弧菌對養(yǎng)殖大菱鲆的危害及其防治方法研究新進(jìn)展

弧菌對養(yǎng)殖大菱鲆的危害及其防治方法研究新進(jìn)展

黃華 陳坤 于文松 高雁 王亮 王曉飛 王鶴

(煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東煙臺 264006)

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)又名多寶魚，原產(chǎn)于歐洲，于1992年引進(jìn)我國[1]。大菱鲆具有生長速度快、耐低溫、飼料轉(zhuǎn)化率高、肉質(zhì)鮮美可口等優(yōu)點，因而逐漸成為我國沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚類。到2005年，我國大菱鲆工廠化養(yǎng)殖規(guī)模已躍居全球首位，養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界大菱鲆養(yǎng)殖總量的87.5%，在進(jìn)出口貿(mào)易中發(fā)揮著重要作用[1-2]。經(jīng)歷了2006年的“多寶魚風(fēng)波”后，在政府調(diào)控和各界努力下，次年大菱鲆產(chǎn)業(yè)規(guī)模得到恢復(fù)，逐漸進(jìn)入平穩(wěn)發(fā)展階段。但是，隨著工廠化養(yǎng)殖的發(fā)展，由于養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的不斷增大、管理人員經(jīng)驗不足、苗種質(zhì)量低、地下海水水質(zhì)多樣等問題，大菱鲆養(yǎng)殖早期出現(xiàn)的病害依舊較多，每年都會因病害導(dǎo)致較大的經(jīng)濟損失。在已報道的大菱鲆寄生蟲病、細(xì)菌性疾病、病毒性疾病等各類疾病中，細(xì)菌性疾病發(fā)生的頻次最高，損失也較嚴(yán)重，其中尤以弧菌病發(fā)生頻次最高[3]。

大菱鲆弧菌病的病原弧菌屬(Vibrio)是一類革蘭氏陰性菌，普遍存在于河口、沿海海域的海水中以及海洋動物的體表和體內(nèi)，在養(yǎng)成期大菱鲆的腸道微生物中所占比例最大[2]?；【鷮俚拇蟛糠址N類是海洋環(huán)境或一些海洋動物中正常有益菌的組成部分，小部分能引發(fā)疾病。在我國近30年的大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中，對大菱鲆弧菌病的報道屢見不鮮。研究發(fā)現(xiàn)，能夠使大菱鲆致病的弧菌屬種類主要有鰻弧菌(Vibrioanguillarum)[4-7]、哈維氏弧菌(V.harveyi)[8-9]、大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)[10]、溶藻弧菌(V.alginolyticus)[11]、鯊魚弧菌(V.carchariae)[12]、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)[13]、燦爛弧菌(V.splendidus)[14]、海利斯頓氏弧菌(V.pelagius)[5,15]、美人魚弧菌(V.damsela)[16]等。

我國弧菌病發(fā)病地區(qū)涵蓋了山東[6]、河北[5]、遼寧[13]等沿海大菱鲆養(yǎng)殖地區(qū)?；蓟【〉拇罅怫遥渑R床表現(xiàn)各不相同，主要有體色變黑、鰓絲呈灰白色、腹部腫脹、鰭基部充血、口部充血發(fā)紅等。嚴(yán)重感染的病魚體表潰瘍、出血，解剖可見肝臟充血、脾腫大和腸道腫脹等癥狀[3]。

本文介紹幾種常見的弧菌病原對養(yǎng)殖大菱鲆的危害，并對近年來有關(guān)大菱鲆弧菌病新的檢測及防治方法進(jìn)行總結(jié)，以期為該病的進(jìn)一步研究提供參考。

1 常見弧菌病原對養(yǎng)殖大菱鲆的危害

1.1 鰻弧菌

鰻弧菌普遍存在于我國的大菱鲆養(yǎng)殖區(qū)，具有流傳面積廣、速度快等特點，能通過鰭、鰓、皮膚、腸道等多種途徑感染大菱鲆，引發(fā)腹水病、出血癥、爛鰭病等[4,17]。病魚通常會表現(xiàn)出食欲減退，體表變色、浮腫、潰瘍出血，腹部膨大有腹水，胸鰭、側(cè)鰭和尾鰭先發(fā)白后潰爛，鰭基部有紅斑，解剖可見內(nèi)臟充血、脾腫大等癥狀[17]?；紶€鰭病的大菱鲆，從鰭發(fā)白到死亡僅僅需要幾天時間。幼苗期及各個養(yǎng)成時期的大菱鲆都可能患爛鰭病[4]。

溶血素具有溶血性、細(xì)胞毒性和動物致死性等特性[18]。在鰻弧菌的毒力研究中發(fā)現(xiàn)，VAH1、VAH2、VAH3、VAH4、VAH5等胞外溶血素[19]及RTX系列蛋白是鰻弧菌的主要毒力因子，在侵染宿主的過程中起到穿孔作用[20]。鰻弧菌有10個O抗原型，其中O1型、O2型和個別O3型與水產(chǎn)動物弧菌病有關(guān)，最常報道造成大規(guī)模死亡的是O1型和O2型抗原型[21]。

1.2 哈維氏弧菌

哈維氏弧菌是海水養(yǎng)殖魚類的常見致病菌，通過鰓、口、體表等途徑感染養(yǎng)殖動物[22]。Iddya等[23]報道，哈維氏弧菌能在不同非生物基質(zhì)表面上形成生物被膜。該菌能引發(fā)養(yǎng)殖大菱鲆患潰瘍癥、腹水病等。人類誤食含有哈維氏弧菌的水或食物后易罹患腹瀉、敗血癥、中耳炎等疾病[24]。

感染哈維氏弧菌后患潰瘍癥的養(yǎng)殖大菱鲆會出現(xiàn)體表病灶部位出血、肌肉潰爛、眼球凸出等典型癥狀。臨床初期表現(xiàn)為病魚不攝食，緩慢浮游于養(yǎng)殖池的邊緣，鰓絲潰爛、黏鰓，體表的病灶部位稍有發(fā)白，部分病灶部位充血發(fā)紅。中后期病魚的頭部、鰓蓋邊緣、上下體側(cè)的鰭基部潰爛，形成潰瘍面或深洞。解剖可見鰓絲貧血，膽囊、腎臟腫大，肝臟充血，腸壁充血并呈透明狀，腸內(nèi)有淡黃色液體。養(yǎng)殖大菱鲆一般在發(fā)病1周左右死亡[8]。

1.3 大菱鲆弧菌

大菱鲆弧菌是大菱鲆腸道中的優(yōu)勢菌[25]，屬于條件致病菌[26]。當(dāng)大菱鲆受環(huán)境脅迫、患消化道疾病或被其他病原菌感染后，大菱鲆弧菌可轉(zhuǎn)為致病菌[27]，引發(fā)大菱鲆腹水癥[10]、腸炎病[27]等。感染大菱鲆弧菌后患腸炎的大菱鲆，解剖可見其腸壁明顯充血，呈紅色，腸道中有大量黏液和黃白色糞便。大菱鲆弧菌分高毒株和低毒株，菌株之間毒性差異較大[28]。對大菱鲆弧菌毒力因子的研究表明，該菌的胞外產(chǎn)物有堿性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶等多種活性蛋白酶[28]。大菱鲆弧菌的致病能力與胞外產(chǎn)物、黏附因子、脂多糖及某些外膜蛋白等有關(guān)。

1.4 溶藻弧菌

溶藻弧菌又名溶藻膠弧菌，屬革蘭氏陰性短桿菌，是我國近海海水養(yǎng)殖中常見的病原菌[29]，也是人獸共患的病原菌[30]。溶藻弧菌能引起大菱鲆苗種[31-33]和成魚[11]患腹水病，患病的大菱鲆腹部出血膨大，擠壓有液體流出，解剖可見淡黃色液體等。姜燕等[27]從患腸炎病的大菱鲆中分離出了溶藻弧菌。對弧菌毒力的研究表明，AcfA是弧菌重要毒力蛋白之一，能有效促進(jìn)致病菌與宿主的黏膜黏附。陳妍妍[34]通過對溶藻弧菌acfA基因缺失株的研究，證實溶藻弧菌的acfA參與調(diào)控該菌鞭毛組裝、能量代謝等相關(guān)基因的表達(dá)，對sodB、flgG和dctQ具有正調(diào)控作用。

1.5 創(chuàng)傷弧菌

創(chuàng)傷弧菌普遍存在于河口、海水等環(huán)境中，是人類和養(yǎng)殖水產(chǎn)動物重要的病原菌之一，可引發(fā)原發(fā)性敗血癥，是目前發(fā)現(xiàn)的弧菌中致死率最高的致病菌，被稱為“海洋中的無聲殺手”[35-36]。創(chuàng)傷弧菌可引起人類的胃腸道疾病，嚴(yán)重者可引發(fā)敗血癥，50%以上患者因臟器功能衰竭而死亡[36]。沿海的國家基本上都對該菌有研究。據(jù)報道，美國因食用海鮮死亡的病例中，95%以上是由創(chuàng)傷弧菌引起的[37]。我國的江浙、閩粵沿海及臺灣地區(qū)也有較多的感染情況發(fā)生[38-39]。創(chuàng)傷弧菌能引起大菱鲆患出血性敗血癥、腹水癥[13]。感染早期，病魚的出血現(xiàn)象不嚴(yán)重，不容易被發(fā)現(xiàn)，后期病魚體表出現(xiàn)彌漫性出血點，毛細(xì)血管擴張充盈，并伴有腹水，解剖可見腸壁有出血點[13]。

目前對該菌致病因子的研究已達(dá)到全基因組層面，已有關(guān)于pldA、vgrG、aroQ、glpA等11個與創(chuàng)傷弧菌致病性相關(guān)的毒力基因的報道[40]，如pldA基因編碼磷脂酶A1是創(chuàng)傷弧菌溶血和致死的主要因子，vgrG基因能編碼六型分泌系統(tǒng)(type VI secretion system，T6SS)蛋白，通過肌動蛋白交聯(lián)域(actin cross-linking domains)發(fā)揮作用，影響創(chuàng)傷弧菌毒力。其中張嘉鑫等[40]于2020年報道新發(fā)現(xiàn)了aroQ和glpA基因編碼代謝蛋白，gspE、tolQ、flgJ、flgH和fliF基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白，VVCECT4999-03045和tpbB基因編碼信息傳遞蛋白。

1.6 燦爛弧菌

燦爛弧菌能感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，如海參、貝類及魚類等。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，燦爛弧菌能感染大菱鲆幼魚，并導(dǎo)致幼魚的高死亡率。黑瘦癥是影響大菱鲆育苗成活率的重要因素之一。王印庚等[41]從患黑瘦癥的養(yǎng)殖大菱鲆幼苗中分離到了燦爛弧菌，病魚體色發(fā)黑，魚體瘦弱，頭大軀體小，呈蝌蚪狀畸形，發(fā)育遲緩，變態(tài)率低，基本不攝食。該病發(fā)病快，死亡率高。解剖后進(jìn)行組織病理分析，可見病魚內(nèi)臟組織器官萎縮、潰爛，肝組織萎縮變性，腦組織神經(jīng)元細(xì)胞核溶解[41]。研究發(fā)現(xiàn)，燦爛弧菌是1種具有強黏附力的致病菌[42]，VsA蛋白與燦爛弧菌的生長、抗氧化有關(guān)，VsA基因是1種黏附因子，在黏附宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮作用[43]。

2 病原鑒定方法

快速診斷是疾病防治的重要手段，檢測弧菌病有傳統(tǒng)微生物學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等方面的方法。解剖患病的魚，從組織分離純化優(yōu)勢菌進(jìn)行生理生化試驗，通過《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行鑒定是比較傳統(tǒng)的方法。在細(xì)菌鑒定中還常用16S rDNA序列分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法。近年來對于大菱鲆弧菌病原鑒定的檢測技術(shù)又有多項突破。

創(chuàng)傷弧菌也是人類疾病的病原菌。關(guān)于該菌的研究較多，目前用于檢驗該菌的技術(shù)除常規(guī)分離鑒定法外，還有脂肪酸氣相色譜分析法[44]、膠體金免疫層析法[45]、分子生物學(xué)法(如常規(guī)PCR[46]、多重PCR[47]、熒光定量PCR[48])和變性高效液相色譜技術(shù)[49]等。近幾年，一些學(xué)者研究出了新的檢測技術(shù)，為大菱鲆弧菌病的檢驗提供了更加高效快速的手段。如Yin等[50]建立了多重降落PCR方法，該方法對創(chuàng)傷弧菌的檢測靈敏度為104CFU/mL，對溶藻弧菌和副溶血弧菌的檢測靈敏度為103CFU/mL。凌莉等[51]基于gryB基因保守序列建立了重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RPA)檢測創(chuàng)傷弧菌，其反應(yīng)條件為：在37 ℃下恒溫反應(yīng)40 min即可，不需要特殊的儀器設(shè)備，靈敏度可達(dá)0.1 ng/μL，與PCR相當(dāng)。張晶等[52]針對創(chuàng)傷弧菌vvhA基因序列保守區(qū)域設(shè)計了交叉引物恒溫擴增技術(shù)，對創(chuàng)傷弧菌的檢測靈敏度達(dá)1.28×103CFU/mL，檢測時長為40～60 min。李偉等[53]以β-actin基因為內(nèi)標(biāo)基因、創(chuàng)傷弧菌gryB基因為目標(biāo)基因建立的重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RPA-IAC)，在37 ℃下恒溫40 min即可出結(jié)果，檢測靈敏度達(dá)0.1 ng/μL。

基于gyrB基因的SYBR Green I實時定量PCR可用于燦爛弧菌的檢測，最低可檢測到20個拷貝gyrB基因，而同等條件下普通PCR擴增反應(yīng)中最低可檢測出104個拷貝的燦爛弧菌gyrB基因[54]。另外，成翔宇等[55]通過對3個基因設(shè)計特異性引物建立的針對溶藻弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的多重PCR檢測方法，靈敏度為102～103CFU/mL。繩秀珍等[56]構(gòu)建了鰻弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌等6種魚類病原性弧菌的血清學(xué)診斷抗原芯片，為大菱鲆弧菌病的血清學(xué)診斷奠定了基礎(chǔ)。

養(yǎng)殖動物患弧菌病的水體弧菌臨界濃度為104個/mL[57]。因此，上述方法均可用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中病原弧菌的檢測。

3 養(yǎng)殖大菱鲆弧菌病的防治

3.1 預(yù)防方法

對于大菱鲆弧菌病的預(yù)防，除了提高養(yǎng)殖管理水平、加強營養(yǎng)控制、保持良好水質(zhì)等生態(tài)防御手段外，還可以采取免疫預(yù)防的方法，如有針對性地投放免疫增強劑來提高大菱鲆對病害的抵抗能力。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)能針對特異性抗原起到保護(hù)作用，可以充當(dāng)免疫促進(jìn)劑。張偉等[58]的研究表明，溶藻弧菌脂多糖對大菱鲆的相對免疫保護(hù)率(RPS)可達(dá)75%。

為提高大菱鲆對弧菌病的免疫力，一些學(xué)者進(jìn)行了大菱鲆?guī)追N常見弧菌病疫苗方面的研究，結(jié)果表明，采用弧菌疫苗來預(yù)防大菱鲆弧菌病具有很好的效果[59-67]。其中，曹宏梅等[61]用福爾馬林滅活鰻弧菌和溶藻弧菌制備了2種單疫苗及二聯(lián)疫苗，通過腹腔注射免疫大菱鲆后，二聯(lián)疫苗對鰻弧菌和溶藻弧菌的RPS分別為83.52%和83.24%，鰻弧菌單苗對鰻弧菌攻毒的RPS為80.37%，溶藻弧菌單苗對溶藻弧菌攻毒的RPS為74.89%。張振國等[62]通過“擠出—滾圓”法制備了魚用三聯(lián)疫苗，經(jīng)大菱鲆口服后，對溶藻弧菌和副溶血弧菌的RPS均超過50%。

丁山[63]制備的鰻弧菌三價滅活疫苗和鰻弧菌O1血清型滅活疫苗，經(jīng)腹腔注射大菱鲆后28 d，RPS達(dá)到100%。鰻弧菌O1、O2、O3血清型滅活疫苗的免疫保護(hù)期達(dá)150 d以上，RPS最高達(dá)100%[64-66]。

另外，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌TrxR蛋白具有較好的免疫原性，大菱鲆經(jīng)其免疫后，對哈維氏弧菌的RPS為75%，表明其可作為亞單位疫苗用于該菌的免疫預(yù)防[67]。

3.2 治療方法

研究發(fā)現(xiàn)，在大菱鲆弧菌病的治療方面，一些西藥、中藥及生物抑菌劑等對大菱鲆弧菌病原具有很好的抑制效果。藥敏試驗顯示，從山東省某地的大菱鲆中分離的弧菌對恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素最為敏感，由弧菌引起的腸炎病可采用硫酸新霉素對癥治療[68]，用氟苯尼考防治大菱鲆弧菌病也是可行的[69]。一些學(xué)者通過研究中草藥體外抗菌效果證實，蘇木、五倍子、地錦草、石榴皮等4種中草藥對鰻弧菌等4種病原弧菌的抑制和殺滅作用明顯，最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)為1.56～3.12 mg/mL，最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)為3.12～6.25 mg/mL[70]；白頭翁、五倍子、石榴皮等3種中草藥對鰻弧菌的MIC為3.125 mg/mL，MBC為6.25 mg/mL[71]；鰻弧菌對菌陳、黃岑、烏梅等中草藥高度敏感，五倍子對鰻弧菌的MIC為1.51 mg/mL，MBC為12.5 mg/mL[5]；五倍子和白頭翁對燦爛弧菌的MBC均為25 mg/mL，黃柏、穿心蓮對燦爛弧菌的MBC為50 mg/mL[41]。

有學(xué)者通過藥敏試驗證實，弧菌已對多種類抗生素產(chǎn)生了不同情況的耐藥性[69,72]?；【〉闹委熕幬锟筛鶕?jù)情況選用相關(guān)部門批準(zhǔn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥，但需要注意部分藥物的休藥期問題。除此之外，用于替代抗生素的天然無公害生物抑菌劑的研究一直在進(jìn)行，其中噬菌體療法在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，具有無污染、不殘留、不導(dǎo)致耐藥等優(yōu)點，可用于大菱鲆弧菌病的治療。目前溶藻弧菌噬菌體對大菱鲆弧菌病的治療能力得到了證實，應(yīng)用噬菌體制劑試驗組大菱鲆的生存率為70%[73]。植物精油具有抗菌活性，肉桂醛對大菱鲆弧菌的MIC為0.25 μL/mL，百里香酚為0.5 μL/mL，富含芳香醛、芳香酚和檸檬醛等成分的植物精油能夠很好地抑制大菱鲆弧菌[74]。

4 結(jié)語

養(yǎng)殖大菱鲆弧菌病的多種病原菌，如哈維氏弧菌[24]、創(chuàng)傷弧菌[37]、溶藻弧菌[30]等不但能感染水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，而且會對人類健康造成重大危害，是公眾飲食健康的重大威脅之一。我國海產(chǎn)品種類豐富多樣，每年都有因食用海產(chǎn)品而引起的急性胃腸炎、腹瀉、食物中毒等疾病的報道，因此研究水產(chǎn)動物弧菌病的檢測技術(shù)及防治方法具有重要意義。

傳統(tǒng)檢測方法結(jié)果準(zhǔn)確，但是存在耗時長、操作繁瑣且檢測目標(biāo)單一、效率低、靈敏度低等問題。另外，有些菌由于檢測基因相似度高，采用16S rDNA序列分析法無法將其鑒定到種。目前大部分可以在遺傳基因水平上檢測弧菌的技術(shù)要求高、價格昂貴，很難在基層推廣應(yīng)用。因此，對適用于基層檢測、設(shè)備要求不高、操作技術(shù)簡單、檢測時間短、檢測靈敏度高的新型檢測技術(shù)的研究十分必要。

長期使用抗生素治療會使病原菌產(chǎn)生耐藥性，并帶來水產(chǎn)品藥物殘留等問題。2019年，國務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門公告水生食品動物禁止使用的藥品及其他化合物，將79種藥物劃為禁用藥物，其中包括頭孢曲松、頭孢哌酮、洛美沙星、氧氟沙星等幾十種抗生素，這為今后水生動物病害防治帶來了新挑戰(zhàn)。因此，在大菱鲆弧菌病的防治中，從源頭上防病顯得尤為重要。養(yǎng)殖者可采用投喂免疫增強劑的方法來增強魚類的免疫力，通過接種上市疫苗進(jìn)行防病。但目前針對弧菌病疫苗制劑免疫效果的評價大多來自實驗室，進(jìn)入中試階段的較少，如何獲得生產(chǎn)批文并投入生產(chǎn)是關(guān)鍵。因此，養(yǎng)殖大菱鲆患病后，要及時準(zhǔn)確地診斷病原，并選用已經(jīng)批準(zhǔn)使用的水產(chǎn)用獸藥進(jìn)行對癥治療。