論文：加州鱸病原菌耐藥性試驗(yàn)和用藥建議

      加州鱸病原菌耐藥性試驗(yàn)和用藥建議

朱士文，徐玉龍，潘秀蓮，陳笑冰，孫作登

（1.山東省淡水漁業(yè)研究院，山東 濟(jì)南 250013；2.聊城市茌平區(qū)水產(chǎn)漁業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，山東 聊城 252100；3.山東省漁業(yè)發(fā)展和資源養(yǎng)護(hù)總站，山東 濟(jì)南 250013）

抗生素作為防治水生動(dòng)物細(xì)菌病的首選藥物，在加州鱸細(xì)菌性疾病的防治中廣泛應(yīng)用。但隨著抗生素的長(zhǎng)期大量使用，其缺點(diǎn)也逐漸暴露出來(lái)，如易產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題，甚至出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致藥物治療失敗，造成經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也危害人類食品安全。準(zhǔn)確把握病原菌耐藥性，可以提高施藥針對(duì)性和精準(zhǔn)度，有效減少抗生素類藥物濫用亂用現(xiàn)象，切實(shí)推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥減量增效，促進(jìn)漁業(yè)健康綠色發(fā)展。

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部“動(dòng)物疫情監(jiān)控與防治（漁業(yè)）——病原菌耐藥性普查”工作安排，在山東省聊城市加州鱸主產(chǎn)區(qū)2個(gè)重點(diǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)采集樣品，分離病原菌，測(cè)定菌株耐藥性，在此基礎(chǔ)上提出了精準(zhǔn)施藥建議，為促進(jìn)加州鱸養(yǎng)殖業(yè)綠色健康持續(xù)發(fā)展提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離鑒定

加州鱸采樣點(diǎn)設(shè)2處，采樣點(diǎn)1為山東泰豐鴻基農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司，采樣點(diǎn)2為茌平潤(rùn)生養(yǎng)殖專業(yè)合作社。2021年5—10月，從加州鱸采樣點(diǎn)盡量采集具有典型癥狀的病魚(yú)試驗(yàn)樣品，無(wú)病癥時(shí)采集健康魚(yú)例行檢驗(yàn)，每月每個(gè)采樣點(diǎn)各采集樣品4尾，累計(jì)采樣6次，共計(jì)48尾。用75%乙醇棉球擦拭魚(yú)體后，用滅菌剪刀于肛門前端剪入，分離內(nèi)臟器官，選取腹水以及心、肝、腎、脾等組織或器官，用滅菌雙蒸水清洗表面后，劃線接種于NA培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)溫度為28～35℃。24～28 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑取優(yōu)勢(shì)單菌落劃線提純培養(yǎng)。純化后的菌落，一份用于藥敏試驗(yàn)，一份寄至上海海洋大學(xué)測(cè)序鑒定，同時(shí)甘油保種備用。

1.2 供試藥物

1.3 供試菌株最小抑菌濃度的測(cè)定

挑取純化后的單菌落,制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙?；在陰性和?yáng)性對(duì)照孔中，分別加入無(wú)菌生理鹽水和0.005麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌懸液各200μL；96孔藥敏微孔板中加入0.005麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊牟≡鷳乙?00μL；持平微孔板，輕微搖晃使之均勻，于（28±1）℃培養(yǎng)，24～28 h后觀察并記錄菌株生長(zhǎng)情況，以抑制菌株生長(zhǎng)的最高稀釋度作為該菌株測(cè)試藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）發(fā)布的藥物敏感性及耐藥性標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)菌株耐藥性進(jìn)行判別，判別標(biāo)準(zhǔn)如下。

（1）恩諾沙星：敏感，ρ（MIC）≤0.5 mg/L；耐藥，ρ（MIC）≥4 mg/L。

（2）鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹：敏感，ρ（MIC）≤4 mg/L；中敏，ρ（MIC）=8 mg/L；耐藥，ρ（MIC）≥16 mg/L。

（3）氟苯尼考、甲砜霉素、硫酸新霉素：敏感，ρ（MIC）≤2 mg/L；中敏，ρ（MIC）=4 mg/L；耐藥，ρ（MIC）≥8 mg/L。

（5）磺胺間甲氧嘧啶鈉：敏感，ρ（MIC）≤256 mg/L；耐藥，ρ（MIC）≥512 mg/L。

應(yīng)用SPSS軟件，統(tǒng)計(jì)各供試菌株試驗(yàn)結(jié)果。本試驗(yàn)MIC為抑制90%受試菌株生長(zhǎng)所需的最小抑菌濃度，菌株耐藥率計(jì)算公式如下：

式中：S為菌株耐藥率，%；N為耐藥菌株數(shù)量，個(gè)；N為菌株總數(shù)，個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖場(chǎng)病害、藥物使用及損失情況

5—10月，采樣單位發(fā)病率低于1%。發(fā)病加州鱸體表多為點(diǎn)狀出血、潰瘍、腸炎等，解剖后，鱸花肝、腸道空。發(fā)現(xiàn)患病個(gè)體立即撈出隔離，死亡個(gè)體采用無(wú)害化處理方法，定期施用微生態(tài)制劑作為預(yù)防性用藥。全年未發(fā)生因病致?lián)p的情況。

2.2 病原菌分離鑒定結(jié)果

累計(jì)采集48尾加州鱸，共分離純化出病原菌13株（表1），其中維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）4株（30.77%）；弧菌（Vibrio）3株，包括創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）2株（15.38%）和納瓦拉弧菌（Vibrio navarrensis）1株（7.69%）；希瓦氏菌（Shewanella）2株（15.38%）；金色微菌（Chryseomicrobium）1株（7.69%）；檸檬酸桿菌（Citrobacter）1株（7.69%）；沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）1株（7.69%）；深海微小桿菌（Exiguobacterium profundum）1株（7.69%）。

表1 加州鱸采樣及病原菌情況

2.3 菌株對(duì)抗菌藥物的感受性

表2 病原菌對(duì)各抗菌藥物的感受性分布（n=13）

表3 維氏氣單胞菌對(duì)各抗菌藥物的感受性分布（n=4）

2.4 菌株耐藥率

根據(jù)各菌株對(duì)藥物的耐受性結(jié)果，以CLSI相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為判定依據(jù)，對(duì)分離菌株的耐藥性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表4 弧菌屬菌株對(duì)各抗菌藥物的感受性分布（n=3）

圖1 菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥性

3 用藥建議

由試驗(yàn)結(jié)果可知，加州鱸所有致病菌株對(duì)硫酸新霉素均為敏感或中敏，該水產(chǎn)用抗菌藥可以作為周邊地區(qū)常見(jiàn)和新發(fā)細(xì)菌性疾病的首選備用藥物。但硫酸新霉素藥餌進(jìn)入腸道后不被吸收，多用于腸道疾病治療。養(yǎng)殖中，可用恩諾沙星或鹽酸多西環(huán)素治療由氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥等疾病，用恩諾沙星或氟苯尼考治療由弧菌引起的體表潰瘍性疾病。此外，建議日常定期使用三黃散、維生素C等保肝護(hù)肝藥物拌料投喂加州鱸，以預(yù)防養(yǎng)殖疾??；定期施用微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)水質(zhì)，如發(fā)生病害可根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果用藥。

上述數(shù)據(jù)局限于山東地區(qū)的2個(gè)采樣點(diǎn)，盡管分離到的菌株有一定的耐藥率，但不能代表山東地區(qū)的整體情況，應(yīng)廣泛采集養(yǎng)殖區(qū)域樣本以進(jìn)行深入研究。