陳昌福 ▏牛蛙細(xì)菌性疾病的精準(zhǔn)用藥

隨著蛙類養(yǎng)殖業(yè)在我國的一些地方快速興起，危害養(yǎng)殖牛蛙（Rana catesbeiana）的各種病害問題也日漸突出。有研究結(jié)果表明，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖蛙的病害種類較多，如由箭毒蛙壺菌（Batrachochytrium dendrobatidis）引起的真菌性疾病、由虹彩病毒（iridoviuses）引起的病毒性疾病、由米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingia miricola）等致病性細(xì)菌引起的細(xì)菌性疾病以及由泰國肝吸蟲（Opisthorchis viverrini）等各類寄生蟲引起的寄生蟲疾病。除這些由病原性生物引起的生物性疾病外，還有由各種惡劣養(yǎng)殖環(huán)境因素造成養(yǎng)殖蛙類的非生物性病害。

迄今為止，對患病牛蛙生物性疾病的研究結(jié)果證明，細(xì)菌性疾病是危害養(yǎng)殖蛙類的主要生物性病害。目前已經(jīng)報道的能嚴(yán)重危害養(yǎng)殖牛蛙致病性細(xì)菌也有很多種，如腦膜膿毒性黃桿菌（Flavobacterium menigosepticum）可引起牛蛙歪脖子等癥狀；有多種屬于氣單胞菌屬（Aeromonas）致病性細(xì)菌的感染，可引起牛蛙出現(xiàn)紅腿病、敗血癥、腹水病和白內(nèi)障等多種癥狀的疾病。另外，也有研究結(jié)果證明不同種類的致病性細(xì)菌，還可能會導(dǎo)致牛蛙出現(xiàn)非常類似的疾病癥狀，如遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、點狀產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas punctata）、非霍亂弧菌（Noncholera vibrios）等致病性細(xì)菌，均可導(dǎo)致養(yǎng)殖牛蛙出現(xiàn)細(xì)菌性敗血癥（bacterial septicemia）的相似癥狀。

對于牛蛙在內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病，國內(nèi)外的水產(chǎn)動物病害防控研究者以及養(yǎng)殖業(yè)者，大多都是依靠對致病性細(xì)菌具有良好抑菌效果的抗微生物藥物治療。我國的部分水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害研究者，從患病牛蛙體內(nèi)分離致病性細(xì)菌后，也進行過對分離菌株的抗微生物藥物敏感性檢測。因為致病性細(xì)菌對于抗微生物藥物容易產(chǎn)生抗藥性（drug resistance），如果在治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病的過程中，長期濫用某種抗微生物藥物，就會引起致病性細(xì)菌對這種藥物耐藥性的快速產(chǎn)生，最終導(dǎo)致面對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的各種細(xì)菌性疾病而無有效藥物可用的局面。

本研究利用從我國一些牛蛙養(yǎng)殖區(qū)送來的患病牛蛙，在觀察其外觀癥狀的基礎(chǔ)上，從患病牛蛙體內(nèi)分離獲得多株優(yōu)勢菌株，完成了分離菌株對多種抗微生物藥物耐藥性檢測。建議牛蛙養(yǎng)殖業(yè)者選擇適宜的抗微生物藥物，做到精準(zhǔn)用藥，提高了藥物對患病牛蛙的治療效果與成功率。

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材料與方法

1.1 患病牛蛙來源

本研究中大部分患病牛蛙來自安徽省、湖北省、湖南省和廣東省的部分牛蛙養(yǎng)殖場。送檢患病牛蛙均由各地的牛蛙養(yǎng)殖場，通過快遞方式送到實驗室。實驗室人員在收到患病牛蛙后，立即打開包裝檢查患病牛蛙的存活狀態(tài)（圖1）。將在運輸途中已經(jīng)死亡的患病牛蛙剔除，只留下尚未死亡的患病牛蛙做體內(nèi)致病性細(xì)菌分離，并利用純化后的分離菌株完成對抗微生物藥物的藥物敏感性檢測。

圖1通過快遞送到實驗室的存活患病牛蛙狀態(tài)

1.2 患病牛蛙外觀癥狀與寄生蟲檢查

患病牛蛙的外觀癥狀，在依靠肉眼觀察病記錄牛蛙疾病的癥狀，主要有紅腿、潰瘍、白內(nèi)障、腹水和歪頭等外觀典型癥狀（圖2）。

圖2肉眼觀察患病牛蛙疾病的主要外觀癥狀

參照寄生蟲學(xué)檢查方法，用解剖刀從患病牛蛙體表刮取少量黏液，制作水浸片后置于顯微鏡下觀察，以確認(rèn)患病牛蛙體表是否寄生有某些種類的寄生蟲。

1.3 致病性細(xì)菌菌株分離與純化

圖3示從患病蛙體內(nèi)采集細(xì)菌的位置

在無菌條件下解剖患病牛蛙，從其肝臟、腎臟和腦等器官和組織中（圖3）分離致病性細(xì)菌，在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHIA，Difco）平板上作劃線后，將接種后的培養(yǎng)皿置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36~48 h后，從生長出菌落中挑取單個菌落進行純培養(yǎng)，以獲取純化的分離菌株（圖4）。

圖4示從患病牛蛙體內(nèi)分離并純化的分離菌株

先后共分離純化到多個優(yōu)勢菌株，將純化后的分離菌株置于4℃冰箱中保存，供作分離菌株對抗微生物藥物的藥物敏感性檢測。

1.4 供試抗微生物藥物

采用水產(chǎn)用抗微生物藥物（“國標(biāo)漁藥”）作為本試驗的供試藥物。含量為10.0%的復(fù)方磺胺氯達嗪鈉粉、10.0%的延胡索酸泰妙菌素、10.0%的阿莫西林可溶性粉、10.0%的氟苯尼考粉、10.0%的恩諾沙星粉、10.0%鹽酸土霉素可溶性粉、13.0%的金霉素粉、10.0%的硫酸新霉素可溶性粉等8種抗微生物藥物。

1.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定

依日本化學(xué)療法學(xué)會制定的標(biāo)準(zhǔn)法進行。即首先將供試抗微生物藥物用適宜的容媒預(yù)溶后，用滅菌生理鹽水按照上述制劑中抗微生物藥物的含量，分別稀釋至1000~0.25mg/L的２倍稀釋的13個濃度。然后用腦心浸液培養(yǎng)基（BHI，Difco）將各濃度的藥物液稀釋10倍，從而使培養(yǎng)基中的各種藥物的濃度達到100.0~0.025mg/L的２倍稀釋的13個濃度。最后向每支盛有2.9 mL培養(yǎng)基的試管中加入0.1 mL濃度為1.2×10 6cfu/mL活菌液，在28℃條件下連續(xù)培養(yǎng)3d，經(jīng)肉眼觀察證實無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度，即為某種抗微生物藥物對分離菌株的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

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結(jié)果

2.1 分離菌株對各種抗微生物藥物的MIC

本試驗中先后完成了從各地養(yǎng)殖的患病牛蛙體內(nèi)分離并純化的30多個菌株，對8種供試抗微生物藥物的藥物感受性檢測結(jié)果如圖1所示。從圖1所示結(jié)果可以看出，從來自不同地區(qū)養(yǎng)殖患病牛蛙中獲得的分離菌株，對各種抗微生物藥物的MIC是有所不同的。

圖1各種抗微生物藥物對患病牛蛙分離菌株的最小抑菌濃度（MIC）

來自不同地區(qū)養(yǎng)殖患病牛蛙中分離菌株對抗微生物藥物敏感性檢測結(jié)果如表1所示。從表1所示分離菌株對各種抗微生物藥物的MIC存在明顯差異。但是，分離菌株對供試藥物感受性的共同特點是，對復(fù)方磺胺氯達嗪鈉粉和阿莫西林可溶性粉的MIC值最大。而對其它供試藥物存在不同的感受性。

2.2 藥物的投喂與藥物治療效果

根據(jù)各種抗微生物藥物對來自不同地區(qū)患病牛蛙中分離菌株的MIC檢測結(jié)果，選擇用于治療患病牛蛙的抗微生物藥物。根據(jù)從來自安徽省境內(nèi)養(yǎng)殖患病牛蛙中分離的AH001菌株，對恩諾沙星粉的MIC為3.13mg/L，建議牛蛙養(yǎng)殖者選擇恩諾沙星粉作為患病牛蛙的治療藥物，計算每天的用藥量為3.13mg/L×6.3=19.719mg/kg（即按照每公斤牛蛙，每天投喂20.0mg恩諾沙星，因為恩諾沙星粉制劑含量為10.0%，所以需要在每公斤牛蛙飼料中添加200.0mg）。依次類推，計算來自湖南省境內(nèi)養(yǎng)殖患病牛蛙中分離的HN002菌株，對鹽酸土霉素的MIC為3.13mg/L，建議牛蛙養(yǎng)殖者選擇鹽酸土霉素可溶性粉作為患病牛蛙的治療藥物，計算每天的用藥量為3.13mg/L ×6.3=19.719mg/kg（即按照每公斤牛蛙，每天投喂20.0mg鹽酸土霉素，用鹽酸土霉素可溶性粉制劑含量為10.0%，需要在每公斤牛蛙飼料中添加200.0mg）。計算來自湖北省境內(nèi)養(yǎng)殖患病牛蛙中分離的HB003菌株，對恩諾沙星粉的MIC為3.13mg/L，建議牛蛙養(yǎng)殖者選擇恩諾沙星粉作為患病牛蛙的治療藥物，計算每天的用藥量為3.13mg/L ×6.3=19.719mg/kg（即按照每公斤牛蛙，每天投喂20.0mg恩諾沙星，用恩諾沙星粉制劑時需要在每公斤牛蛙飼料中添加200.0mg）。計算來自廣東省境內(nèi)養(yǎng)殖患病牛蛙中分離的GD004菌株，對恩諾沙星粉的MIC為12.5mg/L，建議牛蛙養(yǎng)殖者選擇恩諾沙星粉作為患病牛蛙的治療藥物，計算每天的用藥量為12.5mg/L ×6.3=78.75mg/kg（即按照每公斤牛蛙，每天投喂79.0mg恩諾沙星，用恩諾沙星粉制劑時需要在每公斤牛蛙飼料中添加790.0mg）。

按照上述的檢測結(jié)果、選擇治療患病牛蛙的抗微生物藥物并計算用藥量，指導(dǎo)不同地方牛蛙養(yǎng)殖場選擇相應(yīng)藥物，精準(zhǔn)用藥治療患病牛蛙的疾病，均獲得了理想的藥物治療結(jié)果。

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3.1 患病牛蛙主要外觀癥狀

來自不同地方的患病牛蛙，雖然顯示出疾病不同的外觀癥狀，如有紅腿病、敗血癥、腹水病和白內(nèi)障等疾病外觀典型癥狀。但是，從其患病蛙體內(nèi)分離細(xì)菌菌落特征則有大致相同的均一形態(tài)，說明感染牛蛙并導(dǎo)致其出現(xiàn)疾病典型癥狀的致病性細(xì)菌，可能就是同一種細(xì)菌。

針對從患病牛蛙體內(nèi)分離菌株，完成的對各種抗微生物藥物的藥物敏感性檢測結(jié)果，并且根據(jù)藥物敏感性檢測結(jié)果選擇治療疾病的藥物和計算其用藥量，在養(yǎng)殖現(xiàn)場治療牛蛙疾病過程中，均獲得了良好的藥物治療效果。說明這些分離菌株就是引起這些患病牛蛙出現(xiàn)各種癥狀的“元兇”，同時也證明了我們采用的這種篩選治療藥物的方法和計算用藥量的方法，在養(yǎng)殖現(xiàn)場治療患病牛蛙的疾病是可行的。

3.2 分離菌株抗藥性差異的原因分析

在本次選擇的8種供試藥物中，來自不同地區(qū)患病牛蛙中分離菌株，均對復(fù)方磺胺氯達嗪鈉粉和阿莫西林可溶性粉顯示出不敏感，前者可能是因為分離菌株對磺胺類藥物已經(jīng)產(chǎn)生了較嚴(yán)重的抗藥性，而后者可能是分離菌株屬于革蘭氏陰性菌，對阿莫西林具有先天性耐藥性的緣故。

從不同地方患病牛蛙中獲得的分離菌株對其他幾種抗微生物藥物，均顯示了不同程度的藥物敏感性，可能是因為在不同地方使用各種抗微生物藥物的頻率不同，導(dǎo)致致病性細(xì)菌對各種抗微生物藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性所致。而從不同地方患病牛蛙中獲得的分離菌株，均恩諾沙星粉顯示出較好的藥物敏感性，可能是這種抗微生物藥物不易導(dǎo)致致病新細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的緣故。

(作者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 陳昌福，武漢科研時代生物技術(shù)有限公司 周鑫軍)