大口黑鱸的卵巢發(fā)育周年變化及反季節(jié)繁殖研究

大口黑鱸的卵巢發(fā)育周年變化及反季節(jié)繁殖研究

崔慶奎 沈志剛 田 宇 齊飄飄 黃紅紅 劉 洋 陳 敏 于 躍 樊啟學(xué)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,教育部長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展工程研究中心,池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070)

大口黑鱸(Micropterus salmoides),俗稱加州鱸,又稱黑鱸,隸屬鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Percoidei)、太陽(yáng)魚科(Centrarchidae)、黑鱸屬(Micropterus),原產(chǎn)于北美洲,是當(dāng)?shù)刂匾挠吾烎~類[1—3]。自1980年引入廣東后,因其肉質(zhì)鮮美,無肌尖刺,生長(zhǎng)迅速,養(yǎng)殖周期短等優(yōu)勢(shì),迅速成為國(guó)內(nèi)重要的養(yǎng)殖品種[4,5]。近些年對(duì)大口黑鱸營(yíng)養(yǎng)需求的研究不斷深入,一系列配合飼料應(yīng)運(yùn)而生,打破了傳統(tǒng)投喂餌料魚的養(yǎng)殖模式,養(yǎng)殖產(chǎn)量急速上升,從2012年的9.6×107kg增長(zhǎng)至2018年的43.2×107kg,7年時(shí)間增長(zhǎng)了3.5倍。有學(xué)者便推斷大口黑鱸憑借其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),未來20年內(nèi),產(chǎn)量有望突破100×107kg,養(yǎng)殖前景十分廣闊[5]。然而華中地區(qū)大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展并非一帆風(fēng)順,現(xiàn)階段主要存在三個(gè)問題:一是周年價(jià)格波動(dòng)較大,2019年本地區(qū)大口黑鱸塘口價(jià)(收購(gòu)價(jià))最高出現(xiàn)在8月底,高達(dá)24.0元/斤,最低出現(xiàn)在1月底,僅有10.5元/斤(圖1),此價(jià)格變化規(guī)律與此前2015—2018年價(jià)格規(guī)律非常一致[6];二是地區(qū)發(fā)展極不平衡,2018年廣東省大口黑鱸產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的59.8%,蘇浙地區(qū)占21.0%,而華中地區(qū)作為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖最重要的區(qū)域,產(chǎn)量?jī)H占2.8%[6—8](2019中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒)。三是本地區(qū)氣候條件不利于正常季節(jié)大口黑鱸的養(yǎng)殖,對(duì)于1齡苗種而言,下塘后不久便經(jīng)歷高溫期(6—9月),停止攝食,不利于其快速生長(zhǎng),使得越冬前大部分魚達(dá)不到上市規(guī)格,且積溫過高,加速其性腺發(fā)育成熟[9—11],而越冬期水溫又較低,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),回暖較慢,回暖后性腺快速發(fā)育又消耗大量能量,生長(zhǎng)緩慢[12]。

圖1 華中地區(qū)大口黑鱸價(jià)格周年變化Fig.1 Annual price fluctuation of largemouth bass prices in central China

解決以上問題,目前最有效的方法是培育反季節(jié)大口黑鱸苗種,即讓親本一年繁殖兩次,除了4和5月份自然繁殖外,通過一系列技術(shù)措施,使其在9和10月份二次產(chǎn)卵,從而培育大規(guī)格越冬苗種,將上市時(shí)間大大提前,填補(bǔ)市場(chǎng)上7—9月的缺魚期,同時(shí),反季節(jié)苗種也將有助于解決因苗種短缺導(dǎo)致的地區(qū)發(fā)展不平衡的問題,最重要的是反季節(jié)苗種能充分利用華中地區(qū)氣候條件,出苗后便迎來第一個(gè)最適生長(zhǎng)期(秋季),越冬回暖后迎來第二個(gè)快速生長(zhǎng)期(春季),這種養(yǎng)殖模式能提高其生長(zhǎng)速度和飼料利用效率[13,14]。

大口黑鱸的反季節(jié)繁殖,關(guān)鍵在于如何讓性腺退化后的親本再次啟動(dòng)發(fā)育。在自然條件下,大口黑鱸一年只有一個(gè)繁殖期[15],陳建酬等[16]曾報(bào)道,大口黑鱸產(chǎn)卵季節(jié)在3月中旬到4月中旬,Beamish等[17]認(rèn)為,大口黑鱸產(chǎn)卵季節(jié)為7—9月,而Gross等[15]認(rèn)為其產(chǎn)卵季節(jié)為1月中旬至5月底,可見,大口黑鱸的適應(yīng)能力極強(qiáng),不同地區(qū)差異很大。我們?yōu)殚_展大口黑鱸反季節(jié)繁殖,有必要研究清楚本地區(qū)其性腺發(fā)育規(guī)律和環(huán)境因子對(duì)其性腺的影響規(guī)律等,進(jìn)而確定科學(xué)、高效的技術(shù)措施。團(tuán)隊(duì)前期利用水庫(kù)底層低溫水進(jìn)行了規(guī)?；拇罂诤邝|反季節(jié)繁殖實(shí)驗(yàn),通過程序性降溫-低溫維持-升溫措施,成功在9和10月繁育出大口黑鱸苗種[6]。為了深入了解反季節(jié)繁殖過程中性腺發(fā)育規(guī)律、控制成本和尋求最優(yōu)程序性溫度控制等,特開展此研究。

在本研究中,我們就大口黑鱸性腺周年發(fā)育規(guī)律做了詳盡的研究,并結(jié)合環(huán)境因子進(jìn)行分析,初步得出溫度和光照對(duì)其性腺啟動(dòng)發(fā)育和產(chǎn)卵繁殖的影響規(guī)律,并基于這些規(guī)律,探究了大口黑鱸反季節(jié)繁殖的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚來自湖北黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司,來源是2017年從廣東大口黑鱸繁育基地購(gòu)買的新品種“優(yōu)鱸1號(hào)”,實(shí)驗(yàn)期間養(yǎng)殖在面積4000 m2、水深2 m的池塘中,養(yǎng)殖數(shù)量為3000尾左右。反季節(jié)繁殖實(shí)驗(yàn)開始前從池塘隨機(jī)挑選體質(zhì)量在400—800 g的親魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 參數(shù)測(cè)量

實(shí)驗(yàn)魚捕回后置于100 mg/kg的MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽)水桶中麻醉,每次采3尾魚,主要測(cè)定項(xiàng)目包括體長(zhǎng)(BL)、體質(zhì)量(BW)、性腺重(GW)、肝臟重(LW)和腸系膜脂肪重(MFW),并分別以性腺重量、肝重量和腸系膜脂肪重量相對(duì)于體質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)來表示性腺指數(shù)(GSI)、肝體比(HSI)和腸系膜脂肪系數(shù)(MFI)。

絕對(duì)繁殖力(F)是在繁殖產(chǎn)卵前隨機(jī)選取10尾雌魚進(jìn)行測(cè)定,每尾取0.1—0.5 g卵巢,固定后置于解剖鏡下計(jì)數(shù),推算出卵巢總懷卵量,并以絕對(duì)繁殖力比上體質(zhì)量和體長(zhǎng)表示相對(duì)體重繁殖力(FW)和相對(duì)體長(zhǎng)繁殖力(FL)。

池塘水溫采用連續(xù)溫度記錄儀(分辨率0.1℃)記錄,探頭深度為水面下60 cm,每天記錄6次,取平均值表示當(dāng)天水溫。光照時(shí)長(zhǎng)以世界時(shí)間網(wǎng)(https://time.guowaitianqi.com/)公布的武漢地區(qū)日出、日落時(shí)間為準(zhǔn),計(jì)算每天光照時(shí)長(zhǎng)。

1.3 組織學(xué)觀察

在親魚解剖后,將性腺樣品置于Bouin’s固定液中固定48h后轉(zhuǎn)移至70%的乙醇中保存,經(jīng)過酒精梯度脫水后,用二甲苯透明,石蠟包埋,連續(xù)切片厚度為6—8 μm,切片采用蘇木精-伊紅染色(HE染色),用Axio Imager A2顯微鏡拍照觀察。參照Gross等[15]對(duì)大口黑鱸卵巢發(fā)育特征的描述進(jìn)行時(shí)期劃分,統(tǒng)計(jì)卵巢中不同時(shí)相卵母細(xì)胞數(shù)量比時(shí),各采樣時(shí)間隨機(jī)選取10張玻片,每張玻片隨機(jī)挑選一個(gè)視野統(tǒng)計(jì)該視野下各時(shí)相卵母細(xì)胞數(shù)量比,最后以平均值表示各時(shí)相卵母細(xì)胞數(shù)量比。

1.4 卵巢發(fā)育周年樣品的采集

卵巢發(fā)育周年樣品的采集從2019年1月23日開始到2020年1月22日結(jié)束,根據(jù)不同時(shí)間卵巢的發(fā)育快慢,分為繁殖前期、繁殖期、退化階段、啟動(dòng)發(fā)育階段和越冬期共五個(gè)階段進(jìn)行采樣,共計(jì)采樣15次。

繁殖前期采樣時(shí),除采集常規(guī)樣品外,還需統(tǒng)計(jì)親魚的絕對(duì)繁殖力。

繁殖期提前在池塘鋪設(shè)產(chǎn)卵網(wǎng)片(網(wǎng)片由棕櫚樹皮編織而成,大小20 cm×30 cm),每天早晚各收集一次,記錄網(wǎng)片數(shù)目,每天隨機(jī)挑取3片統(tǒng)計(jì)產(chǎn)卵量,之后轉(zhuǎn)移至孵化池孵化。

1.5 大口黑鱸反季節(jié)繁殖

2019年9—11月進(jìn)行反季節(jié)親本培育實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)在3個(gè)相同水泥池(面積10 m×10 m×1.2 m)中進(jìn)行,水深1 m,池頂架設(shè)可調(diào)節(jié)的遮陽(yáng)網(wǎng),分別為控溫組、促熟組和對(duì)照組,每組隨機(jī)從池塘挑選80尾親魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)魚轉(zhuǎn)入水泥池后暫養(yǎng)1周實(shí)驗(yàn),開始實(shí)驗(yàn)前采樣1次。實(shí)驗(yàn)期間每天飽食投喂,各組間保持一致,并加強(qiáng)水質(zhì)管理,定期吸污換水,溶氧控制在(6.5±1.0)mg/L。

控溫組:該組采用地下水(常年水溫19—21℃)進(jìn)行控溫處理。第一步是降溫處理,水溫由29—30℃逐漸降至21℃,歷時(shí)30d,期間為保證降溫效果,正午時(shí)進(jìn)行部分遮蔭處理,降溫結(jié)束后采樣1次,記錄性腺發(fā)育狀況。之后維持水溫20—21℃繼續(xù)培育,直至繁殖產(chǎn)卵,期間每10天采樣1次,觀察性腺發(fā)育狀況。

促熟組:該組不進(jìn)行控溫處理,僅對(duì)親本進(jìn)行連續(xù)、低劑量的外源性激素注射,探究激素處理對(duì)親本性腺啟動(dòng)發(fā)育的影響。主要激素有促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)+馬來酸地歐酮(DOM)+魚用絨毛膜促性腺激素(HCG),劑量為10 μg/kg的LHRH-A2、5 mg/kg的DOM、700 IU/kg的HCG,每隔10天在胸鰭基部注射一次,采樣時(shí)間與控溫組相同。

對(duì)照組:該組不作任何處理,使親魚性腺自然發(fā)育,期間的投喂、水質(zhì)管理、采樣時(shí)間等均與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS(IBM SPSS Statistics,Version 24)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),然后進(jìn)行用Duncan’s多重比較來確定組間差異的顯著性,P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)分析各組數(shù)據(jù)的相關(guān)性。采用Origin 2017繪圖軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果

2.1 溫度與光照時(shí)長(zhǎng)變化對(duì)大口黑鱸卵巢周年發(fā)育規(guī)律的影響

大口黑鱸雌魚GSI與水溫、光照的周年變化規(guī)律如圖2所示,可見,華中地區(qū)周年水溫在5.7—34.1℃,高溫(水溫高于30℃)和低溫(水溫低于15℃)時(shí)間較長(zhǎng),接近6個(gè)月,而這段時(shí)間大口黑鱸攝食量顯著降低或停止,可見華中地區(qū)接近6個(gè)月的高溫與低溫期并不利于大口黑鱸的生長(zhǎng)。周年光照時(shí)長(zhǎng)在10.2—14.1 h/d間,雌魚GSI周年變化在0.63%—7.95%。

圖2 大口黑鱸卵巢性腺指數(shù)(GSI)的周年變化Fig.2 Changes annual gonadosomatic index in largemouth bass不同字母表示差異顯著(P＜0.05)

繁殖前期:當(dāng)水溫回升至15.1℃后,卵巢進(jìn)入快速發(fā)育階段,卵母細(xì)胞大量積累卵黃,從3月19日至4月19日,GSI由4.37%增長(zhǎng)至最大值7.95%,差異顯著(P＜0.05)。此階段以Ⅳ期卵巢為主,呈米黃色,幾乎充滿整個(gè)腹腔(圖3B),組織學(xué)觀察可見卵母細(xì)胞內(nèi)充滿卵黃顆粒,其間布滿油滴,有的進(jìn)一步融合成體積較大的油球(圖4B)。Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞數(shù)量比由15%增至31%,Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞數(shù)量比由8%增至37%(圖5)。

繁殖期:實(shí)驗(yàn)觀察到大口黑鱸繁殖期從4月19日開始,5月23日產(chǎn)卵活動(dòng)結(jié)束,此時(shí)卵巢顏色變深,卵粒透明(圖3C),卵黃顆粒水合作用顯著,大部卵黃顆粒融合,油滴聚合,油球變大,組織切片觀察還可看見部分空濾泡膜存在(圖4C)。GSI由7.64%降至4.60%,前后差異顯著(P＜0.05),值得注意的是,繁殖結(jié)束時(shí)GSI仍然較大,卵巢中仍有大量成熟卵子未能產(chǎn)出,Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞數(shù)量比占15%,Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞數(shù)量比占13%(圖5)。繁殖期水溫在19.8—26.7℃波動(dòng)。

圖3 大口黑鱸卵巢解剖圖Fig.3 Ovary anatomy of largemouth bass

退化階段:當(dāng)水溫高于26.7℃后,產(chǎn)卵活動(dòng)結(jié)束,卵泡閉鎖,大約歷時(shí)50d左右卵巢退化回Ⅱ期(圖3E),GSI由4.60%降至0.68%,差異顯著(P＜0.05),此階段卵巢中以Ⅱ時(shí)相、Ⅵ時(shí)相卵母細(xì)胞為主,其中Ⅵ時(shí)相卵母細(xì)胞無規(guī)則形狀,為退化崩解的Ⅴ時(shí)相、Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞(圖4D),卵巢外觀松軟,呈肉紅色(圖3D)。此后直至10月中旬,卵巢一直處于Ⅱ期(圖3E、圖4E),且GSI差異不顯著(P＞0.05)。

啟動(dòng)發(fā)育階段:華中地區(qū)卵巢啟動(dòng)發(fā)育的時(shí)間是在10月中旬至12月初,GSI由0.82%增長(zhǎng)到2.08%,開始出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)。卵巢由Ⅱ期發(fā)育至Ⅲ期(圖3F和圖4F),開始沉積卵黃,出現(xiàn)放射帶,濾泡膜細(xì)胞逐漸變?yōu)閮蓪?卵巢中Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞數(shù)量比升至34%。此間水溫逐漸降低,由20.6℃降至11.0℃,光照時(shí)長(zhǎng)由11.5 h/d降至10.3 h/d,接近一年最低值(圖2)。

越冬期:大口黑鱸以Ⅲ期卵巢越冬,越冬階段卵巢發(fā)育緩慢,在12月10日時(shí)GSI為2.08%,3月6日時(shí)僅為3.32%,前后存在顯著差異(P＜0.05),但歷時(shí)較長(zhǎng),相對(duì)發(fā)育較慢(圖3F和圖4A)。此期間Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞在29%—34%。越冬期溫度在5.76—13.5℃之間波動(dòng)。

2.2 大口黑鱸MFI、HSI變化規(guī)律

池塘養(yǎng)殖大口黑鱸雌魚HSI的周年變化范圍為1.47%—3.05%,12月份達(dá)到最大,HSI全年最低值出現(xiàn)在4月中旬。HSI與GSI相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),兩者在10月至次年4月產(chǎn)卵前關(guān)系緊密,呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05,r=-0.531),在5—9月,兩者不存在顯著相關(guān)性(P＞0.05,圖6A)。

池塘養(yǎng)殖大口黑鱸雌魚的MFI周年變化范圍在0.64%—2.09%,MFI最大值出現(xiàn)在10月份,表明此時(shí)腸系膜脂肪積累量達(dá)到最大,這為越冬儲(chǔ)存了足夠能量,而5月底MFI為一年最低值,也正是繁殖活動(dòng)結(jié)束的時(shí)間。將MFI與GSI進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),在10月至次年4月份兩者顯著相關(guān)(P＜0.05),呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.681);在5—9月,MFI和GSI也同樣存在顯著性(P＜0.05)負(fù)相關(guān)(r=-0.683,圖6B)。

2.3 自然繁殖季節(jié)大口黑鱸繁殖力的統(tǒng)計(jì)

由表1可知,2齡大口黑鱸性腺發(fā)育到V期時(shí),絕對(duì)繁殖力為44637—69853粒,平均值為54127.80粒;相對(duì)體重繁殖力在54.35—66.25粒/g,平均值為59.12粒/g;相對(duì)體長(zhǎng)繁殖力變化幅度較大,在137.20—192.00粒/mm,平均值為160.68粒/mm。絕對(duì)繁殖力在45000—65000粒的個(gè)體占80%(圖7C)。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),大口黑鱸絕對(duì)繁殖力與體質(zhì)量(r=0.879)、性腺重(r=0.819)、體長(zhǎng)(r=0.704)顯著(P＜0.05)正相關(guān),而與GSI相關(guān)性不顯著(P＞0.05)。其中,絕對(duì)繁殖力與體質(zhì)量的線性回歸方程為Y=62.12X-2532.15(R2=0.71,圖7A),絕對(duì)繁殖力與體長(zhǎng)的線性回歸方程為Y=238.39X-25801.62(R2=0.45,圖7B)。

圖4 大口黑鱸卵巢各發(fā)育時(shí)期的組織學(xué)觀察Fig.4 Histological observation of ovarian development in largemouth bass

在整個(gè)繁殖季節(jié)共兩個(gè)產(chǎn)卵期,中間間隔7天,第一次共連續(xù)收集產(chǎn)卵網(wǎng)片356片,第二次182片,隨著水溫升高,產(chǎn)卵網(wǎng)片數(shù)逐漸減少,當(dāng)水溫高于26.7℃后,產(chǎn)卵停止(圖7D)。

2.4 大口黑鱸反季節(jié)繁殖

實(shí)驗(yàn)開始前大口黑鱸卵巢GSI為0.53%(圖8A),處于Ⅱ期(圖9E和圖10E),精巢GSI為0.21%(圖8B),同樣處于Ⅱ期(圖9A),精巢切片可以發(fā)現(xiàn)僅有少量小葉腔內(nèi)可見少量精子(圖10A)。

在降溫處理結(jié)束后(9月29日),控溫組雌魚GSI增至0.83%,對(duì)照組增至0.79%,促熟組增至0.67%,三組間差異不顯著(P＞0.05,圖8A)。雄魚GSI三組間差異也不顯著(P＞0.05,圖8B)。

與雌魚相比,雄魚精巢發(fā)育較早,成熟也較快(圖8C和圖8D),在10月8日便發(fā)現(xiàn),控溫組通過擠壓雄魚腹部可見乳白色精液從生殖孔流出,將精液在顯微鏡下用淡水激活,精子運(yùn)動(dòng)劇烈。此時(shí)雄魚GSI為0.58%,對(duì)照組GSI為0.36%,促熟組GSI為0.34%,控溫組和對(duì)照組存在顯著差異(P＜0.05,圖8B),而促熟組和對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05,圖8B)。

圖5 不同采樣時(shí)間點(diǎn)大口黑鱸卵巢各時(shí)相卵母細(xì)胞的數(shù)量比Fig.5 The number ratio of oocytes in the ovary of largemouth bass at different sampling time points

圖6 大口黑鱸HSI、MFI和GSI間的關(guān)系Fig.6 Relationship between HSI,MFI and GSI in largemouth bass

在10月29日時(shí),此時(shí)控溫組和對(duì)照組雌魚GSI開始存在顯著差異(P＜0.05,圖8A),控溫組GSI增至1.97%,對(duì)照組GSI為1.36%,而促熟組和對(duì)照組差異仍不顯著(P＞0.05,圖8A)。

在11月26日結(jié)束時(shí),控溫組和對(duì)照組雌魚GSI存在顯著差異(P＜0.05,圖8A),促熟組和對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05,圖8A),此時(shí)控溫組卵巢發(fā)育至Ⅳ期后期(圖9F和圖10F),對(duì)照組卵巢發(fā)育至Ⅲ期(圖9G和圖10G),促熟組卵巢發(fā)育至Ⅲ期后期(圖9H和圖10H)?？販亟M和對(duì)照組雄魚GSI存在顯著差異(P＜0.05,圖8B),但兩組精巢均發(fā)育至Ⅳ期末,小葉腔內(nèi)充滿大量成熟精子(圖9B、圖9C、圖10B和圖10C),促熟組和對(duì)照組在11月15日時(shí)差異不顯著(P＞0.05),但通過組織切片觀察促熟組精巢才發(fā)育至Ⅲ期,以初級(jí)精母細(xì)胞為主(圖10D)。

遺憾的是此后氣溫和水溫驟降,地下水難以維持適宜大口黑鱸性腺發(fā)育產(chǎn)卵的水溫,實(shí)驗(yàn)被迫結(jié)束,但以上結(jié)果仍表明本實(shí)驗(yàn)方法有效促進(jìn)了大口黑鱸性腺啟動(dòng)發(fā)育。

3 討論

3.1 大口黑鱸卵巢隨水溫、光照時(shí)長(zhǎng)變化的周年發(fā)育規(guī)律

魚類的性腺發(fā)育主要是指精卵的增殖、生長(zhǎng)和成熟的過程,而溫度是調(diào)控這一過程的關(guān)鍵,通常認(rèn)為,溫度是通過啟動(dòng)下丘腦-垂體-性腺軸的生理功能來發(fā)揮作用[18,19]。有學(xué)者報(bào)道,在自然水域中,受熱源污染地區(qū)的大口黑鱸幼魚性腺發(fā)育成熟要早于非熱源污染區(qū)[20],同樣在文昌魚(Branchiostoma belcher)[10]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[9]中,也表明升溫能夠促進(jìn)性腺發(fā)育成熟。當(dāng)然,也可通過控制低溫,推遲性腺發(fā)育,在對(duì)繁殖前期大口黑鱸進(jìn)行低溫處理,水溫平均16℃,能使親魚產(chǎn)卵時(shí)間推遲到6—9月份,而對(duì)照組(平均水溫23℃)自然情況下5月初便開始產(chǎn)卵[21]。因此,研究溫度和性腺發(fā)育的關(guān)系將有助于我們實(shí)現(xiàn)人工調(diào)控性腺發(fā)育周期的目的,這也是我們通過控溫手段來實(shí)現(xiàn)大口黑鱸反季節(jié)繁殖的基礎(chǔ)。

溫度影響性腺的發(fā)育成熟。Martyniuk等[23]對(duì)德克薩斯州野生大口黑鱸性腺發(fā)育研究中指出,卵子的增殖過程和小生長(zhǎng)期是在6—9月,這期間主要進(jìn)行卵母細(xì)胞數(shù)量的增加和濾泡膜的初步形成,但GSI并無顯著差異,在10—12月,初級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)入大生長(zhǎng)期,積累卵黃,體積增大,GSI與前幾個(gè)月表現(xiàn)出顯著差異(P＜0.05),這與我們研究的池塘大口黑鱸卵子增殖及生長(zhǎng)的時(shí)間大致相似,在7—10月,Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主,濾泡膜逐漸形成,到12月時(shí)卵母細(xì)胞已進(jìn)入Ⅲ時(shí)相,出現(xiàn)兩層濾泡膜、出現(xiàn)放射膜,細(xì)胞質(zhì)中開始沉積卵黃。

表1 池塘養(yǎng)殖大口黑鱸雌魚的繁殖力Tab.1 Fecundity of pond-raised largemouth bass(n=10)

圖7 池塘養(yǎng)殖大口黑鱸相對(duì)繁殖力的統(tǒng)計(jì)Fig.7 Relative fecundity statistics of pond-raised largemouth bass

對(duì)比兩地水溫可以發(fā)現(xiàn),均是在降溫的過程中性腺開始啟動(dòng)發(fā)育,在Martyniuk等[23]研究的野生大口黑鱸中,水溫從24.4℃降至16.1℃時(shí),性腺啟動(dòng)發(fā)育,GSI前后出現(xiàn)顯著差異;我們研究的池塘養(yǎng)殖大口黑鱸的水溫由34.1℃降至20.6℃時(shí),卵巢中仍以第Ⅰ、Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主,但水溫由20.6℃降至11.0℃時(shí),卵巢中逐漸以Ⅲ時(shí)相卵子為主,開始積累卵黃,同時(shí)GSI發(fā)生顯著變化;而在Brown等[24]的研究中同樣發(fā)現(xiàn),在美國(guó)中西部地區(qū),當(dāng)水溫由19.4℃降至13.9℃時(shí),大口黑鱸卵巢中開始出現(xiàn)Ⅲ時(shí)相卵子,表明性腺開始發(fā)育,可見在不同環(huán)境條件下,大口黑鱸性腺開始發(fā)育的水溫不盡相同,但均需要經(jīng)歷降溫刺激的過程。

圖8 反季節(jié)大口黑鱸培育中性腺指數(shù)(GSI)變化規(guī)律Fig.8 Gonadosomatic index(GSI)changes of largemouth bass in off-season spawning

溫度同樣影響魚類的產(chǎn)卵退化。當(dāng)溫度高于或低于繁殖水溫時(shí),魚類性腺便開始退化,如在成熟的雌性鱘魚養(yǎng)殖中,水溫高于15℃時(shí),引起了卵巢卵泡閉鎖、胚泡遷移和排卵受阻等現(xiàn)象[22]。Gross等[15]曾報(bào)道過佛羅里達(dá)州池塘養(yǎng)殖大口黑鱸的繁殖期是在1月中旬至6月中旬,長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的繁殖期,而在本研究中,華中地區(qū)大口黑鱸的繁殖期是4月中旬至5月底,僅僅1個(gè)多月。兩地區(qū)大口黑鱸的繁殖水溫相似,佛羅里達(dá)州繁殖期水溫在18.3—28.3℃,華中地區(qū)繁殖期水溫在19.2—26.7℃,但佛羅里達(dá)州的氣候條件使得池塘水溫相對(duì)穩(wěn)定,保證了長(zhǎng)時(shí)間適宜的繁殖水溫,而華中地區(qū)氣溫變化較大,冬季氣溫低,夏季氣溫高,這使得適宜繁殖的時(shí)間較短。我國(guó)南北氣候差異較大,華南地區(qū)冬無嚴(yán)寒,夏無酷暑,全年平均氣溫25℃左右,使得自然環(huán)境下大口黑鱸2月便進(jìn)入繁殖期,5月初結(jié)束產(chǎn)卵活動(dòng),同樣與華中地區(qū)存在很大差異[4]。Brown等[24]也曾報(bào)道,美國(guó)中西部地區(qū)大口黑鱸的繁殖期在6月中旬至7月底,繁殖水溫在16.6—18.5℃,這與華中地區(qū)、華南地區(qū)及佛羅里達(dá)州地區(qū)均存在差異,這一切表明大口黑鱸適應(yīng)能力極強(qiáng),在不同環(huán)境下已經(jīng)演變出了適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的性腺發(fā)育規(guī)律與繁殖規(guī)律,因此開展相關(guān)研究,應(yīng)基于本地區(qū)氣候條件進(jìn)行。

圖9 大口黑鱸反季節(jié)繁殖中各組性腺解剖圖的比較Fig.9 Comparison of gonad development in different groups during the off-season spawning in largemouth bass

圖10 大口黑鱸反季節(jié)繁殖中性腺組織切片觀察Fig.10 Gonadal histological observation of largemouth bass in off-season spawning

華中地區(qū)高溫較早來臨使大口黑鱸的繁殖效率極低,在繁殖期結(jié)束時(shí),雌魚GSI仍有4.6%,而佛羅里達(dá)州地區(qū)產(chǎn)卵結(jié)束時(shí)雌魚GSI僅有2.3%[15]。華中地區(qū)在5月24日繁殖結(jié)束后雌魚卵巢中仍有大量成熟待產(chǎn)的卵(13%的Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞、15%的Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞),但水溫過高,卵泡閉鎖,性腺開始退化,我們推測(cè)這是造成華中地區(qū)苗種生產(chǎn)不足問題的一個(gè)重要原因。因此,如果有條件保持適宜的繁殖水溫,我們相信對(duì)于分批產(chǎn)卵的大口黑鱸而言,在本地區(qū)同樣可以延長(zhǎng)繁殖期。

光照時(shí)長(zhǎng)同樣影響著魚類性腺發(fā)育,Jourdran等[25]研究指出,光照時(shí)長(zhǎng)增加(12、18和24h/d)顯著抑制了河鱸(Perca fluviatilis)幼魚的性腺發(fā)育,尤其是對(duì)雄性抑制效果更佳。光周期也會(huì)影響著魚類性腺啟動(dòng)發(fā)育,在Migaud等[26]研究中發(fā)現(xiàn),連續(xù)的光照(24h/d)會(huì)抑制河鱸性腺啟動(dòng)發(fā)育,卵巢啟動(dòng)發(fā)育的占比低于2%,精巢啟動(dòng)的占比低于1%,而恒定的光周期(16h/d)條件下河鱸性腺會(huì)啟動(dòng)發(fā)育,但發(fā)育不同步,而對(duì)照組(自然光照時(shí)長(zhǎng))20%的雌性,40%的雄性性腺均啟動(dòng)發(fā)育。同樣,我們研究發(fā)現(xiàn),大口黑鱸卵巢啟動(dòng)發(fā)育時(shí)光照時(shí)長(zhǎng)從11.4 h/d降至10.3 h/d(圖2),屬于一年中的短光照時(shí)長(zhǎng),這在一定程度上表明,大口黑鱸性腺啟動(dòng)發(fā)育同樣需要短光照時(shí)長(zhǎng)的刺激。先前團(tuán)隊(duì)在大口黑鱸規(guī)?；醇竟?jié)繁育中就推測(cè),光照可能對(duì)于卵子的早期發(fā)育更重要,而溫度對(duì)于卵黃生成和最終成熟更加重要[6]。在今后大口黑鱸繁育的科研與生產(chǎn)實(shí)踐中,為了提升繁育效果,也應(yīng)當(dāng)考慮光照時(shí)長(zhǎng)的控制。

3.2 HSI和MFI隨性腺發(fā)育的變化規(guī)律

魚類的性腺發(fā)育過程十分復(fù)雜,目前并未清楚地闡明性腺發(fā)育和個(gè)體能量轉(zhuǎn)換間的關(guān)系,魚類的能量主要以中性脂肪的形式儲(chǔ)存于肝臟、腸系膜和肌肉中[27,28],為了滿足性腺發(fā)育需要,脂肪中的能量物質(zhì)需要不斷轉(zhuǎn)向性腺,尤其在卵黃積累階段,肝細(xì)胞更是直接合成卵黃蛋白原供給性腺發(fā)育[29]。有研究表明,大口黑鱸肌肉中總脂肪含量的季節(jié)變化范圍很小,僅為濕重的0.7%—0.9%,表明在性腺發(fā)育過程中,肌肉中脂肪供能相對(duì)較少,主要以肝臟和腸系膜脂肪供能為主[30]。

在我們研究中,自卵巢啟動(dòng)發(fā)育至繁殖產(chǎn)卵前,GSI分別與HSI、MFI呈顯著(P＜0.05)負(fù)相關(guān),其中越冬期HSI、MFI下降較快,除了維持正常生理活動(dòng)消耗外,主要是轉(zhuǎn)移至卵子內(nèi)積累卵黃顆粒和油滴,組織切片可以發(fā)現(xiàn)越冬前多數(shù)卵母細(xì)胞內(nèi)并未沉積卵黃顆粒,越冬后大量卵黃顆粒由卵膜側(cè)向核膜側(cè)沉積(圖4F和圖4A),后續(xù)發(fā)育主要是卵子積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過程,將消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),作為分批產(chǎn)卵的魚類,HSI和MFI和外界營(yíng)養(yǎng)供給將直接影響著性腺的發(fā)育質(zhì)量,在自然水域環(huán)境下,由于食物相對(duì)匱乏,大口黑鱸GSI一般小于4%[23],而在人工養(yǎng)殖條件下GSI最大可達(dá)14%[15];同樣在Brown等[31]研究結(jié)果中也表明,MFI在繁殖前降到最低值。因此我們認(rèn)為,隨著性腺發(fā)育,肝臟和腸系膜脂肪中的儲(chǔ)存能量處于不斷消耗的狀態(tài),且主要流向性腺。在性腺退化后,直至性腺啟動(dòng)發(fā)育前,HSI和MFI均不斷增加,這段時(shí)間主要是肝臟、腸系膜脂肪重新積累能量的過程,這種高效的能量分配策略保障了性腺的充分發(fā)育。因此,性腺發(fā)育啟動(dòng)之前,肝臟和內(nèi)臟中能量的積累,對(duì)于后期繁育效果至關(guān)重要。同時(shí),肝臟和內(nèi)臟中的能量,何時(shí)、如何轉(zhuǎn)移至性腺中,不論對(duì)于正常季節(jié)還是反季節(jié)繁育都非常關(guān)鍵。

對(duì)比反季節(jié)親本與正常季節(jié)親本的GSI后發(fā)現(xiàn),在性腺同樣發(fā)育至Ⅳ末時(shí),反季節(jié)親本成熟系數(shù)僅有4.06%,而正常季節(jié)已達(dá)到7.13%,團(tuán)隊(duì)在大口黑鱸反季節(jié)親本培育實(shí)驗(yàn)中,產(chǎn)卵前1個(gè)月時(shí)GSI僅為2.50%[6],可見性腺接近成熟時(shí)三者GSI差別較大。對(duì)比性腺啟動(dòng)發(fā)育時(shí)三者脂肪沉積情況發(fā)現(xiàn),正常季節(jié)親魚的MFI為2.09%,達(dá)到了一年中的最大值,在本研究中反季節(jié)親本MFI僅有1.34%,團(tuán)隊(duì)先前研究的親本MFI僅1.1%[6],三組MFI存在差異主要是受攝食情況影響,華中地區(qū)正常季節(jié)10—12月間水溫在20℃左右,非常適宜大口黑鱸攝食生長(zhǎng),脂肪積累量達(dá)到一年最大值,而反季節(jié)培育前本地區(qū)屬于高溫(＞30℃)期,大口黑鱸幾乎處于停止攝食的狀態(tài),缺少了營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的過程,不利于脂肪沉積。因此我們推斷導(dǎo)致繁殖前大口黑鱸卵巢GSI差異較大可能與親魚攝食情況、脂肪積累量有關(guān),同時(shí)比較反季節(jié)實(shí)驗(yàn)中控溫組和對(duì)照組攝食情況可以發(fā)現(xiàn),對(duì)照組共投喂15.5 kg配合飼料,控溫組由于水溫適宜,共投喂25.3 kg配合飼料,控溫組平均每尾魚的飼料消耗量大于對(duì)照組,但試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組MFI為2.12%,控溫組雌魚MFI僅為1.53%,控溫組MFI卻顯著低于對(duì)照組,再次表明性腺發(fā)育消耗了大量的腸系膜脂肪。由于大口黑鱸卵巢屬于不同步發(fā)育類型,充足的能量供給將能夠保證更多的卵子得到發(fā)育,從而保證了后期性腺的發(fā)育質(zhì)量,不過這仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但我們必須注意到脂肪積累對(duì)性腺發(fā)育質(zhì)量的重要性,尤其是在反季節(jié)親本培育中,為保證性腺的發(fā)育質(zhì)量,前期必須進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化,在一定脂肪積累量的基礎(chǔ)上再進(jìn)行培育。

3.3 大口黑鱸的反季節(jié)繁殖

目前,華中地區(qū)大口黑鱸所面臨的問題已經(jīng)嚴(yán)重限制了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,解決這些問題的有效方法之一便是培育反季節(jié)苗種,但目前并沒有比較高效的親本培育方法。團(tuán)隊(duì)之前利用水庫(kù)深層水進(jìn)行控溫處理,模擬正常繁殖季節(jié)環(huán)境的變化規(guī)律(秋季的降溫過程、越冬時(shí)的低溫階段及春季的升溫過程),并按照一定比例縮減在140d內(nèi)完成,最終在9月和10月成功獲得苗種[6],該模式對(duì)基礎(chǔ)設(shè)施要求較高,需要在夏季高溫時(shí)仍有充足的低溫水(10℃左右)供應(yīng),同時(shí)還要有充足的高溫水用于后續(xù)升溫培育,為了進(jìn)一步控制成本,提高效率,程序性溫度控制至關(guān)重要,需要進(jìn)一步摸索低溫限度、低溫時(shí)長(zhǎng)等關(guān)鍵因素。Matthews等[32]采用的是大型加熱-制冷機(jī)組控溫,模擬自然環(huán)境下光照、溫度變化規(guī)律,依次先降溫,再維持低溫(10℃左右),最后升溫至產(chǎn)卵水溫,并在此過程中調(diào)控光照時(shí)長(zhǎng),由10 h/d降至8 h/d,后升至14 h/d,最終歷時(shí)130d成功孵化出苗種,但是該方法成本投入太高,且規(guī)模較小,不適合生產(chǎn)應(yīng)用?？梢园l(fā)現(xiàn),這兩種方法有一個(gè)共同的限制因素,即均需要在夏秋高溫季節(jié)時(shí)對(duì)親本進(jìn)行低溫刺激(10℃左右),以達(dá)到性腺啟動(dòng)發(fā)育的目的,因此,我們考慮能否充分利用華中地區(qū)的地下水資源,采用更高的水溫來刺激親本,以實(shí)現(xiàn)親本性腺啟動(dòng)發(fā)育?；谖覀円延械木Y源,探究了(20±1)℃的水溫刺激親本,結(jié)果同樣達(dá)到性腺啟動(dòng)發(fā)育的目的。

Spengler等[33]也表示持續(xù)低溫(≤12℃)刺激是反季節(jié)大口黑鱸性腺啟動(dòng)發(fā)育的關(guān)鍵,但在我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),短暫降溫后持續(xù)采用(20±1)℃水溫刺激,同樣實(shí)現(xiàn)了性腺啟動(dòng)發(fā)育。還有一點(diǎn)值得注意,在團(tuán)隊(duì)前期研究中,大口黑鱸卵巢由Ⅱ期增至Ⅲ期是在水溫回升至20℃之后,表明在前期的降溫、維持低溫及升溫至20℃前,卵巢始終處于Ⅱ期,并沒有發(fā)生顯著性差異(P＞0.05)[6]。因此,可以初步推斷,大口黑鱸性腺啟動(dòng)發(fā)育并不一定需要模擬越冬環(huán)境或低于某個(gè)溫度閾值的水溫刺激,在經(jīng)過某個(gè)溫度差的降溫[本實(shí)驗(yàn)由(29±1)℃降至(20±1)℃]后,保證降溫之后有適宜性腺生長(zhǎng)發(fā)育的水溫[本實(shí)驗(yàn)(20±1)℃]同樣能達(dá)到性腺啟動(dòng)發(fā)育的目的,不過其他的降溫差及降溫后培育水溫能否啟動(dòng)性腺發(fā)育仍需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

華中地區(qū)大口黑鱸反季節(jié)繁殖的最佳時(shí)間段是在9—10月份,一是孵化后池塘水溫仍然適合苗種生長(zhǎng),能保證以大規(guī)格苗種越冬;二是此時(shí)池塘中仍然可以培育出豐富的浮游生物供仔魚早期生長(zhǎng)[6];三是此階段培育出來的苗種,在來年繁育季節(jié)并未達(dá)到性成熟,可以極大減少因性成熟所帶來的能量消耗(掉膘)和一定比例的死亡。比較團(tuán)隊(duì)先前研究[6]和Matthews等[32]的實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),整個(gè)反季節(jié)培育時(shí)長(zhǎng)在4—5個(gè)月,而正常季節(jié)大口黑鱸性腺退化回II期是在6—7月,因此,反季節(jié)大口黑鱸培育的最佳起始時(shí)間是在7月初。由于我們培育實(shí)驗(yàn)是在8月31日開始,后期氣溫驟降,導(dǎo)致最終未能順利完成產(chǎn)卵。在我們實(shí)驗(yàn)中,在省去低溫(10℃左右)刺激后有效縮短培育周期,僅通過3個(gè)月處理,卵巢即發(fā)育至Ⅳ期末,出現(xiàn)核偏移現(xiàn)象,達(dá)到了生理成熟,表明該方法能適當(dāng)縮短培育時(shí)間,提高效率。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)華中地區(qū)大口黑鱸卵巢隨水溫和光照時(shí)長(zhǎng)變化的周年發(fā)育規(guī)律進(jìn)行研究,并探索華中地區(qū)反季節(jié)繁殖的方法,我們發(fā)現(xiàn)水溫升高對(duì)于大口黑鱸卵黃沉積和卵子最終成熟非常重要,適宜繁殖水溫的維持對(duì)于延長(zhǎng)華中地區(qū)產(chǎn)卵時(shí)間至關(guān)重要;對(duì)于反季節(jié)繁殖來說,溫度的降低或升高(溫度變化),而不是低溫的維持,可能更加重要。本研究對(duì)后續(xù)研究大口黑鱸在全世界范圍內(nèi)迅速適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境、反季節(jié)繁育和種群控制等方面有指導(dǎo)意義。