魚(yú)苗規(guī)格對(duì)草魚(yú)細(xì)菌二聯(lián)苗浸泡免疫接種效果影響

魚(yú)苗規(guī)格對(duì)草魚(yú)細(xì)菌二聯(lián)苗浸泡免疫接種效果影響

鞏 華 鐘國(guó)東 趙長(zhǎng)臣 江小燕 賴迎迢

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380；2.韶關(guān)市始興縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，始興縣魚(yú)類繁育良種場(chǎng)，廣東 韶關(guān) 512500)

魚(yú)用疫苗因其可安全有效地預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疫病，已成為國(guó)際上水產(chǎn)疫病防控的主流技術(shù)。其中，浸泡免疫可對(duì)魚(yú)群進(jìn)行免疫，操作簡(jiǎn)單、短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)批量接種、對(duì)魚(yú)刺激小、魚(yú)種接種效果更佳，具有良好的推廣價(jià)值，目前在歐美、東亞等不少國(guó)家和地區(qū)都有商品化產(chǎn)品，都有浸泡免疫操作方法推薦(吳淑勤等，2014)。浸泡免疫接種時(shí)，疫苗效力存在許多變量，其中受免魚(yú)的大小是重要考慮因素之一。特別是浸泡免疫過(guò)程中，通過(guò)大量研究表明，抗原攝取主要依賴于吞噬作用經(jīng)過(guò)黏膜組織如硬骨魚(yú)的鰓、皮膚、側(cè)線和胃腸道(B?gwald J等，2019)，其系統(tǒng)發(fā)育是否完善嚴(yán)重影響免疫應(yīng)答效果。

草魚(yú)嗜水氣單胞菌敗血癥、銅綠假單胞菌赤皮病二聯(lián)蜂膠滅活疫苗(GA201 株＋JP802 株)在小樣本、小范圍、環(huán)境恒定可控條件下的浸泡免疫安全性、效力等試驗(yàn)表明，該疫苗對(duì)草魚(yú)安全、有效。為科學(xué)評(píng)價(jià)該疫苗在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中的安全性、效力和使用效果，筆者開(kāi)展了不同規(guī)格的草魚(yú)種浸泡免疫的效果試驗(yàn)，評(píng)估該疫苗在草魚(yú)產(chǎn)業(yè)中的操作使用參數(shù)值，以期為生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)研究等提供數(shù)據(jù)支撐。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

(1)疫苗。草魚(yú)嗜水氣單胞菌敗血癥、銅綠假單胞菌赤皮病二聯(lián)蜂膠滅活疫苗(GA201 株＋JP802 株)均為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水產(chǎn)疫苗工程技術(shù)中心試制產(chǎn)品，經(jīng)安全性檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)合格。

(2)苗種培育池。池塘位于韶關(guān)市始興省級(jí)良種場(chǎng)生產(chǎn)車間內(nèi)，為泥底池塘、水泥護(hù)坡。池塘面積為5 畝，水深2 米左右，配置葉輪式增氧機(jī)1～2 臺(tái)，在距離投餌機(jī)20 米處安裝1 臺(tái)水車式增氧機(jī)。試驗(yàn)前全池潑灑生石灰清塘。

(3)草魚(yú)苗種。自繁水花培育至0.35 克/尾，魚(yú)群采食、游泳正常，無(wú)其他傳染病。漁場(chǎng)按正常免疫程序進(jìn)行免疫，經(jīng)檢測(cè)無(wú)攜帶草魚(yú)出血病呼腸孤病毒、嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌等病原后，分別準(zhǔn)備規(guī)格0.35 克/尾(7 朝)、0.65 克/尾(8 朝)、1.05 克/尾(9 朝)、2.30 克/尾(10 朝)的草魚(yú)苗種。

2.試驗(yàn)方法

(1)試驗(yàn)分組。試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)分組與處理情況統(tǒng)計(jì)

(2)飼養(yǎng)管理?？亓贤段梗娥D率為5%～8%，每天7:00、11:30、16:00 按1∶1∶1 均勻投喂。內(nèi)服保健主要為復(fù)合多維和乳酸菌、酵母菌等微生態(tài)制劑。

(3)水質(zhì)管理。墨江水經(jīng)引流、沉淀、過(guò)濾后引入池塘，生石灰潑灑調(diào)節(jié)堿度120～150毫摩爾/升、硬度80～120毫摩爾/升、pH 7.5～8.5。日常檢測(cè)水質(zhì)，當(dāng)氨氮、亞硝酸鹽超過(guò)規(guī)定范圍即調(diào)水、換水，pH 超出范圍則用碳酸氫鈉和生物酸調(diào)節(jié)，溶氧超出范圍則調(diào)整增氧機(jī)的開(kāi)關(guān)時(shí)間，透明度超出范圍則進(jìn)行換水。每10～15 天換水1次，一般每次換水30厘米。

(4)浸泡免疫。按照產(chǎn)品使用說(shuō)明，配制0.5%的食鹽水(100升水加1千克食鹽)，加入10瓶疫苗(100 毫升/瓶)，浸泡魚(yú)苗20 分鐘，完成100 千克魚(yú)苗浸泡，浸泡過(guò)程中要不間斷充氣。

(5)健康狀況。觀察魚(yú)體健康狀況，特別是免疫接種后觀察魚(yú)群的精神、采食、游泳情況，觀察有無(wú)應(yīng)激反應(yīng)、是否出現(xiàn)死亡。通常早晨、傍晚及投料攝食期間為最佳觀察時(shí)間，靜候在塘邊下風(fēng)處，觀察草魚(yú)的活動(dòng)情況，若疫苗安全性不佳，能見(jiàn)病魚(yú)出現(xiàn)；靜候投料臺(tái)邊觀察草魚(yú)攝食情況，以判斷魚(yú)的健康狀態(tài)。

(6)統(tǒng)計(jì)免疫后死亡情況。每天記錄各組的死亡數(shù)，1個(gè)月后計(jì)算各組死亡率，按下列公式計(jì)算免疫相對(duì)保護(hù)率。

(7)內(nèi)臟解剖。出現(xiàn)死亡后，魚(yú)的肝、脾、腎和腸道等器官充血、糜爛，有腹水。兩個(gè)月后試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每批各隨機(jī)取20 尾試驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行剖檢，觀察注射部位有無(wú)炎性反應(yīng)或其他反應(yīng)，并觀察各臟器是否正常。

二、結(jié)果

1.養(yǎng)殖期間水質(zhì)與管理情況

試驗(yàn)期間(6－7月)水溫受到季節(jié)影響，7月晴天1.5 天，多云11.5 天，其余都是雨天，雨天比較多，7 月26－30 日氣溫達(dá)到37℃以上，水溫保持在26℃左右，增氧機(jī)開(kāi)得比較多，會(huì)影響草魚(yú)苗的成活率。中間培育過(guò)程中，由于考慮到高溫雨季，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)放苗密度不大，整個(gè)過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)大的問(wèn)題，試驗(yàn)期間4號(hào)池和6號(hào)池發(fā)生車輪蟲(chóng)病，對(duì)所有試驗(yàn)池使用硫酸銅殺蟲(chóng)后，沒(méi)有發(fā)生其他傳染病。

2.浸泡免疫對(duì)魚(yú)苗成活率的影響

本試驗(yàn)各種規(guī)格的草魚(yú)苗合計(jì)36 萬(wàn)尾，其中浸泡免疫18 萬(wàn)尾，在試驗(yàn)1 個(gè)月后，開(kāi)始陸續(xù)出苗，發(fā)送到粵北、贛南、湘南等地區(qū)，由于距離和時(shí)間關(guān)系，沒(méi)有一一追蹤。1個(gè)月的試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)情況如表2所示。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，免疫后成活率都有增長(zhǎng)，8 朝苗以上保護(hù)率可達(dá)30%以上，9朝苗的免疫保護(hù)率最高，可達(dá)50.20%。在本場(chǎng)內(nèi)草魚(yú)種生長(zhǎng)良好，體長(zhǎng)達(dá)10～12 厘米，成活率達(dá)到75%以上。

3.浸泡免疫對(duì)魚(yú)苗生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)免疫操作過(guò)程適逢雨季，天氣變化快，悶熱天氣氣壓低，因此免疫接種需要全過(guò)程不間斷增氧。在養(yǎng)殖期間魚(yú)苗生長(zhǎng)良好，免疫組和非免組餌料系數(shù)均在1.5 以上(圖1)，差異不顯著(P＞0.05)。從規(guī)格上看，免疫處理后對(duì)生長(zhǎng)的影響不大，由于7 號(hào)、8 號(hào)對(duì)照池的成活率不高，其養(yǎng)殖密度降低，養(yǎng)成的規(guī)格反而大于免疫組，可見(jiàn)密度才是影響其生長(zhǎng)的主要因素。

圖1 試驗(yàn)期間各養(yǎng)殖池餌料系數(shù)統(tǒng)計(jì)

4.魚(yú)類解剖結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)隨機(jī)取樣檢測(cè)表觀健康的魚(yú)苗，魚(yú)苗內(nèi)臟完好，無(wú)出血、腹水等炎性反應(yīng)；腸道內(nèi)有食物，可見(jiàn)其攝食正常；鰓基本正常(圖2)。各個(gè)池塘內(nèi)均有少量魚(yú)有黏液增多現(xiàn)象，可能由于雨季或其他原因引起的應(yīng)激反應(yīng)。

圖2 魚(yú)苗培育后的解剖情況(2號(hào)池、6號(hào)池)

表2 各組生產(chǎn)情況統(tǒng)計(jì)

三、討論

免疫系統(tǒng)發(fā)育是決定起始免疫時(shí)間的重要因素之一，20 世紀(jì)80 年代有學(xué)者開(kāi)展魚(yú)類免疫系統(tǒng)發(fā)育研究。免疫系統(tǒng)未發(fā)育完善進(jìn)行免疫易產(chǎn)生免疫耐受(吳淑勤等，2014)。免疫耐受是指對(duì)抗原特異應(yīng)答的T細(xì)胞和B細(xì)胞接受某種抗原刺激后表現(xiàn)出的特異性免疫低應(yīng)答或無(wú)應(yīng)答狀態(tài)，即機(jī)體對(duì)某種抗原無(wú)免疫應(yīng)答的狀態(tài)。一般研究參考陸生動(dòng)物指標(biāo)，以魚(yú)體孵化后的日齡作為免疫操作的指標(biāo)，如鯉魚(yú)受精后2 天可見(jiàn)免疫器官，3～8 個(gè)月免疫器官發(fā)育成熟，但4 周齡鯉魚(yú)免疫后產(chǎn)生抗原耐受(Becker K等，2001)。

也有研究認(rèn)為，魚(yú)體規(guī)格(體重或體長(zhǎng))大小是獲得免疫應(yīng)答能力的關(guān)鍵因素。Nuno等(2001)接種個(gè)體重大于1克的鮭魚(yú)和0.5克的鱸魚(yú)才能成功獲得特異性免疫，且體重與免疫應(yīng)答效果正相關(guān)，推測(cè)能產(chǎn)生免疫應(yīng)答的最小體重與免疫器官發(fā)育成熟日齡相一致。免疫器官發(fā)育成熟日齡和體重可作為起始免疫適宜時(shí)間和規(guī)格指標(biāo)參數(shù)。草魚(yú)、鯉的頭腎發(fā)育不同于恒溫動(dòng)物，不只受到日齡的影響，其他內(nèi)外環(huán)境因素對(duì)器官生理的影響也至關(guān)重要(雷學(xué)彬等，2012)，因而用全長(zhǎng)或體質(zhì)量等形態(tài)學(xué)指標(biāo)作為頭腎等免疫系統(tǒng)發(fā)育的參考十分必要。

珠三角地區(qū)草魚(yú)養(yǎng)殖通過(guò)多年的積累和實(shí)踐，形成了清晰的草魚(yú)朝苗養(yǎng)殖判定標(biāo)準(zhǔn)，并廣泛運(yùn)用于草魚(yú)苗的標(biāo)粗階段(把剛剛孵化并開(kāi)口的魚(yú)苗培育到體長(zhǎng)10厘米左右的魚(yú)種階段)，并對(duì)草魚(yú)朝苗不同規(guī)格的過(guò)篩形成行業(yè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化操作。苗種成活率是草魚(yú)苗種培育最為關(guān)注的課題，成活率的高低關(guān)系著養(yǎng)殖成本、養(yǎng)殖產(chǎn)量的高低、出售規(guī)格的大小、魚(yú)價(jià)行情的把握，是整個(gè)草魚(yú)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中最為重要的一環(huán)，以苗種成活率來(lái)評(píng)價(jià)所采取的措施是最基礎(chǔ)的評(píng)價(jià)方式之一。在本試驗(yàn)中，8朝苗以上保護(hù)率可達(dá)30%以上，9朝苗的免疫保護(hù)率最高，可達(dá)50.20%。因此該疫苗聯(lián)合使用浸泡免疫接種時(shí)，魚(yú)種的規(guī)格在9 朝左右為宜。