論文：鰱鳙放養(yǎng)對(duì)水體微生物碳源利用影響的圍隔試驗(yàn)

鰱鳙放養(yǎng)對(duì)水體微生物碳源利用影響的圍隔試驗(yàn)

劉其根，孫 宇，趙良杰，吳杰洋，張 真，胡忠軍

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海， 201306)

利用Biolog技術(shù)就滆湖原位圍隔內(nèi)鰱鳙放養(yǎng)密度和比例對(duì)水體微生物碳源利用的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，在試驗(yàn)階段后期不同圍隔內(nèi)水體微生物對(duì)碳源總量的利用相對(duì)于試驗(yàn)中期有較明顯的變化。未放養(yǎng)鰱鳙的對(duì)照組(A0)在試驗(yàn)后期對(duì)于碳源總量的利用低于各實(shí)驗(yàn)組(A1：魚(yú)密度40 g/m3、鰱鳙比7∶3；A2∶40 g/m3、3∶7、A3∶80 g/m3、7∶3和A4∶80 g/m3、3∶7)。試驗(yàn)中期和后期，利用比例較高的碳源類(lèi)型均為聚合物。主成分分析表明，試驗(yàn)后期不同圍隔水體微生物群落碳代謝方式具有顯著差異。其中，與主成分1顯著相關(guān)的碳源主要有16種，分別屬于聚合物、糖類(lèi)、羧酸、氨基酸。實(shí)驗(yàn)中期和后期圍隔水體微生物碳代謝多樣性指數(shù)Shannon物種多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均存在顯著差異,代謝多樣性指數(shù)最高的是實(shí)驗(yàn)組A1，實(shí)驗(yàn)組A4碳代謝多樣性指數(shù)相對(duì)較低。根據(jù)鳙的絕對(duì)生物量、多樣性指標(biāo)以及對(duì)碳源的總量利用，可以得出以鰱鳙主導(dǎo)的微型生態(tài)系統(tǒng)中，鳙的絕對(duì)生物量對(duì)于水體微生物影響更加顯著。

鰱鳙；圍隔；微生物群落；功能多樣性；Biolog

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，對(duì)環(huán)境的污染也在持續(xù)增加，大量的工業(yè)廢水和生活污水排入湖泊，導(dǎo)致內(nèi)陸湖泊嚴(yán)重的富營(yíng)養(yǎng)化，進(jìn)而造成藍(lán)藻水華，對(duì)湖泊生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能造成了不同程度的破壞。國(guó)內(nèi)外，經(jīng)典和非經(jīng)典生物操縱技術(shù)常被用于富營(yíng)養(yǎng)化湖泊過(guò)度增殖藻類(lèi)的控制[1]。在國(guó)內(nèi)，非經(jīng)典生物操縱主要是通過(guò)放養(yǎng)濾食性魚(yú)類(lèi)鰱和鳙試圖控制藍(lán)藻水華[2]。鰱鳙將攝食的藻類(lèi)轉(zhuǎn)變成魚(yú)體生物量，可有效地降低水體有機(jī)物的含量，從而達(dá)到改善水質(zhì)的目的[3]。不同的湖泊由于其富營(yíng)養(yǎng)化程度的差異，湖泊水文學(xué)、熱力學(xué)狀況以及魚(yú)類(lèi)群落結(jié)構(gòu)的不同，鰱、鳙放養(yǎng)后的凈化效果也不同，因此為達(dá)到其最佳生態(tài)效益，需要研究合理的鰱鳙比例和密度。目前該方面大部分的實(shí)驗(yàn)研究主要停留在鰱鳙放養(yǎng)對(duì)水體理化指標(biāo)和浮游生物的影響上，而針對(duì)它們對(duì)微生物多樣性影響方面的研究少見(jiàn)。

微生物在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起著關(guān)鍵性作用，微生物的分解能力尤其重要，其中包括轉(zhuǎn)化有機(jī)質(zhì)、腐殖化、降解污染物等功能，微生物群落多樣性對(duì)維持生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用[4-5]；研究人為放養(yǎng)濾食性魚(yú)類(lèi)是否會(huì)對(duì)水體中的微生物群落多樣性產(chǎn)生影響，不僅有助于了解微生物的生命特征和環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，而且在治理湖泊富營(yíng)養(yǎng)化方面具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

Biolog技術(shù)是目前研究微生物功能多樣性的常用方法，是由美國(guó)的BIOLOG公司于1989年開(kāi)發(fā)成功，原理是微生物在利用碳源過(guò)程中產(chǎn)生的自由電子，與四唑鹽染料發(fā)生還原顯色反應(yīng)，顏色的深淺可以反映微生物對(duì)碳源的利用程度。由于微生物對(duì)不同碳源的利用能力很大程度上取決于微生物的種類(lèi)和固有性質(zhì)，因此在一塊微平板上同時(shí)測(cè)定微生物對(duì)不同單一碳源的利用能力，就可以鑒定純種微生物或比較分析不同的微生物群落。這對(duì)于明確不同環(huán)境中微生物群落的作用具有重要意義[6-8]。本實(shí)驗(yàn)利用微生物的代謝活性來(lái)研究鰱、鳙不同放養(yǎng)比例和密度對(duì)水體中微生物碳源利用的影響[9-10]，以期為滆湖鰱鳙合理放養(yǎng)及為評(píng)價(jià)鰱鳙放養(yǎng)對(duì)水體的影響及認(rèn)識(shí)其機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)在江蘇省滆湖北部湖區(qū)搭建的圍隔內(nèi)進(jìn)行(圖1)，北湖水域面積為15.9 km2，該湖區(qū)實(shí)施了疏浚工程，平均水深為3～4 m。實(shí)驗(yàn)圍隔用高5 m×寬4 m×長(zhǎng)6 m的PVC防水帆布制成，面積為24 m2，四邊用若干毛竹固定，帆布上端與泡沫浮子(d1=30 cm)相連，底部與石龍(d2=15 cm)相連，圍隔內(nèi)套有大小相同的網(wǎng)箱，網(wǎng)眼為2 cm。實(shí)驗(yàn)用鰱鳙購(gòu)于上海市崇明縣水產(chǎn)良種場(chǎng)，魚(yú)種體長(zhǎng)14.5～16.2 cm，體重57.6～81.6 g。

圖1 滆湖圍隔樣點(diǎn)圖Fig.1 Site of enclosures in Gehu Lake

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

滆湖臺(tái)風(fēng)一般出現(xiàn)在6-7月，且這兩個(gè)月雨量較大，影響圍隔的穩(wěn)固性，另一方面滆湖的浮游植物在秋季(10月)有一個(gè)全年密度和生物量的高峰或次高峰[11]，因此把試驗(yàn)時(shí)間安排在2014年8月15日～2014年11月1日，共88 d。設(shè)置5個(gè)處理，包括無(wú)魚(yú)空白對(duì)照處理(表1)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)期間不投喂任何餌料。

表1試驗(yàn)圍隔鰱鳙放養(yǎng)比例和密度Tab.1 The stocking density and proportion of Chinese silver carp and bighead carp in experimental enclosures

1.3 樣品采集與微生物群落功能多樣性測(cè)定

在試驗(yàn)中期(2014年9月15日)和后期(2014年10月15日)用采水器在圍隔的對(duì)角位置采集表層和中層水樣，混合后裝入已滅菌的塑料瓶中，將水樣瓶放入低溫保存箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，待測(cè)分析。

利用含有31種碳源底物的Biolog-Eco板(BiologInc，USA)研究分析微生物群落的功能多樣性。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將水樣樣品靜置10 min后，分別取150 μL水樣接種至ECO板的每一個(gè)孔中，對(duì)照孔中加入150 μL的無(wú)菌水；將接種好的ECO板恒溫(25℃)避光培養(yǎng)，并于0、24、48、72、96、120、144、168 h利用Biolog微生物全自動(dòng)分析儀分別在590 nm和750 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值[12-13]。6大類(lèi)碳源的相對(duì)利用率等于某一類(lèi)碳源AWCD的均值占6大類(lèi)碳源總AWCD的百分比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 微生物群落代謝活性

觀察各圍隔水體微生物利用ECO板上全部碳源的AWCD可知(圖2)，微生物利用碳源的總量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增加趨勢(shì)，微生物群落AWCD值均在24 h后開(kāi)始出現(xiàn)速率分化，中期開(kāi)始時(shí)的分化速率要快于后期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，后期微生物分化速率明顯快于中期，曲線較中期更加陡峭(圖2、圖3)。試驗(yàn)中期不同圍隔的AWCD規(guī)律并不明顯，各實(shí)驗(yàn)組之間，以及與對(duì)照組之間沒(méi)有呈現(xiàn)出一定的變化，并且曲線波動(dòng)性較大，從整體趨勢(shì)看，代謝活性從高到底依次排列為：A1>A4>A0>A3>A2(圖2)；試驗(yàn)后期各個(gè)圍隔的AWCD規(guī)律較為明顯，對(duì)照組明顯與其他實(shí)驗(yàn)組區(qū)分，且在72 h以后對(duì)照組AWCD處于最低水平。實(shí)驗(yàn)后期AWCD變化曲線更加平滑，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上微生物代謝活性高低排列基本為：A1>A3>A2>A4>A0(圖3)。

圖2 試驗(yàn)中期不同圍隔微生物群落AWCD值變化Fig. 2 Variations of average well color development(AWCD) for microbial community in enclosures over time in the middle phase of experiment

圖3 試驗(yàn)后期不同圍隔微生物群落AWCD值變化Fig. 3 Variations of average well color development(AWCD) for microbial community in enclosures over time in the last phase of experiment

2.2 微生物碳源代謝多樣性

試驗(yàn)中期和后期不同處理圍隔間代謝多樣性存在顯著的差異(P<0.05)，中、后期不同圍隔間三種指數(shù)高低趨勢(shì)較為一致，均為A1最高，A4最低，且差異顯著(P<0.05)。中后期比較而言，中期豐富度指數(shù)(S)高于后期，而多樣性(H′)和均勻度(J)均低于后期。中、后期不同圍隔間豐富度(S)、多樣性(H′)和均勻度(J)大小排列分別為：A1>A0>A2>A3>A4、A1>A3>A2>A0>A4、A1>A3>A2>A0>A4，A1>A3>A2>A0>A4、A1>A2>A3>A0>A4、A1>A3>A2>A0>A4。

表2 試驗(yàn)中期微生物群落碳源代謝多樣性指數(shù)處理間比較Tab.2 Comparison on diversity indices of carbon resources catabolism of microbial community among different stocking treatments in the middle phase of experiment

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)(偏)差，n=3；不同字母代表差異顯著，P<0.05。表3同。

表3 試驗(yàn)后期微生物群落碳源利用多樣性試驗(yàn)處理間比較Tab.3 Comparison on diversity indices of carbon resources utilization of microbial community among different stocking treatments in the last phase of experiment

2.3 微生物群落對(duì)不同類(lèi)型碳源的利用

Biolog-Eco板不同種類(lèi)的碳源有31種，分為6大類(lèi)，包括糖類(lèi)10種，羧酸類(lèi)7種，氨基酸類(lèi)6 種，聚合物類(lèi)4種，酚類(lèi)、胺類(lèi)各2種[16]。中、后期不同圍隔水體微生物均對(duì)聚合物類(lèi)利用率最高，且占比例在增加，由23.45%上升至28.62%；中期所有圍隔對(duì)于其它碳源的利用率低于聚合物類(lèi)的有氨基酸類(lèi)(18.83%)、胺類(lèi)(16.14%)、糖類(lèi)(14.52%)、酚類(lèi)(14.29%)，對(duì)羧酸類(lèi)(12.77%)的利用率最低。后期所有圍隔對(duì)碳源利用率低于聚合物類(lèi)的有糖類(lèi)(17.67%)、氨類(lèi)(17.08%)和胺類(lèi)(15.49%)，對(duì)羧酸類(lèi)(11.10%)和酚類(lèi)(10.04%)利用率最低。在實(shí)驗(yàn)后期，不同圍隔間水體微生物對(duì)于羧酸類(lèi)的利用存在顯著差異(P<0.05)。除此之外，實(shí)驗(yàn)中后期不同處理間水體微生物對(duì)各種碳源的利用無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖3 試驗(yàn)中期微生物群落對(duì)6類(lèi)碳源的相對(duì)利用率Fig.3 Relative use efficiency of 6 kinds of carbon sources by microbial community of different treatmens in the middle phase of experiment

圖4 試驗(yàn)后期微生物群落對(duì)6類(lèi)碳源的相對(duì)利用率Fig.4 Relative use efficiency of carbon sources by microbial community of different treatmens in the last phase of experiment

2.4 主成份分析

從微生物群落對(duì)31種碳源利用的主成份分析結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組(A1、A2、A3和A4)間微生物群落碳源利用方式實(shí)驗(yàn)中期(圖5)差異并不十分顯著，大致可分為三組，即試驗(yàn)組A1和A2為一組，試驗(yàn)組A3和A4為一組，對(duì)照組A0明顯與其他實(shí)驗(yàn)組區(qū)分。實(shí)驗(yàn)后期(圖6)差異顯著(P<0.05)，可以分為A1、A2和A3為一組，實(shí)驗(yàn)組A4單獨(dú)為一組，對(duì)照組A0仍與其他實(shí)驗(yàn)組顯著區(qū)分。主成分得分系數(shù)方差分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅實(shí)驗(yàn)后期水體微生物主成分1和主成分2得分系數(shù)存在顯著差異(P<0.05)。水體微生物PC1得分系數(shù)差異表現(xiàn)在：A0組、A4組與A1、A2、A3組之間有顯著差異，PC2得分系數(shù)差異表現(xiàn)在：A4組，A0組，A1、A2、A3組三者之間有顯著差異(圖6)。

圖5 試驗(yàn)中期不同圍隔間微生物碳源利用類(lèi)型的主成分分析Fig.5 Principal components analysis (PCA) of variations of carbon utilization profiles of microbial communities in enclosure sites in the middle phase of experiment

圖6 試驗(yàn)后期不同圍隔間微生物碳源利用類(lèi)型的主成分分析Fig.6 Principal components analysis (PCA) of variations of carbon utilization profiles of microbial communities in enclosure sites in the last phase of experiment

與試驗(yàn)后期主成分1、2具有較高相關(guān)系數(shù)(|r|>0.6)的碳源見(jiàn)表4，對(duì)PC1起主要作用的碳源主要有16種，分別屬于聚合物(3種)、糖類(lèi)(4種)、羧酸(5種)、氨基酸(4種)，說(shuō)明有16種碳源使水體微生物群落碳代謝功能多樣性在PC1上差異顯著(P<0.05)；對(duì)PC2起主要作用的碳源主要有6種，分別屬于聚合物(1種)、糖類(lèi)(3種)、羧酸(1種)、氨基酸(1種)，說(shuō)明有6種碳源使水體微生物群落碳代謝功能多樣性在PC2上差異顯著(P<0.05)。

表4 試驗(yàn)后期與主成分1、2顯著相關(guān)的主要碳源(取│r│>0.6)Tab.4 The main carbon source significantly correlated with PC1 and PC2 in PCA in the last phase of experiment

續(xù)表1

3 討論

本研究以Biolog技術(shù)為手段[17-19]，對(duì)滆湖原位圍隔不同鰱鳙放養(yǎng)密度內(nèi)水體微生物碳源利用的變化進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)后期，圍隔微生物對(duì)碳源總量的利用規(guī)律明顯。即隨著鰱鳙放養(yǎng)量的增加圍隔微生物代謝活性逐步降低，對(duì)照組明顯與其他實(shí)驗(yàn)組區(qū)分，并且在72 h后對(duì)照組代謝活性處于最低水平。這說(shuō)明鰱鳙的放養(yǎng)確實(shí)能夠影響水體微生物對(duì)碳源的利用[20]。微生物群落多樣性的指數(shù)是反映物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，其變化能夠準(zhǔn)確反映群落功能多樣性總體的動(dòng)態(tài)變化[21]。在本研究中，當(dāng)把鰱和鳙的絕對(duì)生物量進(jìn)行分開(kāi)比較時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)鳙的絕對(duì)生物量與各多樣性指數(shù)呈現(xiàn)近似的變化趨勢(shì)，即隨著鳙的絕對(duì)生物量增加，各多樣性指數(shù)基本呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。然而鰱的絕對(duì)生物量沒(méi)有呈現(xiàn)出這種關(guān)聯(lián)。表5是鰱、鳙絕對(duì)生物量在不同時(shí)期與各個(gè)多樣性指數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)。從表5我們可知，鰱的絕對(duì)生物量在試驗(yàn)中期和后期與各個(gè)多樣性指數(shù)并沒(méi)有顯著相關(guān)。但是，鳙的絕對(duì)生物量在試驗(yàn)中期和后期與各個(gè)多樣性指數(shù)之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)。結(jié)合表2和表3，鳙的絕對(duì)生物量和各個(gè)多樣性指數(shù)總體上呈現(xiàn)出一定規(guī)律，但是豐富度中期鳙絕對(duì)生物量為24和28 g/m3以及多樣性后期鳙絕對(duì)生物量為24和28 g/m3時(shí)，并沒(méi)有十分嚴(yán)格的下降趨勢(shì)，這可能是由于鳙的絕對(duì)生物量十分接近，圍隔微型生態(tài)系統(tǒng)與放養(yǎng)對(duì)象的密度有直接的關(guān)聯(lián)[1]，加之本實(shí)驗(yàn)為滆湖原位圍隔實(shí)驗(yàn)操作難度較大，不可控因素較多。

表5 鰱、鳙絕對(duì)生物量在不同試驗(yàn)階段與各個(gè)多樣性指數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)Tab.5 Correlation coefficient between the absolute biomass of bighead and silver carp and diversity indices in different phase of experiment

Biolog 的主成分分析是反映微生物群落功能結(jié)構(gòu)特征的有效手段[22]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)31種碳源利用的主成分分析發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)后期不同圍隔水體微生物群落碳源利用方式存在顯著不同。在四個(gè)實(shí)驗(yàn)組當(dāng)中，A4實(shí)驗(yàn)組明顯與其他實(shí)驗(yàn)組區(qū)分開(kāi)，觀察不同碳源利用率的柱狀圖，也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組A4的酚類(lèi)和羧酸類(lèi)相對(duì)利用率在四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中是最低的，而聚合物和糖類(lèi)是這四個(gè)組中是最高的。考慮到A4中鳙魚(yú)的絕對(duì)生物是56 g/m3(其他三組分別為A1∶12 g/m3, A2∶28 g/m3, A3∶24 g/m3)，可以推測(cè)，在以鰱鳙主導(dǎo)的微型生態(tài)系統(tǒng)中，鳙的絕對(duì)生物量可能對(duì)微生物功能多樣性有著更加明顯的影響。造成這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)橄鄬?duì)于滆湖大環(huán)境，小型圍隔系統(tǒng)較封閉，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，加之鳙腸道內(nèi)菌群對(duì)于水體微生物影響較大[23]。

綜上所述，適當(dāng)放養(yǎng)鰱鳙可以促進(jìn)水體微生物代謝活性和多樣性，并且在微型生態(tài)系統(tǒng)中，鳙對(duì)于水體微生物影響更明顯。但由于本試驗(yàn)周期較短，加之微生物群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性的復(fù)雜性，以及Biolog方法本身存在一定的局限性[17]，想要更加全面地揭示微生物的生態(tài)功能和鰱鳙對(duì)于水體微生物的影響，還需要結(jié)合其他的研究手段來(lái)進(jìn)一步研究。

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