論文：快速鑒定四大家魚(yú)早期資源種類(lèi)的PCR方法

快速鑒定四大家魚(yú)早期資源種類(lèi)的PCR方法

季曉芬1,2，汪登強(qiáng)2，段辛斌2，劉紹平2，陳大慶2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

根據(jù)線(xiàn)粒體控制區(qū)序列設(shè)計(jì)了青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)物種特異的PCR引物，通過(guò)對(duì)四大家魚(yú)受精卵的PCR擴(kuò)增，種間交叉擴(kuò)增，相關(guān)種類(lèi)早期資源的擴(kuò)增以及未知種類(lèi)魚(yú)卵的鑒定發(fā)現(xiàn)，所設(shè)計(jì)的引物具有很高的種類(lèi)特異性，對(duì)特定種DNA具有良好的擴(kuò)增效果，但是不能進(jìn)行交叉擴(kuò)增，對(duì)四大家魚(yú)外的其它種類(lèi)也不能擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)沒(méi)有出現(xiàn)一例假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，說(shuō)明所設(shè)計(jì)引物的種類(lèi)特異性高。該方法特別適合從魚(yú)類(lèi)早期資源大量樣本中準(zhǔn)確快速鑒定四大家魚(yú)種類(lèi)。

四大家魚(yú)；種類(lèi)特異引物；PCR；分子鑒定

青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙 (Aristichthysnobilis)是中國(guó)傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖的“四大家魚(yú)”，具有重要的經(jīng)濟(jì)地位。然而，近三十年來(lái)，由于過(guò)度捕撈、水體污染、涉水工程建設(shè)等原因，四大家魚(yú)自然資源量呈明顯下降趨勢(shì)。在2010—2011年漁業(yè)資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江中游四大家魚(yú)在漁獲物中已不占優(yōu)勢(shì)[1]。對(duì)早期資源監(jiān)測(cè)也發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江中游四大家魚(yú)早期資源量也顯著下降[2]。早期資源監(jiān)測(cè)，特別是四大家魚(yú)早期資源監(jiān)測(cè)是當(dāng)前開(kāi)展?jié)O業(yè)資源管理的基礎(chǔ)性工作，并為各種保護(hù)措施的效果評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的意義。

在魚(yú)類(lèi)繁殖季節(jié)，江河中有多種魚(yú)類(lèi)同時(shí)進(jìn)行繁衍生息，要正確評(píng)估四大家魚(yú)早期資源的變化，需要從魚(yú)類(lèi)早期資源中準(zhǔn)確判斷四大家魚(yú)種類(lèi)。以往對(duì)四大家魚(yú)早期資源的鑒定主要依靠魚(yú)卵卵徑和顏色，或者魚(yú)苗體型和花紋(易伯魯?shù)龋?988)[3]，但是，顏色和花紋并非一成不變，種類(lèi)間也存在重疊特征，要準(zhǔn)確確定不僅需要一定的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也不容易區(qū)分。近年來(lái)也發(fā)展了一些分子生物學(xué)鑒定方法，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)[4]、限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA(RFLP)[5]、DNA條形碼[6]、微衛(wèi)星標(biāo)記[7]以及PCR[8]等。這些方法提供準(zhǔn)確的種類(lèi)鑒定技術(shù)，但要從大量早期資源樣本開(kāi)展鑒定，十分費(fèi)事費(fèi)力，費(fèi)用也很大。本研究在分析群體數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)四大家魚(yú)線(xiàn)粒體DNA控制區(qū)的特異性，分別設(shè)計(jì)一對(duì)物種特異的引物，利用PCR技術(shù)特異擴(kuò)增出四大家魚(yú)的DNA片段，從而能夠快速準(zhǔn)確鑒定出四大家魚(yú)種類(lèi)，為四大家魚(yú)早期資源監(jiān)測(cè)及種類(lèi)鑒定提供一種便捷方法。

1　材料與方法

1.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PCR的原理，我們比較了四大家魚(yú)之間及其與其他相關(guān)魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體DNA控制區(qū)序列，遵循種類(lèi)序列保守、種間差異大的原則，分別設(shè)計(jì)四大家魚(yú)種類(lèi)特異的引物如下(見(jiàn)表1)。這些引物除了鰱和鳙共用一條反向引物HymDR、位于線(xiàn)粒體DNA tRNA-Phe基因外，其余引物均位于控制區(qū)。引物在線(xiàn)粒體DNA的位置參考青魚(yú)線(xiàn)粒體DNA(GenBank登錄號(hào)：EU979305)。

此外，魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體DNA cytb基因通用引物[9]用于擴(kuò)增魚(yú)卵DNA及測(cè)序，進(jìn)行種類(lèi)鑒定。

表1　四大家魚(yú)PCR特異引物信息Tab.1　PCR Specific primers of the four carps

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣本采集

為了驗(yàn)證方法的可靠性，本研究通過(guò)下列4個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行：(1)引物在四大家魚(yú)種內(nèi)擴(kuò)增效率。將4對(duì)引物分別擴(kuò)增相應(yīng)的魚(yú)的樣本。每種樣本收集30粒受精卵，采集4種魚(yú)類(lèi)受精卵各30粒，在2013年5月份四大家魚(yú)繁殖季節(jié)采集于長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所荊州市窯灣繁殖場(chǎng)人工繁殖魚(yú)卵，受精后24 h取樣。(2)引物在四大家魚(yú)種間交叉擴(kuò)增特異性。將上述4對(duì)種特異引物分別擴(kuò)增其它3種四大家魚(yú)的受精卵樣本，樣本來(lái)源與前面相同。(3)引物對(duì)長(zhǎng)江常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)的早期資源擴(kuò)增特異性。共采用27種魚(yú)類(lèi)(表2)，所有樣本均為受精卵或魚(yú)苗，2013—2015年5—7月份取自長(zhǎng)江湖北監(jiān)利江段和重慶江段。所有樣本均預(yù)先用cytb基因通用引物L(fēng)14724 和H15915擴(kuò)增并測(cè)序，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，以99%以上序列相似性為準(zhǔn)，確定其種類(lèi)，每一種各取5個(gè)。(4)對(duì)未知種類(lèi)受精卵的種類(lèi)的鑒定。2014年5—7月份本課題組在長(zhǎng)江湖北省宜都江段開(kāi)展早期資源監(jiān)測(cè)，從收集的受精魚(yú)卵隨機(jī)挑選30粒。以上樣本均在現(xiàn)場(chǎng)作好記錄后，用無(wú)水乙醇保存，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。所有的PCR均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，即采用引物特異的種類(lèi)作模板。

1.3基因組DNA提取及 PCR擴(kuò)增

基因組DNA采用試劑盒Easy-DNA kit(Omega公司，美國(guó))提取。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，含10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL、Taq DNA聚合酶1.5 U、10 mol/L dNTP 0.5 μL、引物10 pmol/L各1 μL、DNA模板1 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。cytb基因擴(kuò)增體系前面相同，擴(kuò)增條件采用56 ℃退火溫度。

表2　四大家魚(yú)及相關(guān)魚(yú)類(lèi)Tab.2　Four major Chinese carps and related fishes

1.4電泳檢測(cè)

采用1×TAE緩沖液(0.04 mol/L Tris-乙酸，2 mmol/L EDTA,pH8.5)配制1%瓊脂糖凝膠，凝膠中加入終濃度約為0.5 μg/mL的溴化乙錠(EB)。取3μL PCR產(chǎn)物與1μL Loading Buffer混合，加入點(diǎn)樣孔， 10 v/cm電泳20 min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察，照相。

1.5DNA測(cè)序與種類(lèi)鑒定

魚(yú)卵cytb基因PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠純化回收目的片段，采用與PCR相同的引物進(jìn)行雙向測(cè)序。與GenBank數(shù)據(jù)上參考序列(序列號(hào)見(jiàn)表2)相似度在99%以上的，即確定為該種類(lèi)。

2　結(jié)果

2.1引物在四大家魚(yú)受精卵中擴(kuò)增效果

本研究設(shè)計(jì)的4組種類(lèi)特異的PCR引物分別擴(kuò)增相應(yīng)的四大家魚(yú)受精卵結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，4組引物分別對(duì)四大家魚(yú)30粒受精卵均能擴(kuò)增出單一、明顯的DNA片段，其中草魚(yú)擴(kuò)增片段大小約為900 bp，青魚(yú)約為750 bp，鰱約為950 bp，鳙約為600 bp，與引物設(shè)計(jì)長(zhǎng)度一致。這表明，本研究所設(shè)計(jì)的引物針對(duì)四大家魚(yú)具有良好的PCR擴(kuò)增效果。

4組種特異引物對(duì)四大家魚(yú)其它3種魚(yú)受精卵

圖1　四大家魚(yú)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　Results of PCR amplication of four major Chinese carps

a.草魚(yú)，b.青魚(yú)，c.鰱，d.鳙，e.青(1-5)、草(6-10)、鰱(11-15)、鳙(16-20)，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)大小從上往下依次為2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp

的PCR結(jié)果顯示，青魚(yú)特異引物均不能擴(kuò)增出草魚(yú)、鰱、鳙的DNA(圖2)，其它引物的擴(kuò)增結(jié)果也類(lèi)似。說(shuō)明，這4組種特異引物不能進(jìn)行交叉擴(kuò)增，具有較高的種特異性。圖2示青魚(yú)特異引物對(duì)其它3種四大家魚(yú)的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2.2引物對(duì)長(zhǎng)江常見(jiàn)27種魚(yú)的PCR結(jié)果

4組引物對(duì)長(zhǎng)江常見(jiàn)的27種魚(yú)受精卵或魚(yú)苗的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中可見(jiàn)，4組引物除了在特定魚(yú)中能擴(kuò)增出特異DNA帶，而在其它魚(yú)類(lèi)中沒(méi)有明顯的擴(kuò)增條帶。例如，引物(I)在青魚(yú)中能擴(kuò)增出一條約750 bp的目的DNA帶外，其它26種魚(yú)中均沒(méi)有DNA條帶(圖3a)。引物(II～I(xiàn)V)的擴(kuò)增結(jié)果也相似。

圖2　引物組I擴(kuò)增四大家魚(yú)結(jié)果Fig.2　Amplification result of the four carps using primer I 從左到右為青(1-5)、草(6-10)、鰱(11-15)、鳙(16-19)

圖3　4種引物與27種魚(yú)的PCR結(jié)果Fig.3　PCR results of four primers for 27 kinds of fishes

a為引物I，b為引物II，c為引物III，d為引物IV，圖中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3對(duì)未知種類(lèi)魚(yú)卵的鑒定

圖4　未知種類(lèi)魚(yú)卵的PCR結(jié)果Fig.4　PCR results of unknown species of fish eggs a為引物組II，b為引物組III

3　討論

本研究根據(jù)線(xiàn)粒體DNA控制區(qū)序列的種類(lèi)差異性，設(shè)計(jì)了4對(duì)四大家魚(yú)種類(lèi)特異的引物，通過(guò)對(duì)較大樣本的特定種類(lèi)PCR擴(kuò)增以及種間交叉擴(kuò)增，結(jié)果顯示，這些引物對(duì)特定種具有良好的擴(kuò)增效果，對(duì)交叉種類(lèi)則完全沒(méi)有擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)沒(méi)有出現(xiàn)一例假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，說(shuō)明所設(shè)計(jì)引物的種類(lèi)特異性高。由于四大家魚(yú)以及相近種類(lèi)在系統(tǒng)進(jìn)化中地位很近，即使是變異率較大的線(xiàn)粒體DNA控制區(qū)序列在這些種類(lèi)間相似性也很高，我們?cè)谠O(shè)計(jì)引物時(shí)，為了提高種類(lèi)特異性，選擇了差異較大的區(qū)域，并保證引物組中一條或兩條引物的3′與特定種完全一致，與其它種盡可能有差異，同時(shí)通過(guò)提高PCR退火溫度來(lái)降低引物錯(cuò)配率。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，達(dá)到預(yù)期的目的。

實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)，PCR技術(shù)是一項(xiàng)十分靈敏的技術(shù)，對(duì)早期資源鑒定，一定要避免DNA樣本交叉污染，否則容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。在野外工作中，收集的早期資源量比較大，各種類(lèi)卵苗經(jīng)常同時(shí)出現(xiàn)，保存時(shí)也常保存在一個(gè)樣本瓶中。因此，在提取DNA時(shí)一定要將樣本外表清洗干凈，由于樣本小，可以將樣本分開(kāi)后用蒸餾水浸泡過(guò)夜，期間換水幾次，減少樣本表面附著的外源DNA。本研究中也發(fā)現(xiàn)疑似外源DNA污染的情況，如圖3d，25號(hào)樣本，盡管經(jīng)DNA測(cè)序確定漢水薄鰍，但電泳中出現(xiàn)很弱的、與鳙目的DNA大小相同的條帶。這也可能是樣本序列變異造成的，但是DNA條帶亮度差異很大，總體上并不影響結(jié)果的判定。

本研究建立的方法很適合應(yīng)用于從早期資源監(jiān)測(cè)收集的大量樣本中快速鑒定出四大家魚(yú)種類(lèi)，也可用于外部形態(tài)不完整的組織塊等鑒定。由于長(zhǎng)江等河流還有很多種魚(yú)類(lèi)，今后還需采集更多種類(lèi)的魚(yú)進(jìn)一步驗(yàn)證引物的特異性。此外，這4組引物擴(kuò)增得片段大小有差異，所以通過(guò)優(yōu)化PCR條件，開(kāi)展多重PCR，可以更快更好的完成種類(lèi)鑒定。

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