥物殘留等問題，濫用抗生素不僅污染水體還會危害人體健康。2020 年7 月國家頒布了飼料“禁抗令”，禁止飼料中添加含促生長類藥物，禁令的實施促進了抗生素替代品的研制。目前常見的抗生素替代品有益生菌、中草藥、噬菌體、免疫糖類、飼料酶制劑以及卵黃抗體（IgY）等，其中卵黃抗體因具有不產生耐藥性、制備簡單、產量大、穩(wěn)定性好、符合動物福利要求、不激活哺乳動物的補體系統等優(yōu)勢，越來越受到人們的關注。

卵黃抗體是一種免疫球蛋白，主要存在于禽類、兩棲動物以及爬行動物的血清中，目前研究最多的是雞的卵黃抗體。1893 年，Klemperer首次證實了對破傷風毒素的免疫力可以從母雞身上轉移到小雞身上，即蛋雞經過抗原免疫后，產下雞蛋的蛋黃中存在特異性抗體。1969 年，Leslie 等對雞的免疫球蛋白結構和功能進行研究后，將其命名為卵黃抗體。隨著科研技術的發(fā)展以及生產領域的擴大，人們對抗體的需求量越來越大，也更重視對實驗動物的保護，卵黃抗體逐漸被科研人員注意到，其相關研究報道也越來越多。近年來，卵黃抗體技術與基因工程技術、免疫檢測技術、磁珠技術、噬菌體展示技術等多種當前主流的抗體技術相結合，應用于病原體檢測和診斷、動物疾病治療、食品工程、新藥研發(fā)以及快速大量生產科研用抗體等方面?，F從卵黃抗體的基本特性及其在水產養(yǎng)殖病害防治中的應用等方面進行歸納總結，以期為今后卵黃抗體的研究及應用提供參考。

1 卵黃抗體的基本特性

1.1 分子生物學特性及理化性質

卵黃抗體由2 條相同的重鏈和2 條相同的輕鏈組成，通過二硫鍵進行連接，分子質量約為1.8×10u，其中重鏈分子質量約為6.5×10u，輕鏈的分子質量約為 2.5×10u，輕鏈由 1 個可變區(qū)（V）和1 個恒定區(qū)（C）組成，重鏈由 1 個可變區(qū)（V）和 4個恒定區(qū)（C，C，C，C）組成。卵黃抗體的重鏈沒有鉸鏈區(qū)，所以抗原結合活性會受到一定的影響，還可能存在空間阻位，但這恰好增加了它的穩(wěn)定性，因此卵黃抗體具有較好的耐熱、耐酸和耐酶解的能力。卵黃抗體的等電點約為5.1，由于卵黃抗體處在富含脂質的環(huán)境中（蛋黃），因此其疏水性較高。

卵黃抗體的活性可受溫度、pH 值和消化酶的影響。溫度為60~65 ℃時，卵黃抗體生物活性稍稍降低，溫度 >70 ℃時，15 min 后卵黃抗體活性會明顯下降。一般而言，低溫狀態(tài)下，抗體活性變化較小，卵黃抗體可長期保存。研究結果顯示，溫度為4 ℃時，卵黃抗體可保存5 年，室溫下則可保存6 個月。此外，在卵黃抗體中加入葡萄糖、甘露糖等糖類，可增加卵黃抗體的熱穩(wěn)定性。pH 值對卵黃抗體的活性影響表現為4.011.0 時，其活性下降較為明顯。此外，酸性條件下加入巖藻糖或者山梨醇可使卵黃抗體的活性不受影響。與其他蛋白質一樣，卵黃抗體也會受到蛋白水解酶的影響。研究結果顯示，pH 值及酶與底物的比例會影響卵黃抗體對胃蛋白酶的敏感性，另外在胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化8 h 后，卵黃抗體仍能保留部分活性。

1.2 卵黃抗體的產生及作用機理

當禽類受到外來抗原的免疫刺激后，法氏囊中的B 淋巴細胞就會分化成為漿細胞，分泌特異性抗體進入血液循環(huán)，當血液流經卵巢時，特異性抗體通過識別結合到卵黃膜表面受體上，通過主動轉運的方式轉移到蛋黃中并積累，從而形成卵黃抗體。目前，已報道的特異性卵黃抗體受體主要有3 種，分別為 FcRY、CHIPR-AB1 和 ggFcR。

卵黃抗體可抑制特定病原菌的生長，但其作用機制一直存在爭議。目前，被認可的作用機制主要為以下5 種。（1）卵黃抗體直接作用于細菌細胞壁，使其細胞的完整性遭到破壞，從而抑制病原菌的生長，Xu 等研究顯示，相較于非特異性卵黃抗體，用特異性卵黃抗體處理過的愛德華氏菌2CDM001 表面結合了更多的免疫金顆粒，且空白對照組中細菌表面未發(fā)現免疫金顆粒。這較好得證實了該作用機制；（2）卵黃抗體直接作用于細菌菌毛，使病原菌不能黏附細胞，從而阻斷感染。Wang 等研究結果顯示，感染大腸埃希菌K88 的仔豬口服特異性卵黃抗體后，黏附在其空腸和回腸上的細菌數量顯著減少，因此認為，特異性卵黃抗體能夠阻止大腸埃希菌K88 黏附在仔豬的空腸和回腸黏膜上，并可顯著減少結腸內容物中大腸埃希菌數量和腸毒素表達；（3）卵黃抗體可增強巨噬細胞的吞噬活性，幫助機體更有效地清除有害物質。Qin 等研究結果顯示，特異性卵黃抗體可通過增強誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）吞噬細胞氧化酶的表達來增加巨噬細胞介導的呼吸爆發(fā)，即增加一氧化氮和超氧陰離子的產生，從而保護宿主免受微生物侵襲。（4）卵黃抗體可作用于病原菌產生的內毒素（LPS）。LPS 是革蘭氏陰性菌代謝過程中分泌的一種外膜物質，可以引起發(fā)熱、細胞及組織損傷、休克甚至死亡等；（5）卵黃抗體可在消化酶的作用下分解為小肽，并結合于病原菌的黏附因子，使得病原菌不能黏附易感細胞，進而喪失致病性。

1.3 卵黃抗體的分離提取和純化

雞的卵黃中主要成分為水、脂肪和蛋白質，其占比分別為48%，30.5%和17.8%，其中蛋白質與脂肪結合形成脂蛋白，不與脂肪結合則為水溶性蛋白，水溶性蛋白包括α、β 和γ 3 種活性蛋白，卵黃抗體為γ 活性蛋白。從卵黃中獲得卵黃抗體包括分離和提取，其中分離的原理是去除卵黃中的脂肪以及脂蛋白，獲得水溶性組分，常用的分離方法有水稀釋法、三氯甲烷萃取法和聚乙二醇法等。提取則是將大量的卵黃抗體從水溶性組分中提取出來，常用的提取方法為水稀釋法和硫酸銨沉淀法。為了滿足不同的使用目的，可將提取出來的卵黃抗體進行純化，常見方法有離子交換法、凝膠過濾法和親和層析法等。

2 卵黃抗體在水產養(yǎng)殖病害防治中的應用

目前，我國水產養(yǎng)殖病害種類有200 多種，常見病害有幾十種，其中細菌性疾病占比為57.63%，病毒性疾病占比為11.02%。在水產養(yǎng)殖病害防治中，卵黃抗體對細菌性和病毒性疾病都有很好的防治作用。卵黃抗體使用方式包括口服、注射和浸泡，根據不同的情況可選擇不同的使用方式，以達到最好的免疫效果。其中注射的方式最直接，可提高血清中的抗體水平，在防治感染消化道致病菌時，口服的效果則最好。

2.1 卵黃抗體防治水產動物細菌性疾病

在水產養(yǎng)殖過程中，水產動物易受到創(chuàng)傷弧菌、遲緩愛德華氏菌、副溶血性弧菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、燦爛弧菌、溶藻弧菌等細菌的侵害，從而引發(fā)細菌性疾病。Qin 等研究結果顯示，抗嗜水氣單胞菌卵黃抗體可預防團頭魴感染嗜水氣單胞菌，同時在治療性試驗中也有較好的效果；Xu 等在大菱鲆的飼料中添加微囊化的抗遲緩愛德華氏菌卵黃抗體，可預防大菱鲆感染遲緩愛德華氏菌；海參腐皮綜合征是養(yǎng)殖海參過程中常見且嚴重的疾病，發(fā)病初期常以細菌感染為主，且其病原菌還具有多樣性和地域性。Xu 等研究結果顯示，對海參腹腔注射黃海希瓦氏菌AP629 后，通過注射和喂食特異性卵黃抗體都能夠顯著降低其死亡率。關于卵黃抗體防治水產動物細菌性疾病的研究報道，見表1。

表1 卵黃抗體在水產動物細菌性疾病中的應用（部分）

續(xù)表

2.2 卵黃抗體防治水產動物病毒性疾病

異育銀鯽易受到鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）的感染，爆發(fā)鰓出血病，造成大量死亡。寇海燕等為防治異育銀鯽的鰓出血病，利用原核表達系統產生具有免疫原性的重組CyHV-2-ORF72 衣殼蛋白，將其作為抗原免疫蛋雞，后獲得具有高效價抗體的雞蛋，并采用微包膜和凍干技術將免疫蛋制成全蛋粉。對已發(fā)病的異育銀鯽投喂添加抗CyHV-2-ORF72 的免疫全蛋粉的飼料，發(fā)現添加抗CyHV-2-ORF72 的免疫全蛋粉的試驗組異育銀鯽的成活率顯著高于未添加的對照組。病毒性神經壞死?。╒NN），也稱病毒性腦病和視網膜病，其主要傳染病原是神經壞死病毒。該病在全球多種海水和淡水魚類流行，且在魚苗期的致死率可達100%，被認為是最嚴重的病毒性疾病之一。伊麗竹克隆并表達赤點石斑神經壞死病毒（RGNNV）的重組衣殼蛋白，并將其作為抗原免疫蛋雞制備抗RGNNV 特異性卵黃抗體，后將卵黃抗體-病毒混合液感染石斑魚鰭條細胞（GF-1），經Western blot 分析后發(fā)現，特異性抗RGNNV 的卵黃抗體可抑制病毒在GF-1 細胞中的復制，保護GF-1 細胞免受病毒感染。白斑綜合征病毒（WSSV）感染養(yǎng)殖蝦會出現高死亡率，其是由VP28、VP19 和VP15 基因編碼主要致病蛋白。Lu等利用基因重組技術將 VP28、VP19 和 VP15 串聯表達制成DNA 疫苗，用其免疫蛋雞獲得特異性卵黃抗體，另外還以滅活的WSSV 作為抗原免疫蛋雞獲得特異性卵黃抗體。結果顯示，用滅活WSSV或DNA 疫苗免疫產生的特異性卵黃抗體處理的試驗組其存活率分別為73.3%和33.3%，陽性對照組則在7 d 內全部死亡。盧亞楠進一步探究了抗WSSV 特異性卵黃抗體的被動免疫保護效果，研究結果顯示，注射、口服和浸泡3 種給藥方式均對免疫動物產生保護，此外，DNA 疫苗卵黃抗體的保護效果較滅活疫苗卵黃抗體的保護效果差。綜上研究均顯示，卵黃抗體對防治水產動物病毒性疾病有較好的效果。

3 結語

卵黃抗體作為一種綠色有效的抗生素替代品，在水產養(yǎng)殖病害防治中有著良好的應用前景，但實際應用過程中仍存在較多問題。首先大多數試驗都證明卵黃抗體對革蘭氏陰性菌有效，但對革蘭氏陽性菌抑制效果的報道較少，這使得卵黃抗體的使用范圍受到限制；其次，制備高質量的卵黃抗體的成本要遠高于使用常規(guī)抗生素的成本，因此需要找到一種既能降低生產成本又能提高卵黃抗體質量的方法；再次，對于卵黃抗體的商品化生產，沒有規(guī)范的操作過程和統一的質量標準。今后隨著對卵黃抗體研究的逐漸深入，將上述問題解決后，卵黃抗體有望得到廣泛應用。