桂魚人工育種研究

翹嘴鱖( Siniperca chuatsi Basilewsky) 是一種名貴經(jīng)濟(jì)魚類，廣泛分布于我國的幾大水系中［1］。近年來，由于水環(huán)境污染嚴(yán)重和缺乏科學(xué)的保種、育種方法，翹嘴鱖一些優(yōu)良品質(zhì)發(fā)生退化。獲得抗病強(qiáng)、生長快、易馴食等優(yōu)良性狀的鱖新品系是鱖育種工作的首要問題。同時，翹嘴鱖雌雄個體生長差異較大，雌性比雄性生長較快、個體大［2 －3］，養(yǎng)殖全雌翹嘴鱖成為提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益的重要途徑。人工雌核發(fā)育是快速建立純系的單性生殖方式［4］，實踐證明一次有絲分裂雌核發(fā)育相當(dāng)于 8 ～10 代近交才能達(dá)到的效果，一次有絲分裂和一次極體雌核發(fā)育就可以快速獲得純系［5 －7］。20 世紀(jì)70 年代后，我國開始進(jìn)行人工雌核發(fā)育技術(shù)研究，目前這項技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于鯉( Cyprinus carpio) 、虹鱒( Salmo gairdneri) 等近 30 種經(jīng)濟(jì)魚類［8 －10］。而國內(nèi)對翹嘴鱖的雌核發(fā)育研究尚未見報道。本研究以翹嘴鱖為研究材料，采取經(jīng)紫外線照射滅活的精子刺激成熟卵子發(fā)育，加以冷休克人工誘導(dǎo)獲得正常的雌核發(fā)育二倍體翹嘴鱖后代，為深入研究翹嘴鱖雌核發(fā)育機(jī)理積累資料。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料

翹嘴鱖購自廣東省佛山市新榮魚苗繁殖場。選擇健康，體表無傷，性腺成熟的 2 齡雄魚和雌魚，體重為 1. 3 ～1. 7 kg。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 精卵的收集

采用絨毛膜促性腺激素( HCG) 和促黃體素釋放激素類似物( LRH － A2) 混合一次注射法對翹嘴鱖親魚進(jìn)行人工催產(chǎn)。雌魚劑量為 2 000 IU/kgLRH － A2 + 15 μg / kg HCG，雄魚劑量減半。待達(dá)到效應(yīng)時間時，用干毛巾吸干體表的水，輕壓雌魚腹部獲得卵子并裝于潔凈干燥的孵化盆中，卵子擠出后放置于冷暗處，避光待用。

1. 2. 2 精子滅活條件篩選

取新鮮翹嘴鱖精液 500 μL，按 1 ∶ 4 比例用Hank’s 液稀釋，平鋪于直徑 9 cm 的預(yù)冷培養(yǎng)皿中，厚度在 2 mm 左右，用紫外交聯(lián)儀分別按 0、20、40、60、80、100、120、140 mJ / cm2進(jìn)行照射失活。失活后立即與3 mL 翹嘴鱖的卵干法受精。受精卵放入孵化槽中孵化。本實驗以氣石充氧的方式，采用 6 L 的塑料槽作為臨時孵化設(shè)施。在受精后 10 ～ 12 h 計算受精率，在孵化期計算孵化率、畸形率、成活率。

1. 2. 3 卵子激活與二倍體化

用 1. 2. 2 中確定的最佳紫外線滅活精子的劑量對精子進(jìn)行處理，與卵結(jié)合受精。設(shè)計 3、5、7 min冷休克起始時間，將受精卵放入 0 ～ 3 ℃ 的冰水中處理 10、20、30、40、50 min，每組設(shè) 3 個重復(fù)，用來確定最佳的冷休克處理起始時間和持續(xù)時間。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

記錄各試驗組和對照組原腸胚期、出膜期苗種數(shù)和能正常攝食個體的存活數(shù)，并計算受精率、孵化率和雌核發(fā)育率。數(shù)據(jù)采用 Excel 和 SPSS 軟件處理，對不同處理方法的各試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析( One － way ANOVA) 和 Duncan 氏多重比較。

2 結(jié)果

2. 1 精子最佳滅活條件

不同劑量的紫外線照射精子后，處理過的精子與卵細(xì)胞結(jié)合后的受精率、孵化率、仔魚畸形率及仔魚成活率見圖 1。在實驗條件下，紫外線照射劑量為 0 時，受精率和孵化率均為最高。紫外線照射劑量為 20 mJ/cm2時孵化率最低; 隨著照射劑量增加，孵化率升高，到 80 mJ/cm2孵化率達(dá)到最高;隨后提高紫外線照射劑量孵化率反而下降，呈明顯的 Herwting 效 應(yīng)。當(dāng) 紫 外 輻 射 劑 量 在 40 ～100 mJ / cm2時，各處理組的受精率沒有顯著性的差異，但隨著紫外劑量的增加，處理組的受精率具有明顯的下降的趨勢。其對應(yīng)的孵化率也具有相同的結(jié)果。隨著紫外輻射劑量的增高，各處理組孵化魚苗單倍體畸形率增加。當(dāng)輻射劑量達(dá)到 60 mJ/cm2，各處理組孵化魚苗的畸形率均達(dá)到 98% 以上，至 80 mJ/cm2時畸形率即達(dá)到 100%，但均未能過渡到外源性營養(yǎng)期，成活率為 0?？梢姡N嘴鱖精子對紫外線輻射處理是很敏感的，而 80 mJ/cm2是最佳的翹嘴鱖精子滅活劑量。

2. 2 染色體加倍條件優(yōu)化

試驗結(jié)果歸納如表 1 所示。由表中結(jié)果可知受精后冷休克處理起始時刻、冷休克處理持續(xù)時間兩因素不同，對誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育的影響是有明顯差異的。在受精后 5 min 對受精卵進(jìn)行冷休克處理持續(xù) 30 min 所獲得的二倍體翹嘴鱖在原腸胚時期存活率和正常出苗率均最高，分別達(dá)到 23. 34% 和4. 72% 。而其他處理組最終的正常出苗率均較低。受精后不同起始處理時刻與 5 min 處理組在原腸胚時期存活率和正常出苗率均存在顯著性差異; 不同處理時間組與 30 min 處理組在原腸胚時期存活率和正常出苗率均存在顯著性差異( P ＜ 0. 05) 。因此，可以確定受精后5 min對受精卵低溫冷休克處理30 min 是誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育的最佳誘導(dǎo)條件。

2. 3 初孵仔魚形態(tài)學(xué)

形態(tài)學(xué)方面，正常發(fā)育二倍體組初孵魚苗全部正常，軀干筆直，能順利度過內(nèi)源營養(yǎng)期，到達(dá)平游階段并開口攝食，如圖 2 － A 所示; 隨著紫外線輻射劑量的增加，孵化出的正常仔魚的數(shù)量迅速減少，至 80 mJ/cm2時畸形率即達(dá)到 100%?；蔚淖恤~表現(xiàn)為出膜困難，尾部彎曲而短小，在顯微鏡下可觀察到卵黃囊粗大，圍心腔擴(kuò)大，具有明顯的單倍體綜合征，如圖 2 － B 所示。單倍體仔魚均不能過渡到平游階段。雌核發(fā)育二倍體仔魚和正常發(fā)育二倍體仔魚在形態(tài)學(xué)方面沒有明顯的差異，如圖 2 － C 所示，但發(fā)育時間要晚于正常發(fā)育二倍體仔魚。

3 討論

3. 1 精子滅活條件分析

使用紫外線對精子進(jìn)行滅活處理，紫外線主要作用在 DNA 上。紫外線照射能破壞精子的遺傳功能，但不降低它進(jìn)入卵子的能力［11］。因此，滅活用的紫外線劑量越大滅活越完全。但紫外線的劑量加大將會影響精子的誘導(dǎo)能力進(jìn)而影響孵化率。所以在篩選滅活條件時，最佳的滅活條件為可以使精子遺傳失活的最低紫外線劑量。如黃河鲇( Silurusasotus) 精液在稀釋后經(jīng) 30W 紫外線滅菌燈 ( 波長253. 7 nm) 照距 10 cm 照射 15 min 為適宜條件［12］，日本白鯽( Carassius cuvieri) 和大黃魚( Pseudosciaenacrocea) 精子滅活最適條件分別為為 3 000 mJ / cm2、1 692 μW?cm－ 2?s－ 1［13 － 14］，本研究采用紫外交聯(lián)儀作為紫外光源，可有效控制紫外照射的時間和劑量。在用紫外交聯(lián)儀照射翹嘴鱖精子時，將稀釋的精液在培養(yǎng)皿底部鋪成 0. 2 mm 左右的薄層來彌補(bǔ)紫外線穿透能力差的缺陷。再通過比較受精率、孵化率、畸形率和魚苗成活率四個參數(shù)，篩選出80 mJ / cm2是翹嘴鱖精子滅活的最佳劑量。此結(jié)果與花鱸( Lateolabrax japonicus)［15］、大菱鲆( Psettamaxima)［16］等的研究結(jié)果相似。

3. 2 誘導(dǎo)染色體加倍的條件

本研究在受精后 5 min 用冰水對受精卵進(jìn)行冷休克處理30 min，即是通過抑制第二極體的釋放而獲得二倍體的雌核發(fā)育翹嘴鱖，因而所獲得的雌核發(fā)育翹嘴鱖均是屬于減數(shù)分裂雌核發(fā)育魚。這一結(jié)果也與其他學(xué)者在其他魚類上獲得的結(jié)果不盡相同，如黃河鲇冷處理 40 min［12］，日本白鯽受精后2 min 施以冷休克處理( 0 ～ 4 ℃ ) 40 min［13］，大黃魚受精后 2 min 在 3 ～4 ℃海水中處理 10 min［14］為最佳。這可能與不同魚類第二極體排放時間及卵對低溫的耐受時間不同有關(guān)。第二極體的排出時間也與受精水溫、卵子的成熟程度、魚類的生長環(huán)境等有很大的關(guān)系［17 －18］，一般冷水性魚類較遲而溫水性魚類較早。在采用溫度休克時通常要用亞致死溫度才能有效地抑制第二極體的放出，并且處理時間太短無抑制作用，太長則會對胚體造成較大損傷，導(dǎo)致孵化率下降、畸型率上升而影響整體誘導(dǎo)效果。因此在進(jìn)行雌核發(fā)育的誘導(dǎo)過程中，需要多次的實驗來正確判斷第二極體的排出時間和受精卵對低溫的耐受時間，從而來確定最佳的誘導(dǎo)條件。本研究中，通過設(shè)計梯度平行實驗，確立了采用冷休克誘導(dǎo)翹嘴鱖染色體加倍的適宜條件。即在 0 － 3℃ 冰水下，冷休克起始時間為人工授精后 3 ～ 7 min均有效，以 5 min 為最適; 冷休克持續(xù) 10 ～50 min均有效，以 30 min 為最佳。

3. 3 雌核發(fā)育成活率低的原因

當(dāng)前，人工誘導(dǎo)魚類的雌核發(fā)育率普遍偏低［12，19 －21］。本研究中翹嘴鱖的雌核發(fā)育成活率也僅為 4. 72%。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育與魚類的有性生殖一樣，卵子和精子的質(zhì)量是影響誘導(dǎo)率和孵化率的關(guān)鍵因素。低溫刺激會對 “受精卵”造成不同程度的物理損傷，可能導(dǎo)致卵質(zhì)較差的卵停滯發(fā)育或畸形發(fā)育。又由于外界孵化條件的限制，致使孵化率低。此外，也有因雌核發(fā)育而使某些隱性致死基因純合表達(dá)的情況。這些因素的綜合作用使其出苗率較低。綜合上述試驗研究及其結(jié)果，認(rèn)為翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的成功獲得可為以后培育全雌翹嘴鱖優(yōu)良養(yǎng)殖新品系奠定良好的基礎(chǔ)，但需要對本研究中的雌核發(fā)育后代的性別比例做進(jìn)一步的實驗來進(jìn)行證明。同時，將人工獲得的純系應(yīng)用于生產(chǎn)，在水產(chǎn)科學(xué)上既有理論意義又有經(jīng)濟(jì)價值，但這方面的研究仍存在有許多難題，有待于進(jìn)一步深入探索。

（作者不詳）