加熱時復合魚肉蛋白性質變化研究

淡水養(yǎng)殖魚類中，鰱( Hypophthalmichthys moli-trix) 產量僅次于草魚 ( Ctenopharyngodon idellus) 位居第二，為 319. 3 萬 t［1］。盡管鰱產量很大，但以鮮銷為主，經濟價值不高。為了提高鰱的經濟價值，將鰱加工成冷凍魚糜可以在一定程度上提高鰱的利用率，減少鰱的浪費。魚糜制品是冷凍魚糜或新鮮魚肉經擂潰或斬拌、成型、加熱和冷卻等工序而制成的凝膠食品，是魚類深加工中產量較大的產品，僅次于魚類干腌制品［1］。魚糜制品在日本、美國等發(fā)達國家的產品種 類 較 多，工 業(yè) 化 程 度 很 高。日 本 每 年 有250 萬 ～ 300 萬 t 魚類用于加工魚糜制品，其產量占各類加工品的首位。凝膠特性是衡量魚糜制品最重要的指標。許多研究表明淡水魚糜的凝膠特性較海水魚糜差［3］。為了提高鰱糜的市場占有率，改善鰱糜凝膠特性成為急需解決的問題。有研究報道了鰱糜和帶魚糜以 7∶ 3 和 6∶ 4 比例復合的魚糜在30 ℃ 和 40 ℃ 凝膠化后的凝膠特性高于兩種單一魚糜［4］。Panpipat 等［5］報道了泰國紅牙 ( Otolithesruber) 和短體羽鰓鮐( Rastrelliger branchysoma) 以1∶ 1比例復合的魚糜凝膠強度高于兩種單一魚糜。復合魚糜成為提高淡水魚糜凝膠強度的有效方法。肌原纖維蛋白是冷凍魚糜中的主要蛋白，決定了魚糜的凝膠特性［6］。肌原纖維蛋白的變性和聚集等加熱特性是研究魚糜凝膠特性的基礎［7 －8］。為了更好地利用復合魚糜提高淡水魚糜的凝膠特性，進一步解釋其中的機理，本實驗研究了鰱、小黃魚( Pseudosciaena polyactis) 及其以質量比 1∶ 1 復合的肌原纖維蛋白的加熱特性，以期能夠為復合魚糜凝膠特性提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 材料

鰱和小黃魚: 均購于北京四道口水產批發(fā)市場，鰱個體 1 000 ～1 300 g，活運至實驗室; 小黃魚個體 500 ～600 g，為冰鮮產品，置于冰盒中運回實驗室。試劑: 三磷酸腺苷二鈉( ATP － 2Na) 購于 Sig-ma 公司; 5，5' － 二硫雙 － 2 － 硝基苯甲酸 ( DT-NB) 、三羥甲基氨基甲烷( Tris) 購于 Amresco 公司;其他化學試劑購于北京化學試劑公司。儀器設備: UNICO － 2700 分光光度計，美國尤尼克公司; GL － 16A 臺式離心機，長沙平凡儀器儀表公司; 乳化分散均質機，上海弗魯克機械制造公司; 分析天平，日本島津公司。DK －8D 三孔電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 肌原纖維蛋白的提取

敲擊活魚頭部致死，去鱗、去內臟。洗凈后取白肉。絞碎所得魚肉，置于冰箱4 ℃保存。肌原纖維蛋白的提取參見潘錦鋒等［9］的方法并稍做修改:取 100 g 魚肉，加入 4 倍體積的 0. 6 mol/L NaCl －20 mmol / L Tris － maleate( pH 7. 0) 緩沖溶液。分散均質機 4 檔位 15 000 r/min 勻漿 10 s。放入冰箱4 ℃ 下提取 60 min。再向蛋白提取液中加入 5 倍體積的冰冷的去離子水稀釋沉淀肌原纖維蛋白。在冷凍離心機中 4 ℃，10 000 r/min 離心 20 min，取沉淀。沉淀洗滌過程重復兩次。所得沉淀用 0. 6 mol/L NaCl － 20 mmol / L Tris － maleate( pH 7. 0) 緩沖液溶解，用雙縮脲法測定所得肌原纖維蛋白溶液濃度，并用0. 6 mol/L NaCl －20 mmol/L Tris － maleate( pH 7. 0) 緩沖溶液調節(jié)所需蛋白濃度。

1. 2. 2 肌原纖維蛋白溶液的加熱

將肌原纖維蛋白溶液調整至 2 mg/mL 或4 mg/mL。分別取 5 mL 蛋白溶液于 15 個 7 mL 的玻璃試管中，每個試管均塞上橡膠塞。將試管置于自制的泡沫板上，于溫度可控的水浴鍋中加熱，將溫度計插于試管中控制溶液溫度。升溫速率 1 ℃ /min。從 20 ～90 ℃每升高 5 ℃取出一根試管，放入冰水中立即冷卻。

1. 2. 3 肌原纖維蛋白濁度的測定

將肌原纖維蛋白溶液調整至 2 mg/mL，加熱后在 350 nm 下測定吸光值，實驗重復三次取平均值。1. 2. 4 肌原纖維蛋白 Ca2 +－ ATPase 活性的測定將肌原纖維蛋白溶液調整至 4 mg/mL，加熱后參考 Benjakul 等［10］的方法測定 Ca2 +－ ATPase 活性。空白組用 pH 7. 0，0. 6 mol/L NaCl －20 mmol/L Tris － maleate 緩沖液代替樣品。重復 3 次取平均值。Ca2 +－ ATPase 活性的表示方法為 1 mg 酶蛋白在 1 min 內生成的無機磷酸量( μmol) ?；钚?=0. 231 × ( APi +0. 0012) ; 式中 APi 為無機磷酸量( μmol) 。

1. 2. 4 肌原纖維蛋白巰基含量的測定

將肌原纖維蛋白溶液調整至 4 mg/mL，加熱之后參考 Benjakul 等［10］的方法測定 Ca2 +－ ATPase 活性?？瞻捉M用 pH 7. 0，0. 6 mol/L NaCl －20 mmol/L Tris － maleate 緩沖液代替樣品。重復 3 次取平均值。巰基含量用吸光度計算，用 μmol/g 蛋白表示。巰基含量計算公式為:巰基含量 = A × D/C × B其中 A 表示吸光值，B 表示待測液蛋白濃度( mg/mL) ，C 表示摩爾吸收系數(shù)，其值為 13. 6m2/ mol，D 為稀釋倍數(shù)，本實驗為 1。

2 結果與分析

2. 1 肌原纖維蛋白濁度的變化

由圖1 可以看出，隨加熱溫度的升高，鰱、小黃魚及其復合肌原纖維蛋白的濁度呈 S 型增大。鰱肌原纖維蛋白和小黃魚肌原纖維蛋白的濁度在 20～ 40 ℃ 間變化較小，當溫度高于 40 ℃ 時急劇增加。而復合肌原纖維蛋白的濁度在溫度高于 45 ℃時急劇增加。當溫度高于 55 ℃時，鰱肌原纖維蛋白的濁度超過復合肌原纖維蛋白的濁度。當溫度高于 65 ℃時，三種蛋白的濁度變化都趨于緩慢。由圖 2 可見，在 40 ～ 55 ℃時，鰱肌原纖維蛋白濁度增加速率大于小黃魚肌原纖維蛋白和復合肌原纖維蛋白的增加速率。當溫度高于 45 ℃時，復合肌原纖維蛋白的濁度變化速率與小黃魚肌原纖維蛋白的濁度變化速率基本相同。復合肌原纖維蛋白的濁度隨溫度的變化趨勢與小黃魚肌原纖維蛋白濁度的變化趨勢相似，不同于鰱肌原纖維蛋白的變化趨勢。

2. 2 肌原纖維蛋白 Ca2 +－ ATPase 活性的變化

由圖3 可得，鰱和小黃魚的酶活隨著加熱溫度的升高逐漸降低。鰱的酶活隨溫度稿的降低幅度比較大。加熱溫度為35 ℃、40 ℃、45 ℃時，酶活為原酶活的 52. 4%，30. 2%，26. 9%，當溫度高于55 ℃ 時，酶活完全喪失。在 20 ～ 30 ℃ 過程中，小黃魚的酶活變化幅度較小。加熱溫度為 35 ℃、40 ℃ 、45 ℃ 時， 酶活分別為原酶活的 87. 5% ，78. 8% 和 64. 2% ，當溫度高于 50 ℃ 時，酶活完全喪失。鰱和小黃魚的比例為 1∶ 1 的復合肌原纖維蛋白的酶活隨著加熱溫度的升高先升高后降低，在35 ℃ 時達到最大。 當加熱溫度上升至 40 ℃ 、45 ℃ 、50 ℃ 時， 酶活分別為原酶活的 97. 9% ，81. 8% 和 25. 7% 。從 45 ℃ 加熱到 50 ℃ 時，酶活下降幅度較大，并于 55 ℃時活性完全喪失。

2. 3 肌原纖維蛋白總巰基含量的變化

由圖 4 可以看出，鰱和小黃魚以及復合肌原纖維蛋白的巰基含量隨著加熱溫度的升高呈下降趨勢。當加熱溫度在 30 ～ 60 ℃時，鰱和小黃魚的巰基含量下降緩慢，當溫度高于 60 ℃時巰基含量顯著下降。復合肌原纖維蛋白的巰基含量在 30 ～65 ℃ 時下降緩慢，當溫度高于 65 ℃ 時顯著下降。與濁度和 Ca2 +－ ATPase 活性變化相比，巰基含量隨溫度的變化幅度較小。但巰基含量的變化對蛋白的聚集有著非常重要的作用。

3 討論

蛋白 濁 度 的 變 化 表 征 蛋 白 聚 集 的 行 為。Haihong 等［11］報道了正常豬肉的肌原纖維蛋白濁度在加熱溫度高于70 ℃時有下降的趨勢。Yongsawat-digul 等［12］也報道了大西洋鱈( Gadus morhua) 的肌原纖維蛋白在加熱溫度高于 50 ℃時濁度降低。這可能是蛋白酶水解蛋白大分子，導致蛋白大分子解體所致。鰱肌原纖維蛋白、小黃魚肌原纖維蛋白和復合肌原纖維蛋白的濁度并無此現(xiàn)象。據文獻報道，較快的蛋白變性速度以及較慢的蛋白聚集速度有利于形成較好的凝膠結構，有利于凝膠強度的提高［13］。加熱溫度在 40 ～55 ℃時，鰱肌原纖維蛋白的濁度變化速率較大即聚集速率較大，這可能是鰱糜凝膠強度較低的一個原因; 同時小黃魚和鰱以1∶ 1復合的肌原纖維蛋白的濁度變化速率較小，而且變化模式和小黃魚肌原纖維蛋白的濁度變化模式相似，即與小黃魚的蛋白聚集模式相似，這可能導致了淡水魚糜和海水魚糜的復合魚糜凝膠強度高于淡水魚糜的凝膠強度。潘錦峰等［9］報道的草魚肌原纖維蛋白的酶活在36 ～42 ℃過程中略有上升，當溫度高于42 ℃時迅速下降。Thazhakot 等［14］在考察南亞野鯪( Labeorohita) 、喀拉鲃( Catla calta) 和印鯪( Cirrhinus mri-gala) 的肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性時報道，酶活在 10～ 40 ℃ 時基本不變。姚磊等［15］報道的鯽肌原纖維蛋白的酶活在 20 ～28 ℃基本不變，28 ～34 ℃緩慢下降。肌原纖維蛋白的 Ca2 +－ ATPase 活性源于肌球蛋白頭部結構，可以表示蛋白的變性程度。在20 ～ 35 ℃ 時鰱肌原纖維蛋白的酶活比鯽，喀拉鲃、南亞野鯪和印鯪 4 種魚的肌原纖維蛋白酶活的下降程度大，即鰱的肌球蛋白頭部在 20 ～ 35 ℃時變性較大。小黃魚肌原纖維蛋白酶活在20 ～30 ℃ 時變化較小。復合肌原纖維蛋白在 20 ～ 35 ℃時，酶活略有上升，與鰱肌原纖維蛋白和小黃魚肌原纖維蛋白的酶活變化不同。復合肌原纖維蛋白的酶活隨著加熱溫度的升高先上升后降低，這可能是因為兩種肌原纖維蛋白聚集或變化引起的暫時性酶活上升所致。對兩種蛋白在加熱過程中的相互作用還應進行更加深入的研究。Wen － Ching 等［16］報道了羅非魚的總巰基含量在 25 ～45 ℃時變化不大，但在55 ～66 ℃時總巰基含量下降，這是由于分子內部二硫鍵形成所致。當加熱溫度達到 75 ℃時，總巰基含量下降，同時有大于肌球蛋白重鏈的分子形成，說明分子間的二硫鍵形成。在加熱溫度高于 65 ℃時，復合肌原纖維蛋白的總巰基含量下降迅速，這可能是形成了分子間二硫鍵。