簡介

本實驗來源于：動物細胞培養(yǎng)——基本技術指南（第五版）

操作方法

一、成纖維細胞飼養(yǎng)層

原理

通過用鏈酶蛋白酶除去絨毛膜、用添加成分的FGF培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞和采用不同的胰蛋白酶消化篩選成纖維細胞，用原腸胚期斑馬龜?shù)呐咛コ衫w維細胞制備飼養(yǎng)層[Sun et al.,1995a]。

材料與儀器

鏈酶蛋白酶E用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA受精后8h的胚胎FBS LDF基礎培養(yǎng)液LDF原代培養(yǎng)液LDF維持培養(yǎng)液D培養(yǎng)液Holtfreter緩沖液 培養(yǎng)瓶

步驟

鱒魚胚胎提取物：
(a)收集胚胎（受精后28天的Shasta Rainbow或其他鱒魚種系，在10°C條件下飼養(yǎng)，或者受精后3天的斑馬魚，在28°C條件下飼養(yǎng)），在-80°C條件下凍存
(b)為了制備提取物，將約150 g胚胎融化后，采用Tissuemizer勻漿器（Tekmar)用10 ml LDF在冰上勻漿2 min
(c)將勻漿通過數(shù)層紗布過濾后去除絨毛膜，然后在4°C條件下離心（20000 g，30 min)
(d)離心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂層
(e)將上清液移入1只新離心管，按操作步驟（c)離心
(f)收集上清液，留下剩余的脂質，然后在4°C條件下超速離心（100000 g，60 min)
(g)超速離心后收集上清液，留下脂層。用LDF(1:10)稀釋上清液，然后過濾除菌
(h)提取物過一系列濾器（1.2μm、0.45μm和0.2μm)過濾
(i)將提取物按0.5 ml分裝后，在-80°C條件下凍存
(j)為了用提取物培養(yǎng)細胞，測量蛋白質濃度（見方案21.4)，然后用LDF將提取物稀釋至理想的工作濃度
(k)將稀釋的提取物在4°C條件下冷藏，最長2個月BRL細胞條件培養(yǎng)液：
(a)在37°C條件下和在75 cm2培養(yǎng)瓶中，用DMEM/F12/10FB培養(yǎng)液培養(yǎng)BRL細胞（ATCC)
(b)當細胞匯合時，用添加2%FBS的LDF置換FD培養(yǎng)液，在37°C條件下培養(yǎng)
(c)5天后吸出LDF，過濾，在-20°C凍存
(d)向細胞中加入新鮮的LDF，5天后重復此過程。條件化的LDF培養(yǎng)液可從同一個培養(yǎng)瓶中收集3次。然后，將細胞分開培養(yǎng)，使細胞再次匯合
1.收集約30個受精后8 h的胚胎。
2.通過鏈酶蛋白酶處理，除去絨毛膜[Sun et al.，1995a]。
3.用胰蛋白酶孵育胚胎1 min，同時用吸管輕輕吹打，以便使細胞分散。
4.加入FBS(終濃度為10%)，終止胰蛋白酶的消化。
5.離心（500 g，10 min)，收集細胞。
6.用5 ml含有PGF的LDF原代培養(yǎng)液混懸細胞，然后將細胞移入25 cm2培養(yǎng)瓶。
7.在26°C條件下，讓細胞貼壁和匯合。
8.當細胞匯合時，用同樣的培養(yǎng)液傳代。
9.培養(yǎng)2~3代后，上皮細胞和成纖維細胞將混合出現(xiàn)。這些細胞可用含有10%FBS的LDF基礎培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。通過不同的胰蛋白酶消化，為下一步培養(yǎng)篩選成纖維細胞。
(a)用胰蛋白酶處理細胞1 min以除去大部分成纖維細胞，保留貼在瓶壁上的上皮細胞。
(b)將成纖維細胞移入另1個培養(yǎng)瓶。當細胞匯合時，重復以上過程。
(c)培養(yǎng)2~3代后，細胞均為成纖維細胞。
10.制備生長抑制的成纖維細胞飼養(yǎng)層：
(a)將細胞加入合適的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，使成纖維細胞生長成為匯合的單層。
(b)將10μg/ml絲裂霉素C加入成纖維細胞中，在26°C條件下處理3 h。
(c)用LDF浸洗3次后，可將生長抑制的成纖維細胞用作斑馬魚胚細胞培養(yǎng)的伺養(yǎng)層。

二、原代培養(yǎng)（斑馬魚胚胎細胞的培養(yǎng)）

原理

收集胚胎，除去絨毛膜，用胰蛋白酶分散胚胎細胞，然后在胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)從斑馬魚囊胚和原腸期胚獲得的原代細胞。

材料與儀器

鏈酶蛋白酶E用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層人重組白血病抑制因子 漂白劑
LDF基礎培養(yǎng)液LDF原代培養(yǎng)液LDF維持培養(yǎng)液D培養(yǎng)液Holtfreter緩沖液稀

步驟

鱒魚胚胎提取物：
(a)收集胚胎（受精后28天的Shasta Rainbow或其他鱒魚種系，在10°C條件下飼養(yǎng)，或者受精后3天的斑馬魚，在28°C條件下飼養(yǎng)），在-80°C條件下凍存
(b)為了制備提取物，將約150 g胚胎融化后，采用Tissuemizer勻漿器（Tekmar)用10 ml LDF在冰上勻漿2 min
(c)將勻漿通過數(shù)層紗布過濾后去除絨毛膜，然后在4°C條件下離心（20000 g，30 min)
(d)離心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂層
(e)將上清液移入1只新離心管，按操作步驟（c)離心
(f)收集上清液，留下剩余的脂質，然后在4°C條件下超速離心（100000 g，60 min)
(g)超速離心后收集上清液，留下脂層。用LDF(1:10)稀釋上清液，然后過濾除菌
(h)提取物過一系列濾器（1.2μm、0.45μm和0.2μm)過濾
(i)將提取物按0.5 ml分裝后，在-80°C條件下凍存
(j)為了用提取物培養(yǎng)細胞，測量蛋白質濃度（見方案21.4)，然后用LDF將提取物稀釋至理想的工作濃度
(k)將稀釋的提取物在4°C條件下冷藏，最長2個月
BRL細胞條件培養(yǎng)液：
(a)在37°C條件下和在75 cm2培養(yǎng)瓶中，用DMEM/F12/10FB培養(yǎng)液培養(yǎng)BRL細胞（ATCC)
(b)當細胞匯合時，用添加2%FBS的LDF置換FD培養(yǎng)液，在37°C條件下培養(yǎng)
(c)5天后吸出LDF，過濾，在-20°C凍存
(d)向細胞中加入新鮮的LDF，5天后重復此過程。條件化的LDF培養(yǎng)液可從同一個培養(yǎng)瓶中收集3次。然后，將細胞分開培養(yǎng)，使細胞再次匯合
1.在中襄胚或早原腸胚期收集胚胎，用清潔水浸洗數(shù)次。
2.浸洗后將胚胎移入60 mm皮氏皿(50~100個/皿）。然后，將皮氏皿放入層流通風櫥中，在無菌條件下放置。
3.將胚胎放入稀漂白劑中浸泡2 min，然后用無菌的Holtfreter緩沖液浸洗數(shù)次。
4.用2 ml鏈酶蛋白酶E溶液孵育10 min，使胚胎去絨毛膜。然后，將胚胎在皮氏皿中輕輕攪動，使胚胎與部分消化的絨毛膜分離。
5.將培養(yǎng)皿傾斜，以便從一側收集胚胎，用巴斯德吸管輕輕吸出1.5 ml鏈酶蛋白酶溶液。為了防止去絨毛膜的胚胎黏附在皮氏皿上和破裂，保持皮氏皿傾斜，以便胚胎懸浮在剩余的鏈酶蛋白酶溶液中。
6.加入2 ml Holtfreter緩沖液，輕輕攪動，以便輕輕浸洗胚胎。
7.將皮氏皿傾斜，吸去大部分Holtfreter緩沖液，將胚胎懸浮在約0.5 ml緩沖液中。
8.重復浸洗步驟兩次以上。
9.在最后1次浸洗后，將胚胎懸浮在0.5 ml Holtfreter緩沖液中，然后加入2 ml胰蛋白酶溶液。
10.用胰蛋白酶將胚胎孵育1 min，然后通過用吸管輕輕吹打3~4次分離細胞。
11.將細胞懸液立即移入無菌的聚丙烯離心管中，然后加入200μl FBS，以終止胰蛋白酶的消化作用。
12.通過離心（500 g，5 min)收集細胞，然后用無FBS或鱒魚血清的LDF原代培養(yǎng)液混懸細胞。
13.將細胞以1×104個/cm2的細胞密度種植到含有生長抑制的成纖維細胞飼養(yǎng)層的多孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。
14.在加入FBS或鱒魚血清前讓細胞附著于飼養(yǎng)層（約15 min)。在培養(yǎng)液中使用10 ng/ml人重組LIF，此優(yōu)于BRL條件培養(yǎng)液[Sun et al.，1995a，1995b]。

三、細胞系

材料與儀器

鏈酶蛋白酶E用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA ZEM-2細胞（或等同物）LDF基礎培養(yǎng)液LDF原代培養(yǎng)液LDF維持培養(yǎng)液D培養(yǎng)液Holtfreter緩沖液

步驟

鱒魚胚胎提取物：
(a)收集胚胎（受精后28天的Shasta Rainbow或其他鱒魚種系，在10°C條件下飼養(yǎng)，或者受精后3天的斑馬魚，在28°C條件下飼養(yǎng)），在-80°C條件下凍存
(b)為了制備提取物，將約150 g胚胎融化后，采用Tissuemizer勻漿器（Tekmar)用10 ml LDF在冰上勻漿2 min
(c)將勻漿通過數(shù)層紗布過濾后去除絨毛膜，然后在4°C條件下離心（20000 g，30 min)
(d)離心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂層
(e)將上清液移入1只新離心管，按操作步驟（c)離心
(f)收集上清液，留下剩余的脂質，然后在4°C條件下超速離心（100000 g，60 min)
(g)超速離心后收集上清液，留下脂層。用LDF(1:10)稀釋上清液，然后過濾除菌
(h)提取物過一系列濾器（1.2μm、0.45μm和0.2μm)過濾
(i)將提取物按0.5 ml分裝后，在-80°C條件下凍存
(j)為了用提取物培養(yǎng)細胞，測量蛋白質濃度（見方案21.4)，然后用LDF將提取物稀釋至理想的工作濃度
(k)將稀釋的提取物在4°C條件下冷藏，最長2個月BRL細胞條件培養(yǎng)液：
(a)在37°C條件下和在75 cm2培養(yǎng)瓶中，用DMEM/F12/10FB培養(yǎng)液培養(yǎng)BRL細胞（ATCC)
(b)當細胞匯合時，用添加2%FBS的LDF置換FD培養(yǎng)液，在37°C條件下培養(yǎng)
(c)5天后吸出LDF，過濾，在-20°C凍存
(d)向細胞中加入新鮮的LDF，5天后重復此過程。條件化的LDF培養(yǎng)液可從同

一個培養(yǎng)瓶中收集3次。然后，將細胞分開培養(yǎng)，使細胞再次匯合
1.用LDF維持培養(yǎng)液培養(yǎng)從早期斑馬魚胚胎獲得的細胞如ZEM-2，至約70%匯合。
2.在26°C和環(huán)繞空氣的條件下培養(yǎng)細胞。
3.約每5天換培養(yǎng)液1次。
4.經胰蛋白酶消化，繼代培養(yǎng)。
已表明鱒魚血清和胚胎提取物剌激其他魚類胚細胞的生長[Cdlodi and Bames,1990]。