羅氏沼蝦頭部“白點病”的診斷

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)又名馬來西亞大蝦、淡水長臂大蝦，是許多亞洲國家和地區(qū)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟蝦類。在我國，羅氏沼蝦最初由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進試養(yǎng)[1]，因其具有生長速度快、抗病力強、口感好、個頭大、耐運輸、國內(nèi)外市場需求量大等優(yōu)點，現(xiàn)已在各地廣泛養(yǎng)殖。上海位處長江口，具備優(yōu)質(zhì)的咸淡水資源，適合多種蝦、蟹的繁殖和增養(yǎng)殖。上海市奉賢區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站于1987年便開展了羅氏沼蝦養(yǎng)殖試驗并取得成功[2]。隨后，金山區(qū)也開展了羅氏沼蝦蝦苗繁育技術(shù)研究，之后逐步發(fā)展壯大，現(xiàn)已是我國長三角地區(qū)羅氏沼蝦親蝦及蝦苗的重要供應(yīng)基地之一。

近年來，病毒性疾病對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的影響很大，已造成許多重大經(jīng)濟損失，對蝦類健康養(yǎng)殖的威脅程度也日趨嚴(yán)重?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種侵染羅氏沼蝦的病毒，如雙順反子病毒、諾達(dá)病毒、虹彩病毒、黃頭病毒、肝胰腺細(xì)小病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒等[3-5]。其中，虹彩病毒是一種胞漿型的雙鏈DNA病毒。目前國際病毒分類委員會將虹彩病毒科細(xì)分為6個屬：蛙病毒屬(Ranavirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)、腫大細(xì)胞虹彩病毒屬(Megalocytivirus)、綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)、虹彩病毒屬(Iridovirus)和十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)。十足目虹彩病毒是近年發(fā)現(xiàn)的一個新屬，感染羅氏沼蝦的虹彩病毒(DIV1)即為該屬成員。

羅氏沼蝦“白點病”最初發(fā)現(xiàn)于我國廣東珠三角養(yǎng)殖區(qū)，隨后在福建漳州養(yǎng)殖區(qū)也有零星出現(xiàn)，近兩年在江都、高郵、興化等江蘇的主養(yǎng)地呈暴發(fā)態(tài)勢，危害嚴(yán)重。近年來，在上海郊區(qū)養(yǎng)殖的羅氏沼蝦也出現(xiàn)了頭部“白點病”，造成大量沼蝦死亡。通過對上海地區(qū)患“白點病”羅氏沼蝦的組織病理及超微病理進行分析，并對其病原進行分子鑒定，確定該病為虹彩病毒(DIV1)導(dǎo)致。本研究首次在上海養(yǎng)殖區(qū)發(fā)現(xiàn)此病，應(yīng)當(dāng)引起養(yǎng)殖戶關(guān)注，加強防范，避免造成較大的經(jīng)濟損失。

1 材料和方法

1.1 樣品來源及前處理

羅氏沼蝦病蝦樣本采集于上海市奉賢區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖場。養(yǎng)殖池為大棚覆蓋的淡水池塘，水溫為17～20 ℃。切取病蝦的造血組織和健康蝦的造血組織，各分成3份：一部分放入預(yù)裝有戴維森氏AFA(Davidson’s AFA)固定液的樣品瓶中，常溫固定24 h；另一部分再細(xì)切成體積大小為1～2 mm3的組織塊后放入預(yù)裝有2.5%戊二醛固定液的離心管中，4 ℃固定24 h；剩余部分放入預(yù)裝有無水乙醇的離心管中，常溫保存。以上述3種方式處理的組織分別用于組織病理、超微病理和分子檢測。

1.2 普通組織病理檢查

按常規(guī)的石蠟組織切片程序處理用Davidson’s AFA液固定的組織塊。組織塊經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、脫蠟、復(fù)水后，使用蘇木精和伊紅(H&E)對切片進行染色，Leica DM4B 顯微鏡成像及分析。

1.3 超微組織病理檢查

將2.5%戊二醛固定液固定的小組織塊用0.1 M磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH=7.2)清洗，并在1% OsO4(鋨酸)中后固定2 h，再次漂洗組織，并經(jīng)梯度乙醇逐級脫水。脫水后，將樣品包埋在環(huán)氧樹脂812中，60 ℃聚合48 h。用徠卡超薄切片機切片，厚度為60～70 nm，銅網(wǎng)收片，乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。最后使用FEI Tecnai G2 Spirit透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞病理變化。

1.4 總DNA提取

將乙醇固定的樣品組織用超純水漂洗3次，去掉殘留乙醇后，按照天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒的說明進行操作。所有DNA樣品用TE緩沖液洗脫，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

1.5 病毒基因檢測

參考全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站推薦的PCR方法——《蝦虹彩病毒病診斷規(guī)程》(SC/T 7237—2020)。引物DIV1-F1(5’-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3’)和DIV1-R1(5’-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3’)用于擴增虹彩病毒(DIV1)的ATP酶基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR擴增25 μL體系：PremixTaq酶12.5 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，滅菌雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃初始變性3 min；然后95 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s和72 ℃ 延伸30 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外光源下觀察分析。取陽性PCR產(chǎn)物5 μL送測序，所得核酸序列經(jīng)修剪頭尾的不可靠堿基后，輸入美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索比對，確定病原序列是否與目標(biāo)病原一致。

2 結(jié)果

2.1 病蝦的臨床癥狀

在養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦突然停止進食，很少在水面游動。停飼后2～10 d，死亡率可達(dá)100%。尤其使用氯類制劑對發(fā)病塘進行水體消毒后會導(dǎo)致沼蝦死亡加劇。病蝦大多“偷死”在池塘的深水區(qū)，少數(shù)匍匐在池邊淺水處，活力明顯減弱，反應(yīng)遲緩，瀕死個體失去游動能力。病蝦體略微發(fā)紅，空腸、空胃，體表明顯癥狀是額劍基部的造血組織顏色變白(見圖1)，因此被養(yǎng)殖戶稱為“白頭病”或“白點病”。無論是單養(yǎng)羅氏沼蝦的池塘，還是與南美白對蝦或日本沼蝦混養(yǎng)的池塘，均有“白點病”發(fā)生。此病具有傳染性，呈現(xiàn)區(qū)域性發(fā)病的特點，通常1口塘發(fā)病后，周圍幾口養(yǎng)殖塘甚至區(qū)域內(nèi)其他養(yǎng)殖戶的養(yǎng)殖塘也會陸續(xù)發(fā)病。

圖1 自然發(fā)病羅氏沼蝦的頭部白點癥狀

2.2 組織病理

組織病理檢查顯示，病蝦造血組織出現(xiàn)了明顯的病理變化：組織液增多和大量細(xì)胞壞死(見圖2-a)，部分區(qū)域呈現(xiàn)局灶性壞死(見圖2-b)。壞死細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)異常的嗜堿性包涵體，其細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮現(xiàn)象(圖2-c～d)，細(xì)胞失去原有的結(jié)構(gòu)特征。

a.被感染的造血組織含有大量壞死細(xì)胞；b.造血組織的局灶性壞死；c.造血細(xì)胞的變性和壞死，白色箭頭示壞死細(xì)胞中的核固縮，黑色箭頭示嗜堿性包涵體；d.健康的造血組織，白色箭頭示正常的細(xì)胞核。圖2 患病羅氏沼蝦造血組織的病理變化

2.3 超微病理

超薄切片透射電鏡結(jié)果顯示，病蝦的造血組織中出現(xiàn)大量虹彩病毒，部分區(qū)域的病毒顆粒聚集，呈晶格狀排列，多數(shù)病毒顆粒呈分散狀分布在組織細(xì)胞中。造血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中及細(xì)胞外基質(zhì)中均可觀察到病毒粒子，在細(xì)胞核中未發(fā)現(xiàn)病毒粒子。成熟病毒粒子由正六邊形的衣殼和近似圓形的核心兩部分構(gòu)成，衣殼電子密度較低，核心的電子密度較高。病毒顆粒整體呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑為(153±8)nm，其核心直徑為(91±5)nm。未成熟的病毒粒子僅有衣殼而無核心結(jié)構(gòu)，呈空心狀(見圖3)。

a.大量虹彩病毒顆粒分布在造血組織中，N表示細(xì)胞核；b.*表示造血細(xì)胞內(nèi)的虹彩病毒復(fù)制和組裝區(qū)域；c.釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中虹彩病毒顆粒；d.成熟的虹彩病毒顆粒具有近似正六邊形的衣殼和電子致密的核心。圖3 患病羅氏沼蝦造血組織的超微病理變化

2.4 分子檢測

凝膠電泳結(jié)果顯示，病蝦樣品均擴增出與陽性對照大小一致的目標(biāo)片段(見圖4)，而健康沼蝦無目的條帶。BLAST檢索結(jié)果表明，所有陽性片段測序獲得的基因序列與虹彩病毒(Genbank No.KY681040)序列一致性均達(dá)99%以上，因此確定該病毒為十足目虹彩病毒DIV1。

注：M表示DNA maker，條帶自上而下大小依次為2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、200 bp。1～7為患病羅氏沼蝦，陰性對照為健康羅氏沼蝦，空白對照所用模板為水，陽性對照為黃海水產(chǎn)研究所提供的陽性核酸。圖4 患病羅氏沼蝦虹彩病毒的PCR檢測

3 討論

3.1 造血組織變白是現(xiàn)場診斷DIV1感染的重要依據(jù)

病原體突破宿主免疫防線，侵入特定組織或器官進行大量增殖，并嚴(yán)重破壞機體正常的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致靶組織、器官或機體表現(xiàn)出明顯的異常信號，這些臨床上肉眼可見的癥狀信號是病因診斷的重要依據(jù)。本研究通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DIV1具有虹彩病毒典型的二十面體結(jié)構(gòu)，其主要侵染羅氏沼蝦造血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核被感染的情況。DIV1在細(xì)胞質(zhì)中大量增殖，并形成了較為透明的病毒發(fā)生基質(zhì)，即H&E組織病理切片中被異常染色的包涵體結(jié)構(gòu)，這與Qiu等[6]觀察到的病理結(jié)果相似。此外，組織病理還發(fā)現(xiàn)，由于大量感染DIV1，因此病蝦造血組織中出現(xiàn)大量的組織液及局部壞死病灶，這很可能是造血組織在臨床癥狀上呈現(xiàn)不透明白色的原因。而且，據(jù)現(xiàn)有的蝦類疾病研究報道，此癥狀為DIV1感染羅氏沼蝦所特有，其他病原感染尚未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象[7-9]。因此，水產(chǎn)獸醫(yī)或養(yǎng)殖戶在塘口進行疾病診斷時，可利用這一特點進行初診。

3.2 虹彩病毒的流行及危害

DIV1易感宿主范圍廣泛，主要集中在十足目的蝦類，包括羅氏沼蝦、凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、脊尾白蝦、日本沼蝦、紅螯螯蝦和克氏原螯蝦等[6]。有研究證實，三疣梭子蟹、中華絨螯蟹、粗腿厚紋蟹也是DIV1的易感宿主[10-11]，但目前尚未有蟹類自然感染的報道。流行病學(xué)調(diào)查顯示，該病毒在我國主要蝦類養(yǎng)殖地區(qū)均有檢出，如廣東、福建、浙江、江蘇、安徽、上海、山東、河北、天津等，流行分布非常廣泛。因此給我國羅氏沼蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)的生物安保工作帶來了巨大挑戰(zhàn)。

甲殼動物對自身機體的免疫保護主要依靠血細(xì)胞來完成，血細(xì)胞隨血液循環(huán)系統(tǒng)分布于全身各處，警戒著體外多種類型病原的入侵，如細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等。血細(xì)胞會根據(jù)入侵病原類型和數(shù)量的不同，采取不同的免疫防御策略，如細(xì)胞吞噬、細(xì)胞結(jié)節(jié)、包囊等[12]。由于血細(xì)胞不能分裂，它們的更新補充須由血細(xì)胞的生產(chǎn)工廠——造血組織來實現(xiàn)。而DIV1首選靶組織是造血組織，當(dāng)造血組織被病毒攻擊后，機體免疫防御機能會被徹底破壞，易導(dǎo)致宿主快速死亡，因此DIV1的危害性非常大。

3.3 虹彩病毒的防控措施建議

羅氏沼蝦“白點病”暴發(fā)的原因及其病原傳播方式尚不清楚，能否垂直傳播尚無證據(jù)。但根據(jù)本單位近幾年的病原監(jiān)測數(shù)據(jù)，DIV1在苗期已有檢出，因此養(yǎng)殖戶在購買羅氏沼蝦蝦苗時，應(yīng)嚴(yán)格篩選不攜帶DIV1的苗種進行養(yǎng)殖生產(chǎn)。目前，為增加經(jīng)濟收益，混養(yǎng)模式已成為我國多數(shù)養(yǎng)殖地區(qū)的主流模式。在疾病防控工作中需特別注意，當(dāng)混養(yǎng)近緣性的甲殼動物，如南美白對蝦、羅氏沼蝦、青蝦和克氏原螯蝦等蝦類時，因這些品種均為DIV1的易感宿主，在引進苗種前同樣需加強對DIV1的檢測，以降低病原傳入的風(fēng)險。此外，羅氏沼蝦與南美白對蝦混養(yǎng)時，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)南美白對蝦早于羅氏沼蝦“偷死”。因此，當(dāng)南美白對蝦出現(xiàn)病癥時，應(yīng)及早檢測、確診，以便及時采取相應(yīng)的措施，減少損失。

水溫與虹彩病毒病的暴發(fā)存在一定的相關(guān)性。孫世玉等[13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水溫保持在30 ℃以上，即使對蝦攜帶有虹彩病毒也可正常生長，但轉(zhuǎn)入低溫環(huán)境則會引發(fā)疾病。本案例中，羅氏沼蝦“白點病”的發(fā)病季節(jié)是秋季，水溫17～20 ℃，處于高溫轉(zhuǎn)低溫的階段，與上述結(jié)論基本相符。因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)中需注意水溫的變化，尤其是攜帶病毒且尚未發(fā)病的池塘，可采取加溫保溫的措施，以防止水溫降低而導(dǎo)致疾病暴發(fā)。

羅氏沼蝦“白點病”發(fā)病速度快，傳染性高，死亡率高，發(fā)病后很難挽救，因此重點在于預(yù)防。對有發(fā)病史的池塘應(yīng)嚴(yán)格消毒清塘，防止二次感染。養(yǎng)殖過程中應(yīng)及時了解周圍其他養(yǎng)殖戶是否有發(fā)病情況，盡可能避免因引進外塘水源或其他交叉感染因素而導(dǎo)致疾病傳播。還可采取常用的預(yù)防病毒病措施——魚蝦生態(tài)混養(yǎng)，用兇猛性魚類減少或消滅弱蝦、病蝦。此外，采取加強池塘底部增氧、潑灑益生菌等措施，可以避免條件致病菌大量生長繁殖，調(diào)控水質(zhì)，減少發(fā)病概率。在降溫期可通過增加水深、加強大棚保溫、采取人工加溫等措施來降低環(huán)境突變的影響。一旦發(fā)現(xiàn)感染DIV1，應(yīng)及時做好發(fā)病池塘的管理，防止塘間傳播，養(yǎng)殖廢水不可任意排放，避免擴大傳播區(qū)域。發(fā)病期間不宜使用刺激性大的消毒劑或纖毛蟲類殺蟲劑進行消殺，減少養(yǎng)殖蝦的應(yīng)激死亡。