論文：施氏鱘♀×西伯利亞鱘♂雜交子代胚胎發(fā)育的觀察

      施氏鱘Acipenser schrenckii♀×西伯利亞鱘A.baeri♂雜交子代胚胎發(fā)育的觀察

付佳琪 ，聶竹蘭 ，羅秀華 ，陳哲 ，張永旺

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300；2.新疆伊河鱘業(yè)科技股份有限公司,新疆 鞏留 835400）

施氏鱘Acipenser schrenckii♀×西伯利亞鱘A.baeri♂雜交子代胚胎發(fā)育的觀察

付佳琪1,2，聶竹蘭1，羅秀華1,2，陳哲2，張永旺2

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300；2.新疆伊河鱘業(yè)科技股份有限公司,新疆 鞏留 835400）

對(duì)施氏鱘Acipenser schrenckii♀×西伯利亞鱘A.baeri♂進(jìn)行人工繁殖，觀察雜交子代的胚胎發(fā)育過程。結(jié)果表明，在水溫15～22℃時(shí)，雜交鱘胚胎發(fā)育歷時(shí)141～151 h，所需總積溫為2 608.5～2 793.5℃·h。施氏鱘成熟卵為多黃卵，卵裂呈特殊的輻射裂，受精后胚盤隆起不明顯。根據(jù)對(duì)施氏鱘♀×西伯利亞鱘♂雜交子代胚胎發(fā)育外部形態(tài)及典型特征的觀察，將胚胎發(fā)育分為受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、大小卵黃栓塞期、神經(jīng)胚期、眼囊形成期、心臟形成博動(dòng)期和孵出期9個(gè)時(shí)期。

施氏鱘；西伯利亞鱘；胚胎發(fā)育；積溫

雜交育種是魚類育種的經(jīng)典方法之一，將不同類型的親本雜交后，可獲得具有雙親優(yōu)良性狀的雜種優(yōu)勢(shì)[1,2]。自1558年至今，魚類的雜交育種已成功獲得較多的實(shí)例，如通過大黃魚Pseudosciaena crocea♀與黃姑魚Nibea albiflora♂雜交[3]、鮸魚Miichthys miiuy♀與大黃魚♂雜交[4]、施氏鱘Acipenser schrensckii與達(dá)氏鱘Huso dauricus的雜交等均獲得優(yōu)良的魚類雜交品種[5]。

施氏鱘和西伯利亞鱘Acipenser baerii屬鱘形目 Acipenseriformes、鱘科 Acipenseridae、鱘屬Acipenser[6]。施氏鱘俗稱“七粒浮子”，生長快、抗病力強(qiáng)等，是我國最早開發(fā)利用的黑龍江流域特有鱘土著魚類。西伯利亞鱘俗稱“貝氏鱘”，主要分布于西部的鄂畢河至東部的科雷馬河之間的西伯利亞各河流之中[8]，于上個(gè)世紀(jì)九十年代引進(jìn)我國。近二十年的養(yǎng)殖實(shí)踐證明，西伯利亞鱘苗種易馴養(yǎng)、生長速度快、性成熟早，取得了優(yōu)于其他鱘的養(yǎng)殖效果[9]，成為我國鱘養(yǎng)殖的重要種類之一。近年來，無序雜交導(dǎo)致鱘成活率低、生長速度慢、抗逆性差，養(yǎng)殖性能下降，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。雜交育種是實(shí)現(xiàn)鱘種質(zhì)改良最有效的途徑之一，已經(jīng)成功應(yīng)用于雜交鱘bester及雜交鱘“鱘龍1號(hào)”等培育中。本研究在鱘全人工繁殖的基礎(chǔ)上，觀察了施氏鱘（♀）與西伯利亞鱘（♂）雜交子代的胚胎發(fā)育過程，旨在豐富鱘的基礎(chǔ)生物學(xué)內(nèi)容，為提高鱘的雜交育種技術(shù)和選育出高品質(zhì)的鱘品種提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)用親魚均為16齡，施氏鱘♀3尾（記為1號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)，見表 1），體質(zhì)量為（18.63±2.80）kg；西伯利亞鱘♂1尾，體質(zhì)量為11.60kg；親魚均來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚繁育技術(shù)工程中心。

2016年 5月31日，在水溫（13.56±0.36）℃和溶氧（8.57±0.28）mg/L下，新疆鞏留縣伊河鱘業(yè)股份有限公司采用地歐酮和LRH-A2配比催熟親本。催產(chǎn)后，按壓親魚腹部使卵子進(jìn)入腹腔，再剖開腹腔取出游離卵子，干法人工授精，受精卵經(jīng)滑石粉脫黏后，入瓶式孵化器中在（17.9±5.76）℃下孵化。孵化過程中，隨機(jī)取30粒卵，在雙筒解剖鏡下觀察胚胎發(fā)育過程（囊胚期之前，包括囊胚期，每10min取樣一次；原腸胚到大小卵黃栓塞期每30min取樣一次；神經(jīng)胚期到孵出每60min取樣一次）；60%以上受精卵達(dá)到的發(fā)育期為該期的發(fā)育時(shí)間。胚胎發(fā)育各階段與時(shí)期以解剖鏡觀察后繪圖完成。胚胎發(fā)育各階段的積溫（℃·h）=該階段胚胎發(fā)育時(shí)間（h）×平均水溫（℃）。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氏鱘親魚的體長、體質(zhì)量及受精率

不同體長和體質(zhì)量的施氏鱘♀與西伯利亞鱘♂雜交后代的受精率分別為85.6%、64.3%和75.8%（表 1）。

2.2 雜交鱘胚胎發(fā)育

根據(jù)雜交鱘胚胎發(fā)育順序及形態(tài)特點(diǎn)，并參照其他學(xué)者的工作[10，11]，對(duì)雜交鱘胚胎發(fā)育進(jìn)行分期。受精卵在平均水溫17.9℃下，歷時(shí)151h孵出，整個(gè)發(fā)育過程分為卵及受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、大小卵黃栓塞期、神經(jīng)胚期、眼囊形成期、心臟形成博動(dòng)期和孵出期等9個(gè)時(shí)期。

表1 施氏鱘♀的體長、體質(zhì)量及其與西伯利亞鱘♂雜交的受精率Tab.1 The body length and body weight of female Amur sturgeon and fertilization rate of the eggs in hybrids female Amur sturgeon♀×Siberian sturgeon♂

2.2.1 受精卵

成熟卵呈橢圓形，黑色不透明，具有豐富的卵黃物質(zhì)。成熟卵的原生質(zhì)由動(dòng)物極向植物極逐漸減少，而卵黃則由動(dòng)物極向植物極逐漸增多，色素均勻分布于植物極，動(dòng)物極的原生質(zhì)中央有一大一小2個(gè)色素環(huán)（圖版-1）。經(jīng)干法人工授精后，受精卵遇水膨脹，形成圍卵周隙，受精膜變硬且有彈性。受精3～5min后，卵產(chǎn)生黏性，受精后15min兩極分化，動(dòng)物極在上，植物極在下（圖版-2）。受精后1h，動(dòng)物極出現(xiàn)較低的隆起，形成不明顯的胚盤；動(dòng)物極邊緣出現(xiàn)一條暗棕色帶，此帶隨時(shí)間延長而逐漸加深。

2.2.2 卵裂期

受精后1h40min開始第1次卵裂，為經(jīng)裂。由動(dòng)物極出現(xiàn)一條暗色的線，然后逐漸形成分裂溝，使得受精卵被分割為大小近似的2個(gè)分裂球（圖版-3）。受精后2h30min，開始第2次分裂，也為經(jīng)裂，形成與第1次分割互為垂直的分裂溝，并逐漸加大加深，使受精卵被分割成大小近似的4個(gè)分裂球（圖版-4）。受精后5h進(jìn)行第3次卵裂，同樣為經(jīng)裂，使得受精卵分割成大小不等的8個(gè)分裂球（圖版-5）。這時(shí)第1次形成的分裂溝已在植物極閉合。受精后6h20min開始第4次卵裂，此時(shí)為緯裂，將動(dòng)物極分割成16個(gè)大小不等的分裂球，少數(shù)第2分裂溝已在植物極閉合。受精后7h50min開始第5次卵裂，將胚胎分割成32個(gè)大小不等的分裂球（圖版-6），第2分裂溝已在植物極閉合。本階段歷時(shí)12h。

2.2.3 囊胚期

受精后12h50min胚胎進(jìn)入囊胚早期，分裂球明顯小于卵裂期，相鄰分裂球間界線不明顯，動(dòng)物極的色素變淺（圖版-7）。受精后13h50min胚胎進(jìn)入囊胚中期，分裂球較卵裂期小，但整體仍較大，分裂球之間的間隙顯而易見。與未受精的成熟卵相比，此期植物極色素較深，植物極分裂球大于動(dòng)物極分裂球。受精后16h50min進(jìn)入囊胚后期。此時(shí)分裂球明顯小于囊胚早期和中期，動(dòng)物極分裂球顯著減小，分裂球界線模糊不清，解剖鏡下亦無法區(qū)分。此時(shí)動(dòng)物極的色素環(huán)比未受精成熟卵動(dòng)物極的色素環(huán)淺而明亮。囊胚腔形成，動(dòng)物極處有輕微隆起，具有下包趨勢(shì)，此時(shí)進(jìn)入囊胚晚期。本階段歷時(shí)9h。

2.2.4 原腸胚期

受精后21h50min胚胎進(jìn)入原腸期（圖版-8），動(dòng)物極明顯下包，在赤道附近形成一條短而淺的色素帶，隨著時(shí)間的推延，色素帶在變寬加長的同時(shí)出現(xiàn)內(nèi)陷，內(nèi)陷處出現(xiàn)一個(gè)空腔。胚環(huán)隨著動(dòng)物極細(xì)胞的下包和內(nèi)卷而逐漸明顯，此時(shí)動(dòng)物極約占胚胎的2/3。本階段歷時(shí)16h。

2.2.5 大、小卵黃栓塞期

受精后37h50min胚胎進(jìn)入大卵黃栓塞期（圖版-9）。此時(shí)動(dòng)物極和植物極的色差分化明顯，動(dòng)物極為淡黃色而植物極為深黑色。動(dòng)物極無法辨別細(xì)胞分裂，但植物極分裂球大而明顯，卵黃較大如栓塞狀嵌于胚環(huán)中。受精后43h50min胚胎進(jìn)入小卵黃栓塞期（圖版-10）,淡黃色的動(dòng)物極覆蓋面積越來越大，卵黃栓逐漸變小，但原腸腔仍可見于植物極。本階段歷時(shí)8h。

2.2.6 神經(jīng)胚期

受精后45h50min胚胎進(jìn)入神經(jīng)胚期。卵黃栓逐漸變小消失，出現(xiàn)胚孔，胚孔四周的動(dòng)物極彼此靠近并內(nèi)陷成空隙。胚孔背部出現(xiàn)淺溝，隨時(shí)間延長而膨大，膨大處外周出現(xiàn)神經(jīng)褶，此時(shí)腦部初現(xiàn)雛形。受精后49h，位于胚胎背部的神經(jīng)板似馬蹄形，增厚增長，神經(jīng)板兩側(cè)的神經(jīng)褶可見內(nèi)低外高兩層，稱為寬板神經(jīng)胚期（圖版-11）。內(nèi)層神經(jīng)褶中部出現(xiàn)內(nèi)陷而靠攏，形成排泄系統(tǒng)的原基。受精后54h15min胚胎進(jìn)入神經(jīng)管閉合期，神經(jīng)板兩側(cè)較高的外層神經(jīng)褶閉合，神經(jīng)管不斷加長膨大，肌節(jié)呈直線形，隱約見于胚胎軀體上。本階段歷時(shí)19h。

2.2.7 眼囊形成期

受精后61h30min胚胎進(jìn)入眼囊形成期（圖版-12）。胚胎頭部進(jìn)一步分化,腦部容積較神經(jīng)胚期明顯增大，可見前、中、后三部分。腦的前部?jī)蓚?cè)可見2個(gè)向外突出的眼原基，而腦的中部?jī)蓚?cè)黑色素呈弧狀不斷積累，形成咽弧原基。受精后62h58min，胚胎頭部可見心臟原基，咽弧原基增加至3對(duì)呈新月狀,排泄系統(tǒng)原基前部增厚使胚體隆起突出于球體，尾部則與球體分離，呈棍棒狀。本階段歷時(shí)11h。

2.2.8 心臟形成博動(dòng)期

受精后72h58min胚胎進(jìn)入心臟形成博動(dòng)期（圖版-13）。心臟原基在頭部前下方發(fā)育成短管狀，隨后變形、膨大呈S形；同時(shí)，可見眼突的晶體原基；棍棒狀的尾部也逐漸變窄。受精后76h58min心臟呈波紋狀，微弱博動(dòng)。尾部彎曲增長，約有1/3的胚胎長度突出于球體。胚胎尾部隨時(shí)間而增長，除尾部外不定期地?cái)[動(dòng)，隨時(shí)間延長擺動(dòng)次數(shù)逐漸增加；此期可見胚胎眼晶體及胚體在卵內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)。本階段歷時(shí)19h。

2.2.9 孵出期

受精后91h胚胎進(jìn)入孵出期。棒狀的胚胎尾部變?yōu)楸馄綘睿膊磕┒瞬粩嗯?dòng)接近心臟。受精后92h58min扁平狀的尾部達(dá)到心臟（圖版-14），此時(shí)可見血細(xì)胞在卵黃囊的血管內(nèi)流動(dòng)。受精后117h尾部末端與頭部相遇，尾動(dòng)脈內(nèi)依稀可見血液流動(dòng)（圖版-15），胚胎動(dòng)扭動(dòng)頻率不斷增大。117h30min，尾部末端位于頭上部，超過頭部（圖版-16），胚體轉(zhuǎn)動(dòng)頻率繼續(xù)增大。141h，胚胎孵出，頭部頂端的尾部劇烈擺動(dòng)，出膜后尾部繼續(xù)劇烈擺動(dòng)促使胚體和卵黃囊全部出膜。施氏鱘♀×西伯利亞鱘♂雜交子代由破膜孵出共持續(xù)10h（圖版-17）。

水溫（17.9±5.76）℃時(shí)，雜交鱘從受精至孵化出膜需 141～151h，總積溫為 2 608.5～2 793.5℃·h。

3 討論

3.1 受精卵與卵裂特征

本研究中，雜交鱘的卵徑為3.4～4.5mm，比一般硬骨魚（1.0～1.5mm）大，比鮭鱒（5.0～5.5mm）小[12,13]，與匙吻鱘 Polydon spathula（3.82～4.11mm）[14]相近，比施氏鱘（3.15～3.75mm）[10]和西伯利亞鱘（2.9～3.2mm）[15]的大，比中華鱘 Acipenser sinensis（4.3～4.8mm）[16]小。與其他鱘相似，本研究中雜交鱘受精卵由動(dòng)物極向植物極卵黃逐漸增多，前三次卵裂為經(jīng)裂，第四次為緯裂，動(dòng)物極分裂速度快于植物極，緯裂開始后動(dòng)物極表層為輻射卵裂，這和其他鱘類卵裂相似[10,11,14-19]；動(dòng)物極表層各分裂球的分裂速度相似，類似于硬骨魚類中的盤狀卵裂；而植物極分裂速度較慢，為不均等卵裂，類似于兩棲類[20]。由此可見，本研究中雜交鱘受精卵的卵裂方式較為原始，介于兩棲類與魚類之間。

表2 幾種鱘形目魚類胚胎發(fā)育情況Tab.2 Embryonic development of several members in Acipenseriformes

3.2 胚胎發(fā)育分期

胚胎發(fā)育是指從受精卵至胚胎孵出的整個(gè)過程。該過程中，細(xì)胞增殖的同時(shí)伴隨著細(xì)胞分化，根據(jù)此特點(diǎn)將胚胎發(fā)育分成不同的時(shí)期[21]。不同學(xué)者對(duì)鱘類的胚胎發(fā)育分期不同，中華鱘分為19個(gè)階段[11]，西伯利亞鱘[15]和小體鱘Acipenser ruthenus[18]分為7個(gè)階段34個(gè)時(shí)期，達(dá)氏鰉Huso dauricus分為8個(gè)階段36個(gè)時(shí)期[19]，雜交鱘分為7個(gè)階段27個(gè)時(shí)期[17]，達(dá)氏鱘分為34個(gè)時(shí)期[22]，施氏鱘分為9個(gè)時(shí)期[10]，匙吻鱘分為8個(gè)時(shí)期[14]，本文同意陳靜等[14]對(duì)施氏鱘胚胎發(fā)育的分期方法，雜交鱘胚胎發(fā)育也分為受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、大小卵黃栓塞期、神經(jīng)胚期、眼囊形成期、心臟形成博動(dòng)期和孵出期等9個(gè)時(shí)期。

3.3 胚胎發(fā)育的積溫

胚胎發(fā)育時(shí)間與水溫有關(guān)。鱘正常孵化水溫一般為14～20℃[23]，孵化溫度過高或過低，均引起胚胎發(fā)育停頓、畸形等，影響孵化率和破膜時(shí)間[11,15]。小體鱘孵化水溫（18±1）℃，正常孵化率高達(dá)85%[18]；西伯利亞鱘孵化水溫16.3℃，正常孵化率為80%[15]。本文中雜交鱘的孵化水溫為（17.9±5.76）℃，正常孵出率為55%，明顯低于小體鱘和西伯利亞鱘，這是水溫的晝夜溫差比較大，胚胎發(fā)育畸形率較多所致。雜交鱘胚胎發(fā)育所需積溫為2 608.5～2 793.5 ℃·h，略高于施氏鱘[10]、匙吻鱘[14]、達(dá)氏鱘[22]、中華鱘[16]和山區(qū)全人工繁殖的雜交鱘[17]（表2），其原因與鱘本身及孵化水溫有關(guān)，本文中雜交鱘胚胎發(fā)育處于不穩(wěn)定的水體中，外界因子影響了胚胎的發(fā)育速率和成活率[15,16]。

［1］范兆廷.水產(chǎn)動(dòng)物育種學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005:109-114.

［2］樓允東.魚類育種學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999:83-86.

［3］史會(huì)來,王奮芬,樓寶,等.大黃魚（♀）與黃姑魚（♂）人工雜交子代的胚胎發(fā)育［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志,2011,24(4):16-20.

［4］黃偉卿,張藝,鄭昇陽,等.鮸魚（Miichthys miiuy♀）與大黃魚（Larimichthys crocea♂）雜交子代的胚胎發(fā)育［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志,2014,27(2):46-51.

［5］張穎,曲秋芝,王斌,等.人工養(yǎng)殖下施氏鱘Acipenser schrenckii、達(dá)氏鱘Huso dauricus及其雜交后代的繁殖特性［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志,2016,29(3):25-29,34.

［6］張覺民.黑龍江魚類志［M］.哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社,1995:24-36.

［7］Birstein V J.Sturgeons and paddlefishes:threatened fishes in need of conservation［J］.Conservation Biology,1993,7(4):773-787.

［8］張濤,章龍珍,趙峰,等.西伯利亞鱘不同性別與卵巢發(fā)育時(shí)期血液性類固醇激素的差異與判別分析［J］.海洋漁業(yè),2008,30(1):19-25.

［9］李融.中國鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究［D］.青島:中國海洋大學(xué),2008:6-10.

［10］劉洪柏,賈世杰.施氏鱘的胚胎及胚后發(fā)育研究［J］.中國水產(chǎn)科學(xué),2000,7(3):5-10.

［11］陳細(xì)華.中華鱘胚胎發(fā)育和性腺早期發(fā)育的研究［D］.廣州:中山大學(xué),2004:29-34.

［12］殷名稱.魚類生態(tài)學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995:132-139.

［13］周秋白,吳華東,吳紅翔,等.黃鱔的胚胎及胚后發(fā)育［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2003,27(6):505-512.

［14］陳靜,梁銀銓,胡小建,等.匙吻鱘胚胎發(fā)育的觀察［J］.水利漁業(yè),2008,28(3):34-36.

［15］宋煒,宋佳坤,范純新,等.全人工繁殖西伯利亞鱘的早期胚胎發(fā)育［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2010,34(6):777-785.

［16］唐國盤.中華鱘胚胎發(fā)育和早期生活史階段好氧率的研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

［17］王艷艷,曾圣,杜強(qiáng),等.山區(qū)全人工繁殖雜交鱘胚胎發(fā)育特征觀察［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,55(14):3682-3686.

［18］吳興兵,朱永久,陳建武,等.小體鱘胚胎發(fā)育特征觀察［J］.淡水漁業(yè),2012,42(6):61-67.

［19］郭長江.達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育、仔魚消化系統(tǒng)及幼魚骨骼系統(tǒng)的研究［D］.大連:大連海洋大學(xué),2015.

［20］Zotin A I.The mechanism of cleavage in amphibian and sturgeon eggs［J］.Journal ofEmbryologyand Experimental Morphology,1964,12(2):247-262.

［21］Gisbert E and Williot P.Influence of storage duration of ovulated eggs prior to fertilisation on the early ontogenesis of sterlet (Acipenser ruthenus)and Siberian sturgeon(Acipenser baeri)［J］.International ReviewofHydrobiology,2002,87(5-6):605-612.

［22］四川省長江水產(chǎn)資源調(diào)查組.長江鱘魚類生物學(xué)及人工繁殖研究［C］.成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社,1988:110-113.

［23］Wang Y L,Binkowski F P and Doroshov S I.Effect of temperature on early development of white and lake sturgeon,Acipenser transmontanus and A.fulvescens［J］.Environmental BiologyofFishes,1985,14(1):43-50.

圖版Plate

Embryonic Development of Hybrid F1of Amur Sturgeon Acipenser schrenckii♀×Siberian Sturgeon A.baeri♂

FU jia-qi1,2,NIE Zhu-lan1,LUO Xiu-hua1,2,CHEN Zhe2,ZHANG Yong-wang2
（1.College of Animal Science,Tarim University,Alaer 843300,China;2.Yi River Sturgeon Fishery Ltd,Gongliu 835400,China)