方斑東風(fēng)螺“翻背癥”的病原及初步治療研究

方斑東風(fēng)螺“翻背癥”的病原及初步治療研究

趙 旺1,2，吳開(kāi)暢1,2，王江勇1,2，凌 慧1,2，楊 蕊3，岑小勇4，葉 樂(lè)1,2

( 1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，海南 三亞 572018；2. 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；3. 三亞意源養(yǎng)殖有限公司，海南 三亞 572000； 4. 萬(wàn)寧市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，海南 萬(wàn)寧 571500 )

對(duì)海南發(fā)生“翻背癥”的方斑東風(fēng)螺進(jìn)行了病原分離、鑒定，藥敏分析及藥物治療試驗(yàn)。結(jié)果顯示，病原為哈維弧菌，該菌對(duì)喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物敏感，對(duì)青霉素、阿莫西林等耐藥；藥物治療結(jié)果顯示，試驗(yàn)組諾氟沙星、復(fù)方磺胺甲惡唑、苯扎溴銨及對(duì)照組的最終存活率分別為39.05%、32.38%、29.52%和14.29%，諾氟沙星的治療效果較好，可用于治療方斑東風(fēng)螺“翻背癥”。

方斑東風(fēng)螺；翻背癥；哈維弧菌；藥物治療

方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)屬腹足綱、腹足目、蛾螺科、東風(fēng)螺屬，在中國(guó)主要分布于福建、廣東、廣西和海南等地。東風(fēng)螺肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是中國(guó)東南沿海重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類(lèi)。隨著東風(fēng)螺養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，各種爆發(fā)性病害頻發(fā)，已威脅到東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前已報(bào)道的主要病原有：有害寄生性動(dòng)物[1-3]、細(xì)菌[4-6]和其他病原[7-8]，其中細(xì)菌性病害最為常見(jiàn)。近年來(lái)海南多個(gè)東風(fēng)螺養(yǎng)殖場(chǎng)陸續(xù)爆發(fā)的“翻背癥”(亦稱(chēng)“急性死亡癥”)，該病癥狀與“腫吻癥”類(lèi)似，發(fā)病時(shí)東風(fēng)螺活力很差，螺體仰翻于沙面上，不能鉆沙；腹足表面積累較多黑色雜質(zhì)，足肌邊緣收縮內(nèi)卷呈波紋狀，足部全伸或半伸出螺殼，用物刺激僅能部分縮回殼中；與腫吻癥明顯不同的是病螺吻管并無(wú)水腫、伸出等病癥；該病發(fā)病快，初期少量螺表現(xiàn)出該癥狀后2～3 d迅速爆發(fā)至全池甚至全養(yǎng)殖場(chǎng)，且其死亡率可達(dá)80%以上。目前，東風(fēng)螺細(xì)菌性病害治療，多為病原對(duì)藥物的敏感性分析[9-10]，進(jìn)一步治療效果的報(bào)道較少。筆者對(duì)方斑東風(fēng)螺“翻背癥”的病原進(jìn)行了分離與鑒定，針對(duì)生產(chǎn)上養(yǎng)殖戶(hù)習(xí)慣使用化學(xué)消毒劑和抗生素甚至是水產(chǎn)禁用藥物治療東風(fēng)螺疾病的現(xiàn)象，探索了幾種水產(chǎn)常用藥物的治療效果，以期為東風(fēng)螺“翻背癥”的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用螺：患病方斑東風(fēng)螺采于海南省萬(wàn)寧某東風(fēng)螺養(yǎng)殖場(chǎng)，為發(fā)生“翻背癥”初期的稚螺，單粒體質(zhì)量(1.35±0.49) g。感染用螺取自海南省三亞市某東風(fēng)螺養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)期間狀態(tài)良好，單粒體質(zhì)量(1.31±0.45) g。

主要試驗(yàn)藥物與試劑：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，藥敏分析紙片(杭州天和微生物試劑有限公司)，Bacterial DNA kit(Omega公司)，PCR反應(yīng)套裝(Takara公司)；根據(jù)病原藥敏分析結(jié)果及養(yǎng)殖戶(hù)用藥習(xí)慣選取的治療藥物：復(fù)方磺胺甲惡唑(廣東臺(tái)城制藥股份有限公司)、呋喃西林(南昌白云藥業(yè)有限公司)、苯扎溴銨(廣州精博生物技術(shù)有限公司)和諾氟沙星(廣州精博生物技術(shù)有限公司)。

試驗(yàn)用暫養(yǎng)容器為聚乙烯框(68 cm×42 cm×18 cm)，框底鋪厚3 cm、粒徑1～3 mm的消毒河沙，試驗(yàn)用沙濾海水。

1.2 優(yōu)勢(shì)菌的分離培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，取發(fā)病初期癥狀典型病螺的足肌、鰓、外套膜、內(nèi)臟等組織勻漿，無(wú)菌生理鹽水稀釋涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，分離純化形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落，供人工感染與鑒定。

1.3 人工感染

將純培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，28 ℃培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水洗脫菌苔制成菌懸液，平板培養(yǎng)法測(cè)定活菌密度；將菌液10倍梯度連續(xù)稀釋后，對(duì)健康東風(fēng)螺進(jìn)行肌肉注射，每個(gè)菌液梯度注射2組，每組10粒，每粒菌液劑量0.1 mL，另設(shè)對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水。人工感染后記錄螺死亡情況，連續(xù)記錄7 d。采用 Karber 法計(jì)算菌株的半數(shù)致死劑量(LD50)[11]。整個(gè)試驗(yàn)期間，水溫(28±1) ℃，鹽度30±1，pH 8.0±0.2，溶解氧>6 mg/L。

1.4 病原菌的16 S rDNA鑒定

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌的總DNA，以總DNA 為模板，用細(xì)菌通用引物對(duì)8F/1492R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。PCR反應(yīng)產(chǎn)物由Invitrogen公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已報(bào)道的序列進(jìn)行相似性比較，確定該病原菌的種屬。

1.5 藥敏分析

采用藥敏紙片法進(jìn)行，將不同藥物的藥敏紙片貼于涂滿(mǎn)病原菌的平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h后記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑，并根據(jù)藥敏紙片抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏性。

1.6 藥物治療試驗(yàn)

取“翻背癥”初期具明顯癥狀的東風(fēng)螺1批隨機(jī)分配到試驗(yàn)框中，每框放置35 粒。每種藥物設(shè)3個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)平行，每日藥浴約18 h，流水6 h，不投餌料。試驗(yàn)組復(fù)方磺胺甲惡唑質(zhì)量濃度分別為2、4 mg/L和6 mg/L；苯扎溴銨質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2 mg/L和0.3 mg/L；諾氟沙星質(zhì)量濃度分別為1、2 mg/L和3 mg/L；呋喃西林質(zhì)量濃度分別為3、6 mg/L和9 mg/L；另設(shè)對(duì)照。每日檢查并記錄死亡情況，刺激無(wú)反應(yīng)即判斷為死亡。

根據(jù)每日各試驗(yàn)組的死亡情況計(jì)算每日存活率：

存活率/%=(試驗(yàn)螺總數(shù)-死亡螺總數(shù))/試驗(yàn)螺總數(shù)×100%

用SPSS 19.0對(duì)各試驗(yàn)組的最終存活率進(jìn)行分析，用F檢驗(yàn)差異顯著性，LSD法進(jìn)行多重比較。整個(gè)試驗(yàn)期間海水溶解氧7～8 mg/L，水溫27～28.5 ℃，pH 8.0±0.1，鹽度28～33，試驗(yàn)周期17 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 翻背癥病螺癥狀

正常螺晝伏夜出，白天很少在沙面上活動(dòng)；螺體背腹面顛倒后能通過(guò)足肌旋轉(zhuǎn)迅速翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)(圖1a)?！胺嘲Y”病螺活力很差，體表黏液減少；背腹面顛倒，殼口朝上，不能自行翻轉(zhuǎn)；足肌伸縮無(wú)力，對(duì)刺激不敏感；足部邊緣收縮呈波紋狀，部分病螺腹足因表面積累異物呈黑色(圖1b)。人工感染后，健康螺表現(xiàn)出與“翻背癥”相同癥狀(圖1c)。

圖1 方斑東風(fēng)螺a.正常螺；b. “翻背癥”螺；c. 人工感染螺.

2.2 優(yōu)勢(shì)菌的分離

將“翻背癥”方斑東風(fēng)螺組織勻漿液稀釋涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基和硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上，分別分離到3株優(yōu)勢(shì)菌F1、F2和F3，其中F1含量占平板總細(xì)菌量的85%，F(xiàn)2為80%，F(xiàn)3超過(guò)80%；這3株菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上表現(xiàn)出相同的特點(diǎn)：淡黃色、圓形、不透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)、直徑2～3 mm，在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)灰白色、圓形、不透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)、直徑1.5～3 mm，在硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖培養(yǎng)平板上呈現(xiàn)黃色、圓形、不透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)、直徑1.5～3 mm。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌的人工感染結(jié)果

優(yōu)勢(shì)菌F1、F2和F3分別人工感染后，東風(fēng)螺均出現(xiàn)與“翻背癥”相同的癥狀(圖1c)，累計(jì)死亡結(jié)果見(jiàn)表1，半數(shù)致死劑量分別為：7.01×106cfu/g、6.13×106cfu/g、7.43×106cfu/g。

表1 東風(fēng)螺“翻背癥”優(yōu)勢(shì)菌的人工感染結(jié)果

2.4 病原菌的16 S rDNA鑒定

菌株F1、F2、F3及人工感染后分離的優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增16S rDNA獲得大小約1500 bp的片段，產(chǎn)物測(cè)序、比對(duì)后顯示，3株優(yōu)勢(shì)菌及人工感染后分離的優(yōu)勢(shì)菌株與哈維弧菌(Vibrioharveyi)相似度高于99%，可確定病原菌為哈維弧菌。

2.5 病原菌的藥敏分析

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，病原菌對(duì)土霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素等敏感，對(duì)卡那霉素、利福平、新霉素、慶大霉素等中度敏感，對(duì)頭孢氨芐、阿莫西林、青霉素等表現(xiàn)為耐藥。

2.6 患“翻背癥”方斑東風(fēng)螺藥浴的每日存活率

各試驗(yàn)組每日存活率曲線呈現(xiàn)先急劇下降后逐漸平緩的變化趨勢(shì)(圖2)。由圖2可見(jiàn)，前3 d，藥物治療組和對(duì)照組存活率下降都很快，說(shuō)明發(fā)生“翻背癥”的東風(fēng)螺死亡率高且死亡迅速；藥物治療組3 d后的存活率不到60%，而未采取任何藥物治療措施的對(duì)照組存活率約30%，可見(jiàn)若未及時(shí)采取治療措施，損失將十分巨大。

另外，對(duì)照組與大部分藥物治療組在第1 d存活率就存在較大差別，大部分藥物治療組第1 d存活率約70%，而對(duì)照組存活率僅為55.2%，說(shuō)明這些藥物有一定的治療效果，并且用藥越早越好。

2.7 患“翻背癥”方斑東風(fēng)螺藥物治療的最終存活率

從試驗(yàn)各組的最終存活率結(jié)果可知，對(duì)照組東風(fēng)螺的平均存活率不到20%；呋喃西林和諾氟沙星治療的存活率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且不同藥物質(zhì)量濃度的治療效果存在差異，其中以2 mg/L諾氟沙星和3 mg/L呋喃西林效果最佳，平均存活率約40%，兩者治療的最終存活率無(wú)明顯差異(P>0.05)；而復(fù)方磺胺甲惡唑片和苯扎溴銨效果稍差，平均存活率低于35%(圖3)。

圖2 藥浴試驗(yàn)各組的每日存活率變化

圖3 藥浴試驗(yàn)各組最終存活率

3 討 論

3.1 東風(fēng)螺細(xì)菌性病害的病原分析

“翻背癥”與“腫吻癥”是東風(fēng)螺工廠化養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)的細(xì)菌性病害。目前已報(bào)道“腫吻癥”的病原有鰻弧菌生物變種Ⅰ(V.anguillarumBiovar Ⅰ)[6]和哈維弧菌[5,13-14]，同時(shí)該病的發(fā)生、發(fā)展與水體環(huán)境中異養(yǎng)菌的數(shù)量及體內(nèi)條件致病菌的感染程度密切相關(guān)[15]；研究發(fā)現(xiàn)，本次海南萬(wàn)寧地區(qū)東風(fēng)螺“翻背癥”的病原也為哈維弧菌，癥狀與“腫吻癥”存在明顯差異“翻背癥”病螺不出現(xiàn)吻管外伸、腫大、局部發(fā)紅等現(xiàn)象。相同宿主感染哈維弧菌卻表現(xiàn)出不同的癥狀，這可能與宿主生活的環(huán)境、生理狀態(tài)及病原的感染途徑等有關(guān)。

3.2 東風(fēng)螺“翻背癥”的藥物治療效果分析

對(duì)東風(fēng)螺“翻背癥”病原哈維弧菌的藥敏分析顯示，該病菌對(duì)磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)藥物等藥物敏感，這與曾德乾等[16]調(diào)查海南、廣東等地哈維弧菌的抗生素敏感性一致，因此考慮用這些病原菌敏感的藥物進(jìn)行治療試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，諾氟沙星與呋喃西林治療的效果最佳，呋喃西林作為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁藥不能用于治療，而諾氟沙星是一種抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、在養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)代謝快、休藥期短、藥效穩(wěn)定的喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，可用于治療多種常見(jiàn)淡水魚(yú)疾病如細(xì)菌性敗血病、腸炎病、爛鰓病、豎鱗病、白頭白嘴病、打印病、赤皮病等[17-18]，這些都提示在生產(chǎn)上發(fā)生由哈維弧菌引起的東風(fēng)螺“翻背癥”時(shí)可以使用諾氟沙星替代呋喃西林來(lái)治療。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，方斑東風(fēng)螺稚螺對(duì)苯扎溴銨較為敏感，藥物安全質(zhì)量濃度為0.58 mg/L，僅高于生產(chǎn)廠家推薦用量(0.1 mg/L)數(shù)倍[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.1、0.2 mg/L和0.3 mg/L苯扎溴銨的治療存活率分別為29.52%、23.81%和17.14%，即隨著藥物質(zhì)量濃度的升高存活率反而降低，這說(shuō)明與正常東風(fēng)螺相比，發(fā)生“翻背癥”的東風(fēng)螺對(duì)苯扎溴銨更敏感。因此，東風(fēng)螺養(yǎng)殖中尤其是病害發(fā)生時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎使用苯扎溴銨。

3.3 東風(fēng)螺“翻背癥”的防治措施

“翻背癥”爆發(fā)快、傳染性強(qiáng)、死亡率高，給東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)沉重的打擊。針對(duì)其主要病原哈維弧菌的藥敏試驗(yàn)顯示，該病原對(duì)磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)藥物敏感，治療結(jié)果表明，“翻背癥”發(fā)生后3 d內(nèi)東風(fēng)螺死亡率最高，治療效果最佳為呋喃西林和諾氟沙星，發(fā)病群體存活率約40%。因此，發(fā)生“翻背癥”時(shí)可以使用諾氟沙星來(lái)治療。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)這幾種藥物治療“翻背癥”的效果比較有限，推測(cè)其原因可能是：藥物較難透過(guò)螺殼作用于軟體部分；東風(fēng)螺長(zhǎng)時(shí)間在沙層中生活，藥物難以透過(guò)沙層而殺滅環(huán)境中的病原菌；病原菌給東風(fēng)螺軟體造成難以恢復(fù)的損傷，導(dǎo)致其死亡。另外，高質(zhì)量濃度的苯扎溴銨治療效果比低質(zhì)量濃度的差，這說(shuō)明病害發(fā)生時(shí)，濫用藥物是造成東風(fēng)螺死亡嚴(yán)重的重要原因。因此，東風(fēng)螺病害的防治重點(diǎn)還在于預(yù)防。在養(yǎng)殖過(guò)程中可采取各種措施改善養(yǎng)殖條件，提高東風(fēng)螺自身抵抗力水平；及時(shí)清理養(yǎng)殖底沙中的殘餌殘?jiān)ㄆ谙攫B(yǎng)殖底沙，破壞細(xì)菌滋生的溫床；養(yǎng)殖用品消毒，防止交叉感染；與其他養(yǎng)殖動(dòng)植物混養(yǎng)、施加益生菌等，營(yíng)造一個(gè)相對(duì)復(fù)雜而穩(wěn)定的養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)，是預(yù)防東風(fēng)螺“翻背癥”的重要途徑。