塑料袋混合營養(yǎng)培養(yǎng)小球藻技術：不需要充氣、不需要額外提供光照和加溫

小球藻是第一個被人工培養(yǎng)的微藻，它可作為人類的食品及食品添加劑，也可作為水產動物人工育苗階段的餌料和飼料添加劑，還可作為培養(yǎng)輪蟲的餌料以及用于提取EPA、DHA、類胡蘿卜素、蝦青素等。此外，小球藻可用于調節(jié)水質。

小球藻大規(guī)模培養(yǎng)研究可以分為兩個階段：1950－1979年主要進行開放水池培養(yǎng)的研究，1980年開始進行密閉和半密閉反應器培養(yǎng)的研究。傳統(tǒng)的產業(yè)化微藻培養(yǎng)多利用開放的水池，微藻以光合自養(yǎng)的模式生長。而采用透明容器或玻璃管道設計的半密閉和密閉光照生物反應器培養(yǎng)系統(tǒng)進行培養(yǎng)，藻類細胞的密度提高了6～12倍，總體積相對減少，分離成本大大降低；各種生長因子及工藝可以采用自動化、集約化管理，提高了生產效率和產品質量，可以避免受到其他生物和非生物的污染，但存在光反應器一次性投資大、許多技術尚未完全解決的問題。近年來，小球藻的高密度異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)技術也取得了巨大的進步，大幅度提高了小球藻的生長速度，使小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的工業(yè)化生產成為可能，然而其存在異養(yǎng)代謝過程同自養(yǎng)代謝或混養(yǎng)代謝有很大差異、對設備要求高、投資大等不足之處，普通水產養(yǎng)殖企業(yè)不愿意高投資進行小球藻生產，而且設備的操作流程比較復雜和難以掌握。

針對現有技術中存在的問題，本技術利用小球藻可以進行混合營養(yǎng)培養(yǎng)的特點，結合傳統(tǒng)的塑料袋培養(yǎng)方法，進行簡化和優(yōu)化，通過提供混合營養(yǎng)生長所需的營養(yǎng)物質和條件，改變小球藻傳統(tǒng)培養(yǎng)中僅進行光合自養(yǎng)或異養(yǎng)的代謝方式，形成了利用塑料袋進行小球藻混合營養(yǎng)培養(yǎng)技術。采用該技術培養(yǎng)小球藻，可有效提高藻類的培養(yǎng)效率，減少對設備的依賴和能源的消耗，從而縮減小球藻培養(yǎng)的成本，便于推廣應用。

一、材料與方法

1. 培養(yǎng)容器的選擇及前處理

選用容積為20～100升的透明塑料袋作為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)容器在使用前用漂白粉溶液浸泡24小時后曝曬12小時備用；塑料袋可采用藻類培養(yǎng)專用塑料袋，也可采用蝦苗或魚苗運輸用袋。

2.培養(yǎng)液的配制

培養(yǎng)液由基礎培養(yǎng)基、葡萄糖、水組成。基礎培養(yǎng)基可選用BG11培養(yǎng)基、f/2培養(yǎng)基或復合肥培養(yǎng)基(西南漁業(yè)網備注：培養(yǎng)基可以網上購買)，其中BG11和f/2為常用的藻類培養(yǎng)基，復合肥為俄羅斯阿康復合肥(N∶P∶K＝16∶16∶16)。葡萄糖的添加量為每升培養(yǎng)液中用0.5～1克，這樣可為小球藻提供異養(yǎng)生長的條件，使小球藻在自然條件下有無光照均能生長，同時也可彌補單純使用無機營養(yǎng)鹽培養(yǎng)小球藻導致的營養(yǎng)不均衡缺陷。

3. 培養(yǎng)種類及接種

培養(yǎng)種類為普通小球藻。接種進培養(yǎng)容器中的藻類為正處于指數生長期的小球藻，將處理后的培養(yǎng)容器裝培養(yǎng)液至容積的50%，培養(yǎng)容器內裝入培養(yǎng)液后于9:00－11:00進行小球藻接種。接種的小球藻藻液的溫度與培養(yǎng)液的溫度基本保持一致，接種量為培養(yǎng)總量的10%左右，接種完成后培養(yǎng)容器密封于10℃以上的溫度條件下進行混合營養(yǎng)培養(yǎng)。密封時，藻類培養(yǎng)專用塑料袋用封口蓋密封，蝦苗、魚苗尼龍袋用橡皮圈打結封口。光照采用自然光照，在氣溫較低時最好將培養(yǎng)容器放置在玻璃陽光房或塑料大棚內進行培養(yǎng)。

4.日常管理

接種完成后，將培養(yǎng)容器整齊擺放在有白色瓷磚的地面上，每天搖動培養(yǎng)容器至少4次，觀察培養(yǎng)容器內藻類的生長情況，并用紫外分光光度計測量藻液的光密度(OD)值。通常在接種的第2天開始，塑料袋內溶液色澤稍微變濃且有小氣泡產生，表明小球藻生長正常；接種后兩天若袋內顏色沒有變化或無氣泡產生，且顏色灰黃，表明接種失敗，應及時放棄、清理。當培養(yǎng)容器內的藻液變得濃綠時即可接種到其他藻類培養(yǎng)容器內，接種方法與上述方法相同。在留夠足量藻種的情況下，可將培養(yǎng)的藻類用于輪蟲、枝角類和魚苗或蝦苗的培育。使用過的培養(yǎng)容器及塑料袋在保證沒有破損的前提下，經漂白粉溶液消毒后方可用于下一次的培養(yǎng)。

二、結果

1. 20升的平面藻類培養(yǎng)袋培養(yǎng)

在容積為20升的平面藻類培養(yǎng)袋中使用BG11作為藻類基礎培養(yǎng)基，添加葡萄糖量為1克/升，進行小球藻培養(yǎng)，接種量為10%，培養(yǎng)體積為10升，接種后的初始OD值為0.091，培養(yǎng)4天后藻類OD值為1.201，細胞密度為 1835.24萬個/毫升，細胞干重為0.25毫克/毫升。使用f/2作為藻類基礎培養(yǎng)基，添加葡萄糖1克/升，進行小球藻培養(yǎng)，接種量為10%，培養(yǎng)體積為10 升，接種后的初始OD值為0.091，培養(yǎng)4天后藻類OD值為0.974，細胞干重為0.20毫克/毫升，細胞密度為1481.02萬個/毫升。使用復合肥培養(yǎng)基作為藻類基礎培養(yǎng)基，復合肥添加量為1克/升，再添加葡萄糖1克/升，進行小球藻培養(yǎng)，接種量為10%，培養(yǎng)體積為10升，接種后的初始OD值為0.091，培養(yǎng)4天后藻類OD值為0.641，細胞密度為963.32萬個/毫升，細胞干重為0.14 毫克/毫升。

2. 40升的魚苗尼龍袋培養(yǎng)

在容積為40升的魚苗尼龍袋中使用復合肥培養(yǎng)基作為藻類基礎培養(yǎng)基，復合肥添加量為1克/升，再添加葡萄糖1克/升，進行小球藻培養(yǎng)，接種量為10%，培養(yǎng)體積為10升，接種后的初始OD值為0.092，培養(yǎng)5天藻類OD值為0.601，細胞密度為901.04萬個/毫升，細胞干重為0.13毫克/毫升。

三、討論

從具體培養(yǎng)的結果看，利用塑料袋進行小球藻混養(yǎng)營養(yǎng)培養(yǎng)是可行的，而采用不同的基礎培養(yǎng)基以及采用不同的培養(yǎng)容器效果會有所區(qū)別。采用該技術培養(yǎng)小球藻，可有效提高小球藻的培養(yǎng)效率，以水池培養(yǎng)為對比，在水溫20～29℃，培養(yǎng)至第4天，小球藻密度為856萬個/毫升，而本方法培養(yǎng)至第4天最高(BG11作為基礎培養(yǎng)基)可達1835.24萬個/毫升，最少(復合肥作為基礎培養(yǎng)基在尼龍袋中培養(yǎng))也可達到901.04萬個/毫升。同時，因為培養(yǎng)過程中不需要充氣、不需要額外提供光照和加溫等，可減少對設備的依賴和能源的消耗，從而縮減了小球藻培養(yǎng)的成本，使得操作比較簡單，更便于進行推廣應用。

(來源：科學養(yǎng)魚2020年9期。作者：李飛，劉士力，程順等)

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