論文：養(yǎng)殖大鱗鲃發(fā)病死亡F3個體的微衛(wèi)星標(biāo)記分析

      養(yǎng)殖大鱗鲃發(fā)病死亡F3個體的微衛(wèi)星標(biāo)記分析

常玉梅1，魯翠云1，苗建發(fā)2，李崇文2，梁利群1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司，天津 310500）

采用24個已報道的多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記對天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司養(yǎng)殖的大鱗鲃Barbus capito F2親本及F3成活和病發(fā)死亡個體進行基因分型，結(jié)果有8個標(biāo)記無多態(tài)，13個標(biāo)記用以分析本研究群體的遺傳多樣性、親緣關(guān)系及遺傳結(jié)構(gòu)。遺傳參數(shù)分析顯示，13個標(biāo)記在87個大鱗鲃個體中分別檢測到2～7個等位基因，平均等位基因數(shù)（4.27～4.53）極顯著高于平均有效等位基因數(shù)（3.09～3.22）（P＜0.01）；觀察雜合度（0.58～0.64）整體低于期望雜合度（0.64～0.65），多態(tài)位點比例明顯下降（8/24），表明大鱗鲃F2及F3個體的純合度增加，遺傳多樣性下降。聚類分析顯示，F(xiàn)2親本與成活子代親緣關(guān)系更近，聚在一起；而死亡子代單獨聚為1支。遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，親本與子代清晰地劃分成兩大類群，多數(shù)親本與多數(shù)成活個體歸為第一類群（劃分概率為51.8%～97.7%），少數(shù)親本與多數(shù)死亡個體歸為第二類群（劃分概率為52.9%～98.4%），這與親緣關(guān)系分析的結(jié)果一致，表明少數(shù)親本是F3死亡個體遺傳組成的直接貢獻者。本研究初步認(rèn)定，由于幾個親本的近親交配，子代基因組純合度增加，遺傳多樣性下降，抗逆性下降，這可能是F3出現(xiàn)不明緣由病發(fā)死亡的主要原因之一。

人工養(yǎng)殖大鱗鲃；微衛(wèi)星標(biāo)記；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)；近交衰退

大鱗鲃Barbus capito隸屬于鯉科Cyprinidae，鲃亞科Barbinae，鲃屬，主要分布在咸海（Aral Sea）和里海（Caspian Sea）兩大咸水湖，具有食性廣、生長速度快、肉質(zhì)鮮美、耐鹽堿、適應(yīng)性強等優(yōu)良特點，是湖區(qū)主要的名貴經(jīng)濟魚類之一[1,2]。我國內(nèi)陸蘊藏有豐富的鹽堿水域，但大部分礦化度高，水體離子復(fù)雜等，仍處于荒蕪狀態(tài)。雖有小部分鹽堿水體可被漁業(yè)利用，但適于鹽堿水養(yǎng)殖的種類少，特別缺乏大型經(jīng)濟魚類，其漁業(yè)生產(chǎn)力低下。2003年黑龍江水產(chǎn)研究所首次從烏茲別克斯坦咸海引進大鱗鲃魚種。經(jīng)過十幾年的研究，基本掌握大鱗鲃的全人工繁殖技術(shù)[3]，詳細調(diào)查研究其繁殖生物學(xué)[4,5]、耐鹽堿特性[6-8]、生長和養(yǎng)殖模式[9]、營養(yǎng)需求[10]和藥物毒理[11]等，為大鱗鲃在國內(nèi)的大規(guī)模推廣養(yǎng)殖積累了豐富的科研數(shù)據(jù)。目前，大鱗鲃已成功在肇東、天津、保定和青島等低洼鹽堿水域進行推廣養(yǎng)殖，經(jīng)濟效益可觀，已得到市場認(rèn)可[12]。

然而，由于建群數(shù)量較小，近交衰退的弊端在大鱗鲃養(yǎng)殖過程中逐漸顯現(xiàn)。如后代體色分化，養(yǎng)殖群體F2和F3出現(xiàn)白色和紅色個體，且群體生長速度下降，體色變異個體的生長速度顯著低于未變異個體[13]；病害頻發(fā)，特別是2016年春季天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司養(yǎng)殖的F3個體出現(xiàn)不明原因的大量死亡，死亡個體主要表現(xiàn)為身體極度貧血，造成一定的經(jīng)濟損失。

分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)是解決養(yǎng)殖魚類近交衰退的有效途徑，其中微衛(wèi)星分子標(biāo)記的多態(tài)性高、共顯性分離、操作簡單等優(yōu)勢，是多數(shù)養(yǎng)殖魚類分子標(biāo)記輔助育種的首選標(biāo)記[14]。Geng等[15]利用磁珠富集法克隆大鱗鲃的微衛(wèi)星標(biāo)記，并應(yīng)用在大鱗鲃F1的繁殖中；隨后，魯翠云等[16]利用24個多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記檢測F1的遺傳多樣性，認(rèn)為F1群體的遺傳多樣性處于中度多態(tài)水平，遺傳結(jié)構(gòu)相對平衡。但后續(xù)有關(guān)F2及F3的遺傳多樣性篩查未見相關(guān)報道。本研究針對天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司2016年養(yǎng)殖的大鱗鲃F3病發(fā)死亡、成活個體及其繁殖親本，采用微衛(wèi)星標(biāo)記進行基因分型及數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以檢測F2繁殖子代的遺傳多樣性，探討F3個體病發(fā)死亡的遺傳因素，為大鱗鲃的規(guī)?；庇坝N提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源

實驗魚采自天津市天祥水產(chǎn)有限公司，親本（3齡）20尾，雌雄各10尾（來自黑龍江水產(chǎn)研究所繁殖的F2），子代為天津天祥水產(chǎn)有限公司自繁F3，67尾（2齡），其中不明原因病發(fā)死亡個體34尾，成活個體33尾。

1.2 基因組DNA的提取

剪取少量95%酒精保存的大鱗鲃鰭條至離心管中，加入600μL DNA提取裂解液（成分：1MTris（pH8.0）、5M NaCl、0.5M EDTA（pH8.0）、10%SDS 和200μg/mL Proteinase K）于 55℃消化 2～4h；加入等體積的酚 /氯仿混合液（1∶1）抽提 1次，12 000r/min室溫離心10min，吸取上清（大約550μL）；加入2倍體積的無水乙醇沉淀，12 000r/min室溫離心10min；加入500μL70%酒精洗滌，12 000r/min室溫離心5min；吸凈殘留酒精后，室溫干燥10min，加入50～100μL 0.1×TE溶解。提取后的DNA采用Nanodrop8000測定濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。檢測合格的DNA稀釋至10ng/μL于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

1.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的PCR擴增及檢測

參照魯翠云等[16]報道的序列合成24對微衛(wèi)星引物，對F2親本、F3成活個體和F3死亡個體3組樣品進行PCR擴增。方法均參考魯翠云等[16]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)“魚類種質(zhì)資源遺傳分析平臺（專利號：ZL200710144749.3）”分析軟件，將3組實驗魚的基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成0、1。然后根據(jù)遺傳參數(shù)計算要求轉(zhuǎn)換成PopGene（Version 1.32）軟件識別的數(shù)據(jù)格式。采用PopGene軟件統(tǒng)計3個群體在所有微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因頻率、等位基因數(shù)（N）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀察雜合度（Ho）和期望雜合度（He）等遺傳參數(shù)；同時對每個群體進行哈德－溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡檢驗（PHWE），用 Bonferroni算法進行校正。多態(tài)信息含量（PIC）由Botstein等[17]報道的公式計算。

利用PopGen32軟件計算親本及子代間的Nei’s遺傳距離。使用STRUCTURE（Version 2.3.3）聚類軟件推測群體的遺傳結(jié)構(gòu)，評估親本和死亡子代之間的遺傳結(jié)構(gòu)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記的擴增效果

24對微衛(wèi)星引物，經(jīng)篩選有8對引物無多態(tài)，3對引物存在缺失。將13對引物擴增穩(wěn)定、條帶清晰、呈多態(tài)的擴增結(jié)果用于后續(xù)的遺傳參數(shù)分析。

13個微衛(wèi)星標(biāo)記在87個大鱗鲃個體中均獲得穩(wěn)定、清晰的DNA條帶，在個體間表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性，等位基因數(shù)在2～7個之間，共檢測到57個等位基因（圖1）。

2.2 親本與子代的遺傳參數(shù)分析

親本在13個微衛(wèi)星座位的Ne為1.54（B68）～5.23（B51），平均 3.22；Ho為 0.45（B1）～0.90（B51），平均 0.60；He為 0.36（B26）～0.83（B51），平均 0.65；PIC 為 0.29（B68）～0.78（B51），平均 0.52。死亡個體的 Ne為 1.35（B68）～5.11（B51），平均 3.14；Ho為0.41（B1）～0.88（B51），平均 0.58；He為 0.326（B26）～0.82（B51），平均 0.65；PIC 為 0.22（B68）～0.78（B51），平均 0.51。成活個體的 Ne為 1.44（B1）～5.24（B51），平均 3.09；Ho為 0.21（B37）～0.88（B27），平均0.64；He為 0.31（B1）～0.82（B51），平均 0.64；PIC 為0.28（B1）～0.78（B51），平均 0.50（表 1，表 2）。親本及子代在各遺傳參數(shù)間無顯著差異；但各群體內(nèi)Ne顯著低于 N（P＜0.05），雖然 Ho與 He無顯著差異，但Ho整體低于 He。

各群體Hardy-Weinberg平衡χ2檢驗的無偏估測（PHWE）顯示，親本在 3 個座位（B32、B35、B43）出現(xiàn)遺傳偏離；死亡個體出現(xiàn)偏離座位最多，有7個座位（B1、B20、B26、B32、B37、B43、B58）；成活個體只在 2個座位（B37、B58）出現(xiàn)顯著偏離（P＜0.05）。

表2 親本與子代在所有微衛(wèi)星座位的群體遺傳參數(shù)統(tǒng)計Tab.2 Summary of genetic parameters of parents and offsprings across all microsatellite loci

2.3 親本與子代的親緣關(guān)系分析

親本與子代的遺傳距離和遺傳相似度如表3所示。由表3可知，親本與子代的遺傳距離非常?。?.0234～0.0466），具有很高的遺傳相似性（0.9545～0.9769），說明子代來源于親本，是親本的直系后代。其中，親本與成活個體的遺傳距離最小，相似性最高，說明大部分親本與成活個體的遺傳組成直接相關(guān)，而只有少數(shù)親本對死亡個體具有直接的遺傳貢獻。根據(jù)各群體之間的遺傳距離，利用MEGA6.06軟件，采用UPGMA法對3個群體進行聚類分析，結(jié)果親本和成活個體聚在一起，死亡個體單獨聚為1支（圖2）。

圖1 大鱗鲃部分親本及子代在微衛(wèi)星標(biāo)記B26和B35的擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR products in some parents and their offsprings of barbell at B26 and B35 loci

2.4 親本與子代的遺傳結(jié)構(gòu)分析

STRUCTURE軟件對親本和子代遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示（圖3），當(dāng)群體k＝2時，3個群體清晰地劃分成兩大結(jié)構(gòu)。有14個親本與25個成活個體及6 個死亡個體（29、36、37、39、48、50）劃分到第一類群（劃分概率為51.8%～97.7%）；有 6個親本（7、8、9、10、15、20） 與 28 個死亡個體及 8 個成活個體（61、62、64、65、70、71、74、76）劃分到第二類群（劃分概率為52.9%～98.4%）。

表1 親本與子代在每個微衛(wèi)星座位的遺傳參數(shù)統(tǒng)計Tab.1 Summary of genetic parameters of parents and offsprings at each microsatellite locus

表3 親本與子代的遺傳距離及遺傳相似性指數(shù)Tab.3 Genetic distance and similarities between parents and their offsprings

圖2 親本與子代親緣關(guān)系的NJ聚類圖Fig.2 NJ dendrogram of genetic relationship between parents and their offsprings

3 討論

3.1 人工養(yǎng)殖大鱗鲃F2及F3群體的遺傳多樣性

多種遺傳參數(shù)均可衡量群體的遺傳多樣性，如雜合度、多態(tài)位點比例、等位基因數(shù)等[18]。其中，等位基因數(shù)和雜合度是微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)據(jù)分析中常用的兩種多樣性指標(biāo)。這兩種指標(biāo)表明：本研究采用13個多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記在87個大鱗鲃個體中分別檢測到2～7個等位基因，平均等位基因數(shù)（4.27～4.53）極顯著高于平均有效等位基因數(shù)（3.09～3.22）（P＜0.01），表明人工養(yǎng)殖大鱗鲃 F2及F3等位基因分布不均勻；雖然觀察雜合度（0.58～0.64）整體低于期望雜合度（0.64～0.65），但依據(jù)Botstein等[17]關(guān)于多態(tài)信息含量的劃分標(biāo)準(zhǔn)，大鱗鲃F2及F3群體處于中高度多態(tài)性水平（PIC≥0.50）。然而，遺傳多樣性水平的評估，還需考慮所用標(biāo)記數(shù)量及群體大小。魯翠云等[19]和李歐等[20]通過設(shè)定標(biāo)記和樣本容量梯度，分別探討?zhàn)B殖群體和野生群體遺傳多樣性評估所需的最適樣本量與標(biāo)記量，認(rèn)為標(biāo)記數(shù)量在20～25，樣本量在40～50之間，各遺傳參數(shù)值均趨于穩(wěn)定，能夠客觀地評價一個物種的遺傳多樣性水平。本研究雖然13個標(biāo)記檢測結(jié)果顯示大鱗鲃群體的遺傳多樣性水平較高，但是與魯翠云等[16]報道的多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量相比，多態(tài)位點比例明顯下降（24個標(biāo)記中有8個位點無多態(tài)），說明大鱗鲃F2及F3純合度增加，遺傳多樣性實際呈下降趨勢。

圖3 每個個體分配到群體k的概率Fig.3 Probability of each individual assigned to group k

3.2 人工養(yǎng)殖大鱗鲃F3子代死亡的遺傳因素

與人工養(yǎng)殖大鱗鲃F1相比，F(xiàn)2及F3的遺傳多樣性下降。HWE平衡指數(shù)分析顯示，F(xiàn)3死亡子代有7個座位出現(xiàn)顯著偏離，占總標(biāo)記數(shù)量的53.8%，而雜合子缺失及非隨機交配群體是造成偏離HWE平衡的主要原因[21]。其次，親緣關(guān)系及遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，少數(shù)親本自交（圖2）導(dǎo)致大多數(shù)死亡個體與親本及成活個體的遺傳相似度降低，單獨聚為1支（圖1）。有研究學(xué)者認(rèn)為，群體的遺傳多樣性每喪失10%，就會對其繁育力、存活率、生長等重要性狀產(chǎn)生很大的負(fù)面影響[22,23]。綜合這兩點研究結(jié)果，認(rèn)為，由于幾個親本的近親交配，子代基因組純合度增加，遺傳多樣性和抗逆能力下降，這可能是F3出現(xiàn)不明緣由發(fā)病死亡的主要原因之一。

3.3 人工養(yǎng)殖大鱗鲃的一些建議

大鱗鲃是引進種，經(jīng)過池塘馴化培育至性成熟的親本有限，而實際參與繁殖F1的親魚數(shù)量也很有限[12]。雖然F1的遺傳多樣性較豐富，但由于奠基者效應(yīng)，F(xiàn)1的遺傳組成非常相近，很容易導(dǎo)致近交衰退。本研究數(shù)據(jù)表明：由于累代繁殖大鱗鲃F2及F3的多態(tài)性位點比例下降，基因組純合度增加顯著，遺傳多樣性呈下降趨勢。為避免這種情況加劇，建議對現(xiàn)有繁殖親本及后備親本進行提純復(fù)壯，如利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析繁育親本輔助遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，累代繁殖同樣可以維持較高的雜合度，增強養(yǎng)殖群體的遺傳可塑性[24]；建議在養(yǎng)殖生產(chǎn)中科學(xué)地進行繁殖生產(chǎn)，以規(guī)避更大的經(jīng)濟損失。

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